一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法

摘要

本发明公开了一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法，属于细胞培养技术领域。该方法是将已提取的骨髓用红细胞裂解液进行处理后分离获得骨髓单个核细胞，清洗后将所得单个核细胞接种到预包被纤维连接蛋白的培养皿中利用完全培养基进行培养，培养一段时间后，利用胰蛋白酶消化细胞后，接种到培养瓶中进行差速贴壁培养和差速消化培养。所用的完全培养基，是在无血清培养基EGM2中添加胎牛血清、血管内皮生长因子、糖皮质激素、维生素C、上表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、集落刺激因子和血小板源性生长因子制成。该方法操作步骤较简单、花费时间短，一次分离数量多，获得细胞传代代次多等特点。

权利要求

1.一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法，其特征在于，将已提取的骨髓用红细胞裂解液进行处理后分离获得骨髓单个核细胞，清洗后将所得的骨髓单个核细胞接种到预包被纤维连接蛋白的培养皿中利用完全培养基进行培养，培养一段时间后，利用胰蛋白酶消化细胞后，接种到培养瓶中进行差速贴壁培养和差速消化培养；

所述完全培养基，是在无血清培养基EGM2中添加10％(V/V)胎牛血清FBS，8～12ng/mL血管内皮生长因子VEGF，0.4‰(V/V)糖皮质激素，1‰(V/V)维生素C，1‰(V/V)上表皮生长因子EGF，5ng/mL碱性成纤维细胞成长因子bFGF，2ng/mL集落刺激因子CSF，1‰(V/V)血小板源性生长因子PDGF。

2.根据权利要求1所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法，其特征在于，步骤如下：

1)在无菌条件下提取小鼠股骨后，利用缓冲溶液将骨髓冲洗下来，获得骨髓原液；

2)按照体积比为骨髓原液：红细胞裂解液＝1:5的比例向步骤1)所得的骨髓原液中加入红细胞裂解液进行处理，处理后获得骨髓单个核细胞溶液；

3)利用缓冲溶液清洗步骤2)所得骨髓单个核细胞溶液三次后，再将所得骨髓单个核细胞接种到预包被纤维连接蛋白的培养皿中利用完全培养基进行37℃恒温培养；

4)待细胞增长至约1×106/孔时，用胰蛋白酶消化细胞，重新接种至25cm的培养瓶中继续培养；

5)将步骤3)所得的细胞进行差速贴壁培养和差速消化培养。

3.根据权利要求2所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法，其特征在于，步骤3)骨髓单个核细胞接种的密度是5×105/孔；所述培养皿的直径为60mm。

4.根据权利要求2所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法，其特征在于，步骤3)所述完全培养基是在无血清培养基中添加10％(V/V)胎牛血清FBS，10ng/mL血管内皮生长因子VEGF，0.4‰(V/V)糖皮质激素，1‰(V/V)维生素C，1‰(V/V)上表皮生长因子EGF，5ng/mL碱性成纤维细胞成长因子bFGF，2ng/mL集落刺激因子CSF，1‰(V/V)血小板源性生长因子PDGF。

5.根据权利要求2所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法，其特征在于，接种在培养皿后的骨髓单个核细胞在37℃的恒温培养箱中进行恒温培养，培养至细胞密度为1×

106/孔后，用胰蛋白酶消化细胞，重新接种至25cm的培养瓶中继续培养。

6.根据权利要求2所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法，其特征在于，所述胰蛋白酶的浓度为0.25％，消化时间为3min。

7.根据权利要求2所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)将小鼠麻醉后，在无菌条件下取小鼠股骨，利用磷酸盐缓冲溶液将骨髓冲洗下来，获得骨髓原液；

2)按照体积比为骨髓原液：红细胞裂解液＝1:5的比例加入红细胞裂解液，室温静置

5min后，在1000rpm下离心5min后弃掉上清液获得骨髓单个核细胞；

3)利用磷酸盐缓冲溶液清洗步骤2)所得骨髓单个核细胞溶液三次后，再将所得骨髓单个核细胞按照5×105/孔的接种密度接种到预包被纤维连接蛋白的完全培养皿中在37℃下进行恒温培养，培养至细胞单个核细胞密度为1×106/孔后，在每个孔中加入1ml的0.25％胰酶消化处理3min，获得胰酶消化细胞；

