一种携带Pim-1基因的腺相关病毒2及其在修复受损视神经中的应用

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，视神经损伤后视网膜神经节细胞的内在再生能力低下，是视功能难以恢复的关键因素，如何有效治疗一直是临床医学面临的重大难题。本发明提供了一种携带Pim‑1基因的重组腺相关病毒2载体及其构建方法，所述的腺相关病毒2载体是携带如SEQ ID NO:1所示的Pim‑1基因的DNA序列。本发明还提供携带Pim‑1基因的重组腺相关病毒2载体在制备治疗修复受损视神经药物中的应用。本发明为临床治疗视神经损伤提供新的有力手段和理论基础，对CNS疾病和损伤的治疗也有着重要意义。

权利要求

1.一种携带Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体，其特征在于，所述的腺相关病毒2载体携带如SEQ ID NO:1所示的Pim-1基因的DNA；所述的腺相关病毒2载体选用AAV三质粒系统，由AAV载体pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-MCS-3FLAG、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper组成；

目的基因Pim-1由CAGMINI启动子启动；Pim-1基因插入载体MCS多克隆酶切位点，Pim-1的C端带3×Flag标签蛋白。

2.一种如权利要求1所述的携带Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A）Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体的克隆构建设计并合成PCR引物如下：Pim-1-正向引物如SEQ ID NO:2所示；Pim-1-反向引物中SEQ ID NO:3所示；

使用PCR方法从含有如SEQ ID NO:1所示的Pim-1基因cDNA克隆模板进行Pim-1目的基因扩增；将pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-MCS-3FLAG载体及Pim-1基因PCR产物均使用Nhel酶切载体，酶切完全后进行酶切产物的纯化，将酶切后的腺相关病毒载体和Pim-1基因PCR产物进行连接反应，通过连接反应将上述酶切片段准确连接到pAOV表达载体的NheI位点上，获得pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-Pim-1-3FLAG表达载体，得到连接产物后，将产物转化到感受态大肠杆菌中，对生长出的转化子进行Pim-1基因腺相关病毒2质粒的克隆鉴定，电泳结果阳性的为阳性克隆，证明目的基因已经定向连入目的载体；再对PCR鉴定阳性的克隆进行生物测序和分析比对，若序列与数据库中的GenBank ID: NM_017034序列相一致，比对正确，说明质粒构建成功；将构建好的带有荧光蛋白eGFP表达质粒通过超纯去内毒素试剂盒抽提，通过转染试剂lipo2000转染293T细胞，24小时后通过荧光显微镜观察到细胞被转染为绿色荧光，即为Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体转染表达成功；

B）Pim-1基因的重组腺相关病毒2包装

腺相关病毒包装系统采用三质粒系统，将包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper，与Pim-1基因的重组腺相关病毒2表达质粒pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-Pim-1-3FLAG通过转染试剂lipo2000共转染293T细胞，转染前，AAV-293细胞融合度需达到80%以上，转染72h后，将细胞离心收集，然后将细胞裂解，4℃ 53,000rmp高速离心30h后，收集富含重组腺相关病毒2颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的重组腺相关病毒2的浓缩液，在浓缩液中加入甘油，终浓度为5%，分装后，-80℃保存，最后使用定量PCR测定病毒滴度。

3.一种如权利要求1所述的携带Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体在制备治疗修复受损视神经药物中的应用。

说明书

一种携带Pim-1基因的腺相关病毒2及其在修复受损视神经中

的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，是一种携带Pim-1基因的腺相关病毒2在制备治疗修复受损视神经药物中的应用。

背景技术

[0002] 中枢神经系统(CNS)疾病和损伤后，神经再生是非常困难的，如何进行有效治疗一直是临床治疗所困扰的重大难题。视神经为CNS的一部分。视神经损伤后，轴突再生困难的主要原因包括视网膜神经节细胞(RGCs)大量死亡、RGCs内在再生能力低下、引导轴突再生的细胞缺乏、抑制再生的微环境、神经营养因子的不足等。视神经损伤后RGCs的内在再生能力低下，是视神经损伤后再生失败导致视神经萎缩和失明的关键因素。目前，虽然临床上针对受损视神经的治疗开展了大量工作，但其实际疗效不佳，很难让患者恢复视力。