4)将步骤3)所得的胰酶消化后的细胞转移至培养瓶中进行差速贴壁培养和差速消化培养。

8.权利要求1-7所述任一方法在制备治疗心脑血管疾病、外周血管疾病、肿瘤等疾病和创伤愈合药物中的应用。

说明书

一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术

[0002] 内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)是成熟血管内皮细胞的前体细胞，是Asahara等在1997年首次证明造血系统中存在的具有新生血管潜能的细胞。由于在前期的大量研究中，内皮祖细胞在在心脑血管疾病、外周血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用，可以有效促进缺血心肌内血管形成，改善肢体缺血，对损伤后血管内皮进行修复，因此有关EPC的分离、纯化、扩增及其功能和应用的研究越来越受到关注。然而体内存在的内皮祖细胞数量极少，在骨髓中仅为0.1％，目前获得和扩增EPC的方法操作过程复杂，细胞得率低，价格较为昂贵，极大地限制了其在研究和临床应用方面的发展，因此，本领域急需一种高效的内皮祖细胞培养方法，以获得骨髓中稳定来源的内皮祖细胞来满足进一步实验研究和临床应用的需求。

[0003] 在内皮祖细胞分离提取的过程中，目前的技术手段主要是骨髓经过密度梯度分离，接种于纤维粘连蛋白(fibronectin)铺层的培养皿，或者利用磁珠分选或流式细胞仪分选的方式，利用一些细胞表面粘附分子如CD34、KDR、CD133等进行分选后，获得细胞再利用上述培养液进行培养扩增。然而由于血小板表面表达的粘附分子能够被单核细胞吞噬假表达于某些不能向内皮细胞分化的单核细胞上，从而使利用这些粘附分子进行分选的细胞不能向内皮细胞分化，而通过淋巴细胞密度梯度分离的方法也过于复杂，成本相对较高。

[0004] 在内皮祖细胞培养过程中，培养基的选择十分重要，目前的培养基有以下几种：

[0005] M199+10％FBS+VEGF+bFGF+CSF；

[0006] DMEM+20％FBS+bFGF；

[0007] DMEM-HG+10％FBS+VEGF+bFGF；

[0008] DMEM+CSF+FGF+10％FBS；

[0009] 1640培养基+bFGF+VEGF+10％FBS；

[0010] EGM2+5％FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+VEGF+IGF+FGF；

[0011] 但是这几种培养基分别有各自的缺陷，例如基础培养基选择的不合理、血清比例不合适、刺激因子的选择及加入比例的不恰当，这些缺陷导致内皮祖细胞培养时状态差，获得细胞量少，传代次数低，复苏后细胞活率低等特点。因此，在科学研究及临床应用中，急需一种高效稳定的培养基提高内皮祖细胞的培养效率。

发明内容

[0012] 为解决内皮祖细胞培养过程中传代代次偏低、培养成本偏高、培养效率低的技术问题，本发明提供了一种骨髓来源的内皮祖细胞的培养方法，所采取的技术方案如下：

[0013] 一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法，该方法是将已提取的骨髓用红细胞裂解液进行处理后分离获得骨髓单个核细胞，清洗后将所得的骨髓单个核细胞接种到预包被纤维连接蛋白的培养皿中利用完全培养基进行培养，培养一段时间后，利用胰蛋白酶消化细胞后，接种到培养瓶中进行差速贴壁培养和差速消化培养；

[0014] 所述完全培养基，是在无血清培养基EGM2中添加胎牛血清、血管内皮生长因子、糖皮质激素、维生素C、上表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，集落刺激因子和血小板源性生长因子后制成。

[0015] 优选地，所述完全培养基是在无血清培养基中添加10％(V/V)胎牛血清FBS，8～12ng/mL血管内皮生长因子VEGF，0.4‰(V/V)糖皮质激素，1‰(V/V)维生素C，1‰(V/V)上表皮生长因子EGF，5ng/mL碱性成纤维细胞成长因子bFGF，2ng/mL集落刺激因子CSF，1‰(V/V)血小板源性生长因子PDGF。

[0016] 所述内皮祖细胞培养方法的步骤如下：

[0017] 1)在无菌条件下提取小鼠股骨后，利用缓冲溶液将骨髓冲洗下来，获得骨髓原液；

[0018] 2)按照体积比为骨髓原液：红细胞裂解液＝1:5的比例向步骤1)所得的骨髓原液中加入红细胞裂解液进行处理，处理后获得骨髓单个核细胞溶液；

[0019] 3)利用缓冲溶液清洗步骤2)所得骨髓单个核细胞溶液三次后，再将所得骨髓单个核细胞接种到预包被纤维连接蛋白的培养皿中利用完全培养基进行37℃恒温培养；