[0003] 近期关于提高RGCs内在再生能力的研究成果层出不穷：Benowitz研究组通过针刺伤晶状体，玻璃体腔内注射晶体蛋白，激活RGCs的内在再生潜力，使轴突的再生通过视神经压榨伤部位到达远段神经，但数量和生长潜能有限(参见文献[1]de Lima S,Koriyama Y,Kurimoto T,et al.Fulllength axon regeneration in the adult mouse optic nerve and partial recovery of simple visual behaviors.Proc Nat Acad Sci U S A,2012；109(23):9149-54)。O‘Donovan等通过激活RAF-MEK通路的B-Raf，特别是联合敲除PTEN，同时有效地促进了大鼠视神经损伤后的再生(参见文献[2]O'Donovan KJ,Ma K,Guo H,et al.B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS.J Exp Med,2014；211(5):801-14)。Yungher等小鼠玻璃体注射PTEN-shRNA、CNTF的腺相关病毒2及cAMP类似物，再生轴突远达视交叉和视交叉上核并形成突触(参见文献[3]Yungher BJ,Luo X,Salgueiro Y,Blackmore MG,et al.Viral vector-based improvement of optic nerve regeneration:
characterization of individual axons’growth patterns and synaptogenesis in a visual target.Gene Therapy,2015；22:811-821)。Nawabi等向PTEN敲除小鼠玻璃体注射DCLKs的腺相关病毒2，轴突再生远达视交叉(参见文献[4]Nawabi H,Belin S,Cartoni R,et al.Doublecortin-like kinases promote neuronal survival and induce growth cone reformation via distinct mechanisms.Neuron,2015；88:704-719.)。由上可见，寻找调节再生的靶分子和基因，并将增强RGCs内在再生能力和影响再生的因素相结合，促进视神经再生，具有光明的临床前景。

[0004] 莫洛尼小鼠白血病病毒前病毒整合位点(provirus integration site for Moloney murine leukemia virus,Pim-1)为原癌基因，表达丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于钙-钙调蛋白调节激酶。它表达的激酶广泛存在于各组织细胞中，如胸腺、骨髓、结肠、睾丸、前列腺、心血管、大脑皮质、海马和视网膜等，Pim-1是许多细胞因子或生长因子(包括IL-2，GCSF，EGFR，HGF等)信号通路(包括JAK-STAT，AKT，MAPK，NF-kB等)的共同下游效应分子,并磷酸化特异性底物，参与细胞增殖、分化、存活等(参考文献[5]Mondello P,Cuzzocrea S,Mian M.Pim kinases in hematological malignancies:where are we now and where are we going？J Hemat Oncol,2014；7:95)。

[0005] Pim-1能参与血管形成(参见文献[6]Zippo A,De Robertis A,Bardelli M,et al.Identification of Flk-1target genes in vasculogenesis:Pim-1is required for endothelial and mural cell differentiation in vitro.Blood,2004；103:4536-4544；参见文献[7]Walpen T,Peier M,Haas E,et al.Loss of pim1imposes a hyperadhesive phenotype on endothelial cells.Cell Physiol Biochem,2012,30(4):1083-96)、促进血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和存活(参见文献[8]Willert M,Augstein A,Poitz D M,et al.Transcriptional regulation of Pim-1kinase in vascular smooth muscle cells and its role for proliferation.Basic Res Cardiol,2010,105(2):267-77；参见文献[9]Meloche J,Paulin R,Courboulin A,et al.RAGE-dependent activation of the oncoprotein Pim1plays a critical role in systemic vascular remodeling processes.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(9):2114-24；参见文献[10]Chen J,Yin H,Jiang Y,et al.Induction of microRNA-1by myocardin in smooth muscle cells inhibits cell proliferation.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31:368-
375；参见文献[11]Paulin R,Courboulin A,Meloche J,et al.Signal transducers and activators of transcription-3/pim1axis plays a critical role in the pathogenesis of human pulmonary arterial hypertension.Circulation,2011,123(11):1205-15；参见文献[12]Paulin  R,Meloche  J,Jacob  MH,et 
al.Dehydroepiandrosterone inhibits the Src/STAT3constitutive activation in pulmonary arterial hypertension.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2011,301:
H1798-H1809)及心脏祖细胞(CPCs)增殖存活并延缓其衰老(参见文献[13]Hu S,Yan G,Xu H,et al.Hypoxic preconditioning increases survival of cardiac progenitor cells via the Pim-1kinase-mediated anti-apoptotic effect.Cir J,2014,78(3):
724-731；参见文献[14]Samse K,Emathinger J,Hariharan N,et al.Functional effect of Pim1depends upon intracellular localization in human cardiac progenitor cells.J Biol Chem,2015,290(22):13935-47；参见文献[15]Cottage CT,Bailey B,Fischer KM,et al.Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-
1kinase.Circ Res,2010,106(5):891-901)、促进CPCs分化(参见文献[16]Iwakura T,MohritT,Hamatani T,et al.STAT3/Pim-1signaling pathway plays a crucial role in endothelial differentiation of cardiac resident Sca-1+ cells both in vitro and in vivo.J Mol Cell Cardiol,2011,51(2):207-14；参见文献[17]Tufan H,Zhang XH,Haghshenas N,et al.Cardiac progenitor cells engineered with Pim-1(CPCeP)develop cardiac phenotypic electrophysiological properties as they are co-cultured with neonatal myocytes.J Mol Cell Cardiol,2012,53(5):695-706)、保护受损心肌(参见文献[18]Muraski JA,Rota  M,Misao Y,et al.Pim-1regulates cardiomyocyte survival downstream of Akt.Nat Med,2007,13(12):1467-75；[19]Stumpner J,Smul TM,Redel A,et al.Desflurane-induced and ischaemic postconditioning against myocardial infarction are mediated by Pim-
1kinase.Acta Anaesthesiol Scand,2012,56(7):904-13；[20]Din S,Mason M,Volkers M,et al.Pim-1preserves mitochondrial morphology by inhibiting dynamin-related protein 1translocation.Proc Natl Acad Sci,2013,110(15):5969-74)。