[0020] 4)待细胞增长至1×106/孔时，用胰蛋白酶消化细胞，重新接种至25cm的培养瓶中继续培养；

[0021] 5)将步骤3)所得的细胞进行差速贴壁培养和差速消化培养。

[0022] 优选地，步骤3)骨髓单个核细胞接种的密度是5×105/孔；所述培养皿的直径为60mm。

[0023] 优选地，步骤3)所述完全培养基是在无血清培养基中添加10％(V/V)胎牛血清FBS，10ng/mL血管内皮生长因子VEGF，0.4‰(V/V)糖皮质激素，1‰(V/V)维生素C，1‰(V/V)上表皮生长因子EGF，5ng/mL碱性成纤维细胞成长因子bFGF，2ng/mL集落刺激因子CSF，1‰(V/V)血小板源性生长因子PDGF。

[0024] 优选地，接种在培养皿后的骨髓单个核细胞在37℃的恒温培养箱中进行恒温培养，培养至细胞密度为1×106/孔后，用胰蛋白酶消化细胞，重新接种至25cm的培养瓶中继续培养。

[0025] 更优选地，所述胰蛋白酶的浓度为0.25％，消化时间为3min。

[0026] 所述方法的具体步骤如下：

[0027] 1)将小鼠麻醉后，在无菌条件下取小鼠股骨，利用磷酸盐缓冲溶液将骨髓冲洗下来，获得骨髓原液；

[0028] 2)按照体积比为骨髓原液：红细胞裂解液＝1:5的比例加入红细胞裂解液，室温静置5min后，在1000rpm下离心5min后弃掉上清液获得骨髓单个核细胞；

[0029] 3)利用磷酸盐缓冲溶液清洗步骤2)所得骨髓单个核细胞溶液三次后，再将所得骨髓单个核细胞按照5×105/孔的接种密度接种到预包被纤维连接蛋白的完全培养皿中在37℃下进行恒温培养，培养至细胞单个核细胞密度为1×106/孔后，在每个孔中加入1ml的0.25％胰酶消化处理3min，获得胰酶消化细胞；

[0030] 4)将步骤3)所得的胰酶消化后的细胞转移至培养瓶中进行差速贴壁培养和差速消化培养。

[0031] 以上所述任一方法可在制备治疗心脑血管疾病、外周血管疾病、肿瘤等疾病和创伤愈合药物中的应用。

[0032] 与现有技术相比，本发明获得的有益效果：

[0033] 本发明所提供的方法可以简单快速低成本的分离出骨髓中的单个核细胞而不影响内皮祖细胞的培养效率，使用新型完全培养基培养后的内皮祖细胞从细胞数量、细胞活率、细胞传代代次，冻存细胞复苏后的活率上都有显著提高。本发明降低了内皮祖细胞的培养成本，极大程度上提高了内皮祖细胞的培养效率，解决了获得和扩增EPC的方法操作过程复杂，细胞得率低，价格较为昂贵的问题。

[0034] 本发明为解决获取骨髓来源的内皮祖细胞培养效率较低、成本较高、内皮祖细胞培养方法低效不稳定等技术问题，本发明提供了一种能够高效稳定培养内皮祖细胞的完全培养基及细胞获取方法。本发明在从小鼠骨髓中分离单个核细胞时采取了红细胞裂解法而非传统的淋巴细胞分离法，该方法操作步骤较简单、花费时间短，一次分离较多数量的单个核细胞。在内皮祖细胞培养方面，本发明提供了新的培养基配方，使培养效率显著提高，细胞数量及活性增强，传代代次提高。

[0035] 红细胞裂解液为一种比较温和的红细胞去除试剂，主要是用来裂解组织或提取液中的红细胞。发明人在研究过程中偶然发现利用红细胞裂解液提取骨髓组织中骨髓单个核细胞在提取效果上比并不弱于现有常用的淋巴细胞分离液，但却可以大大减少实验成本上以及操作时间。采用红细胞裂解液进行提取只需一步离心即可，不需要提取白膜层细胞，对细胞的损伤非常小。

[0036] 同时，发明人偶然发现经将血小板源性生长因子PDGF添加培养基中能够有效提高骨髓来源的内皮祖细胞的传代代次。而在本申请之前，血小板源性生长因子PDGF不是用于培养内皮祖细胞的细胞细胞培养因子。

附图说明

[0037] 图1为利用本发明方法培养的内皮祖细胞P10代培养效果图。

[0038] 图2为P5代细胞在不同培养基培养条件下的细胞数量的对比图；

[0039] (a，为现有公认效果最好的EGM2+5％FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+VEGF+IGF+FGF培养基；b，为本发明所用培养基)。

[0040] 图3为P5代细胞在不同培养基培养条件下内皮祖细胞表达CD34含量对比图；

[0041] (a，为现有公认效果最好的EGM2+5％FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+VEGF+IGF+FGF；b，为本发明所用培养基)。