[0006] 神经系统中，Pim-1存在于胚胎小鼠枕叶视觉皮质、嗅皮质、纹状体和视网膜及胚胎斑马鱼视网膜中,并能促进上述神经结构的发育(参见文献[21]Eichmann A,Yuan L,Breant C,et al.Developmental expression of pim kinases suggests functions also outside of the hematopoietic system.Oncogene,2000,19(9):1215-24；[22]Yin J,Shine L,Raycroft F,et al.Inhibition of the Pim1oncogene results in diminished visual function.PLoS One,2012,7(12):e52177)。大鼠梨状叶皮质、海马结构、纹状体、背侧丘脑表达Pim-1 mRNA及蛋白，癫痫发作、长时程增强分别能诱导上述区域Pim-1 mRNA高表达(参考文献[23]Feldman JD,Vician L,Crispino M,et al.KID-1,a protein kinase induced by depolarization in brain.J Biol Chem,1998,273(26):16535-43；[24]Konietzko U,Kauselmann G,Scafidi J,et al.Pim kinase expression is induced by LTP stimulation and required for the consolidation of enduring LTP.Embo J,1999,18(12):3359-69；[25]Feldman JD,Vician L,Crispino M,et al.Seizure activity induces PIM-1expression in brain.J Neurosci Res,1998,53(4):502-9),大鼠神经细胞系PC12细胞中,PC12细胞接受KCl和腺苷酸环化酶激活剂毛喉素(Fk)诱导处理后，Pim-1蛋白在1h后上升，2-4h达到高峰，6h后恢复正常水平(参考文献[26]Liu W,Feldmann JD,Machado HB,et al.Expression of depolarization-induced immediate early gene proteins in PC12cells.J Neurosci Res,2003,72(6):670-8),体外研究表明，Pim-1促进了PC12细胞儿茶酚胺类如多巴胺、去甲肾上腺素和IL-6的释放(参考文献[27]Glazova M,Aho TL,Palmetshofer A,et al.Pim-1kinase enhances NFATc activity and neuroendocrine functions in PC12cells.Brain Res Mol Brain Res,
2005,138(2):116-23)。综上提示Pim-1参与了神经元的去极化和可塑性调节及递质的释放。在体外培养的小鼠大脑皮质神经元中，Pim-1介导了小鼠大脑皮质神经元DNA损伤后经由NF-kB和Cdc25A引起的死亡(参见文献[28]Zhang Y,Parsanejad M,Huang E,et al.Pim-
1kinase as activator of the cell cycle pathway in neuronal death induced by DNA damage.J Neurochem,2010,112(2):497-510)，大鼠急性脑缺血后早期(12-72h)及新生大鼠脑缺氧性缺血中，脑内Pim-1 mRNA及蛋白表达上调，参与了大鼠脑缺血后粒细胞集落刺激因子的抗神经元凋亡和促神经元存活的过程(参见文献[29]Solaroglu I,Tsubokawa T,Cahill J,et al.Anti-apoptotic effect of granulocyte-colony stimulating factor after focal cerebral ischemia in the rat.Neuroscience,
2006,143(4):965-74；[30]Yata K,Matchett GA,Tsubokawa T,et al.Granulocyte-colony stimulating factor inhibits apoptotic neuron loss after neonatal hypoxia-ischemia in rats.Brain Res,2007,1145:227-38)。这些提示Pim-1参与了受损神经元的存活和凋亡。

[0007] 结合上述Pim-1的相关作用，特别是其与视觉发育的密切关系和视神经损伤后视网膜基因表达变化(见实施例2)，提示Pim-1可能是影响RGC内在再生能力的关键分子，故假设相比于调节上述通路如JAK-STAT，AKT，MAPK中的单一分子表达，调节以Pim-1为靶的基因表达，可能起到“以一抵十”的效果，可更有效地增强受损RGC内在再生能力。

[0008] 目前Pim-1的研究多集中在肿瘤、心肌保护和再生方面，在神经系统中的研究尚少，尚未见Pim-1基因与修复受损视神经的相关研究，也未见有文献报道构建一种携带Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体来治疗受损视神经及其他 神经损伤。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于提供一种携带Pim-1基因的腺相关病毒2，其构建方法，及其在制备治疗修复受损视神经药物中的应用。

[0010] 本发明在SD大鼠球后2mm处采用临时脑动脉瘤夹夹伤5s，以制作大鼠视神经压榨伤模型。

[0011] 本发明在大鼠视网膜的基因芯片及Real-time PCR的检测中发现在正常新生大鼠视网膜中，Pim-1 mRNA表达水平显著高于正常成年大鼠，约为1.93倍；视神经损伤后3天，视网膜内的Pim-1 mRNA表达上调，为正常成年鼠的1.53倍，到14天降至正常水平以下。Western Blot结果显示，正常新生大鼠视网膜中，Pim-1蛋白表达水平明显高于正常成年大鼠，约为正常成年大鼠的3.24倍；而成年大鼠视神经损伤后3天，视网膜内的Pim-1蛋白表达上调，约为正常成年大鼠的1.98倍，到7天就降至正常水平以下，21天仍较正常水平低。免疫组化结果表明，视神经损伤后的1d和3d，视网膜节细胞层Pim-1的表达明显增加，之后逐渐下调。结合上述Pim-1的相关作用，特别是其与视觉发育的密切关系和及其基因在视神经损伤后视网膜表达的变化，以及新生鼠视网膜节细胞的内在生长能力强，提示在视神经损伤后早期行Pim-1重组腺相关病毒2过表达治疗可能会促进受损视网膜节细胞的存活和视神经的再生。

[0012] 本发明的技术方案，主要是构建Pim-1的重组腺相关病毒2载体，并在成年SD大鼠视神经压榨伤模型中，玻璃体腔注射Pim-1的重组腺相关病毒2载体转染大鼠视网膜，体内观察并探讨靶向Pim-1基因治疗修复受损视神经的作用。

[0013] 为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供一种携带Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体，所述的腺相关病毒2载体是携带如SEQ ID NO:1所示的Pim-1基因的DNA序列。

[0014] 所述的腺相关病毒2载体选用AAV三质粒系统，由AAV载体pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-MCS-3FLAG、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper组成；目的基因Pim-1由CAGMINI启动子启动；Pim-1基因插入载体MCS多克隆酶切位点，Pim-1的C端带3×Flag标签蛋白。

[0015] 本发明的第二方面，提供上述的携带Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体 的构建方法，具体包括以下步骤：

[0016] 1.Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体的克隆构建

[0017] 根据Pim-1基因(GenBank ID:NM017034)设计并合成如下PCR引物：

[0018] Pim-1上游引物：5’-CATGGTCCTG CTGGAGTTCG TG-3’

[0019] (SEQ ID NO:2)；

[0020] Pim-1下游引物：5’-CATAGCGTAA AAGGAGCAAC A-3’

[0021] (SEQ ID NO:3)；

[0022] 使用PCR方法从含有如SEQ ID NO:1所示的Pim-1基因cDNA克隆模板进行Pim-1目的基因扩增；将pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-MCS-3FLAG载体及Pim-1基因PCR产物均使用Nhel酶切载体，酶切完全后进行酶切产物的纯化，将酶切后的腺相关病毒载体和Pim-1基因PCR产物进行连接反应，通过连接反应将上述酶切片段准确连接到pAOV表达载体的NheI位点上，获得pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-Pim-1-3FLAG表达载体，得到连接产物后，将产物转化到感受态大肠杆菌中，对生长出的转化子进行Pim-1基因腺相关病毒2质粒的克隆鉴定，电泳结果阳性的为阳性克隆，证明目的基因已经定向连入目的载体；再对PCR鉴定阳性的克隆进行生物测序和分析比对，序列与数据库中的GenBank ID:NM_017034序列相一致，比对正确，说明质粒构建成功；将构建好的带有荧光蛋白eGFP表达质粒通过超纯去内毒素试剂盒抽提，通过转染试剂lipo2000转染293T细胞，24小时后通过荧光显微镜观察到细胞被转染为绿色荧光，即为Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体转染表达成功。

[0023] 2.Pim-1基因的重组腺相关病毒2包装

[0024] 腺相关病毒包装系统采用三质粒系统，将包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper，与Pim-1基因的重组腺相关病毒2表达质粒pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-Pim-1-3FLAG通过转染试剂lipo2000共转染293T细胞，转染前，AAV-293细胞融合度需达到80％以上，转染72h后，将细胞离心收集，然后将细胞裂解，4℃53,000rmp高速离心30h后，收集富含重组腺相关病毒2颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的重组腺相关病毒2的浓缩液，分装后，-80℃保存，最后使用定量PCR测定病毒滴度。

[0025] 体内外实验对腺相关病毒滴度的要求不同，生产过程中根据需求可得到不同滴度的腺相关病毒颗粒，用于相应的实验。

[0026] 本发明的第三方面，提供上述的携带Pim-1基因的腺相关病毒2载体在制备治疗修复受损视神经药物中的应用。

[0027] 用本发明构建的携带Pim-1基因的腺相关病毒2载体治疗受损视神经。首先采用Pim-1基因的腺相关病毒2载体转染大鼠视网膜，再应用临时动脉瘤夹制备视神经不完全损伤模型，观察Pim-1基因过表达后对受损视神经修复的作用及机制。

[0028] 携带Pim-1基因的腺相关病毒2载体在制备治疗修复受损视神经药物中的应用，Pim-1基因的腺相关病毒2可转染RGCs，临床上，具体可采用玻璃体腔注射该药物转染RGCs以进行视神经损伤后的基因治疗。