[0042] 图4为P5代细胞在不同培养基培养条件下内皮祖细胞表达VEGF-2含量对比图；

[0043] (a，为现有公认效果最好的EGM2+5％FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+VEGF+IGF+FGF；b，为本发明所用培养基)。

具体实施方式

[0044] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

[0045] 以下实施例所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、仪器和方法，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

[0046] 实施例1

[0047] 1.完全培养基的配置

[0048] 完全培养基是在血清培养基EGM2中加入：10％(V/V)胎牛血清(FBS)，10ng/mL血管内皮生长因子VEGF，0.4‰(V/V)糖皮质激素，1‰(V/V)维生素C，1‰(V/V)上表皮生长因素EGF，5ng/mL碱性成纤维细胞生长因子bFGF，2ng/mL集落刺激因子(CSF)，1‰(V/V)血小板源性生长因子PDGF。

[0049] 2.小鼠骨髓单个核细胞的分离与培养

[0050] 将实验动物用10％水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉。无菌条件下取小鼠股骨，使用PBS迅速将骨髓完全冲洗到离心管中，吹打均匀后按照1∶5比例缓慢加入红细胞裂解液。在1000rpm下离心5min后分离得到骨髓单个核细胞。用PBS洗3次后将单个核细胞以5×105/孔的密度，接种于预包被纤维连接蛋白的6孔培养皿中，放入37℃恒温培养箱中培6 2
养。待细胞增长至约1×10/孔时，用胰蛋白酶消化细胞，重新接种至25cm 培养瓶内继续培养。

[0051] 3.内皮祖细胞的差速贴壁培养

[0052] 培养24h后，轻轻冲洗整个培养皿，将未贴壁细胞重新接种于另一块预包被纤维连接蛋白的6孔板中。3天后换液，弃去未贴壁细胞，以后每两天换液。待集落广泛形成后进行消化，传代。每天观察细胞的形态。

[0053] 4.差速消化培养

[0054] 准备好待消化的细胞，弃去培养液。用PBS洗一遍后，加入0.25％胰蛋白酶，轻轻震荡，3min后终止消化，更换新的培养液。

[0055] 经观察，培养获得的细胞可传10代，且传过10代的细胞数量较多(见图1)。

[0056] 实施例2

[0057] 本实施例提供了一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法，该方法与实施例1的区别在于：所用培养基中的组成为：EGM2+5％FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+VEGF+IGF+FGF。具体是在EGM2培养基中添加5％(v/v)胎牛血清FBS、10ng/mL的Hydrocortisone(即糖皮质激素)、0.4‰(V/V)的Ascorbic Acid、2‰的EGF、2ng/mL的VEGF、5ng/mL的IGF、1‰(V/V)的FGF。利用该培养方法培养，所得内皮祖细胞共传6代，6代后细胞状态较差，细胞生长十分缓慢。

[0058] 实施例3

[0059] 本实施例提供了一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法，该方法与实施例1的区别在于：所用培养基中没有添加集落刺激因子CSF。利用该培养方法培养，所得内皮祖细胞共传6代代，6代后细胞状态较差，传代速度缓慢，漂浮死细胞较多。

[0060] 实施例4

[0061] 本实施例提供了一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法，该方法与实施例1的区别在于：没有使用1‰(V/V)血小板源性生长因子PDGF。利用该培养方法培养，所得的内皮祖细胞共传代7代。

[0062] 实施例5

[0063] 本实施例提供了一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法，该方法与实施例1的区别在于：

[0064] 使用常规的淋巴细胞分离液代替红细胞裂解液进行骨髓单个核细胞的分离，具体操作过程是：

[0065] (1)将ACD抗凝骨髓液用0.01mol/LPBS液等体积稀释、混匀。

[0066] (2)取10ml无菌的离心管，加入比重为1.077mol/ml的淋巴细胞分离液3～4ml，将稀释后的骨髓在离液面约1cm处缓慢滴加，使形成一明显分界面，上下液面勿混合。

[0067] (3)在水平离心机中以2000转/min的转速，离心40分钟。

[0068] (4)小心吸取中间的白膜层，用7～10倍体积的0.01mol/L PBS液稀释，1000转/min，离心10分钟，洗涤2～3次。

[0069] 经统计，用淋巴细胞分离液提取耗时2小时左右，而使用红细胞裂解液耗时仅需30min，操作时间减少75％以上。同时，在提取薄膜曾细胞及分离室对细胞的损失较大，且淋巴细胞分离液价格要远比红细胞裂解液昂贵，试验成本更高。

[0070] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。