[0029] 腺相关病毒载体AAV是一种无被膜的单链线状缺损型DNA病毒，AAV的DNA能以dsDNA的形式低频整合入宿主的染色体中，AAV载体具有潜伏状态稳定、宿主范围广、转染效率高、表达时间长、免疫反应弱等特点，因此被认为是目前最安全的用于在体实验的病毒载体，尤其适用于眼组织实验。现在已经有100多种AAV分型，设计成重组病毒载体的有12种，其中AAV2型血清型腺相关病毒因在眼组织中具备较强的转染性和特异性，成为治疗视神经损伤最常用的血清性载体。本课题组前期以携带Neuritin基因的腺相关病毒2载体治疗受损视神经，在RGCs的转染率可高达70％，并取得良好的治疗效果。

[0030] 本发明基于Pim-1在胸腺、骨髓、结肠、睾丸、前列腺、心血管、大脑皮质、海马和视网膜等组织中的独特作用，用携带Pim-1基因的腺相关病毒2(AAV2)载体，靶向Pim-1基因过表达增强RGCs内在再生能力，修复受损视神经，观察其对RGCs的存活及凋亡、视神经轴突再生和视觉功能恢复等的作用。

[0031] 视神经是中枢神经系统(CNS)的一部分，因而常作为研究CNS损伤和再生的理想部位。故研究视神经损伤后的修复与再生，将为临床治疗视神经损伤提供新的有力手段和理论基础，对CNS疾病和损伤的治疗也有着重要意义。

附图说明

[0032] 图1是大鼠视神经不完全损伤模型的制备

[0033] A为成年雄性SD大鼠视神经眼球后2mm处，用临时迷你脑动脉瘤夹夹伤5秒以制作压榨伤模型。B为RITC标记的损伤2周的视神经，左侧箭头所指处为损伤区，其轴突聚成团块，右侧方框所指为远侧端，放大后C图可见有 视神经轴突通过，提示为不完全损伤模型，标尺＝100μm。

[0034] 图2是腺相关病毒AAV2-Pim-1-eGFP转染大鼠RGCs

[0035] 大鼠玻璃体腔注射AAV2-Pim-1-eGFP后4周，行视网膜铺片。其中A显示视网膜大部分细胞和神经纤维转染上重组腺相关病毒2，表达绿色荧光，转染效率达50％。B显示AAV2-Pim-1-eGFP成功转染RGCs且转染率达71％。C显示AAV2-Pim-1-eGFP几乎不转染星型胶质细胞。D显示AAV2-Pim-1-eGFP转染一部分无长突细胞。A，B，C标尺＝50μm；D标尺＝15μm。

[0036] 图3是转染后Pim-1在视网膜中的过表达

[0037] A代表Pim-1 mRNA在正常和视神经损伤后各组视网膜中的表达。玻璃体分别注射生理盐水、AAV2-GFP(空载体)和AAV2-Pim-1后4周(取材为正常)，进行视神经压榨伤模型的制作，2周后(取材为损伤)，用Real-time PCR检测Pim-1 mRNA在假手术组、空载体组、治疗组及假手术组、单纯损伤组、空载体组、治疗组中的表达(n＝6，*P<0.05)。B代表Pim-1蛋白在正常和视神经损伤后各组视网膜中的表达。玻璃体分别注射生理盐水、AAV2-GFP和AAV2-Pim-1后4周，进行视神经压榨伤模型的制作，2周后用Western blot检测Pim-1蛋白在正常和视神经损伤后各组视网膜中的表达(n＝6，***P<0.001，**P<0.01)。

[0038] 图4是Pim-1重组腺相关病毒2对视网膜节细胞层细胞的存活作用

[0039] 其中A采用HE染色，观察假手术组、单纯损伤组、空载体组和治疗组视网膜节细胞层细胞的存活情况；B为定量结果(n＝6，**P<0.01)；标尺＝100μm。

[0040] 图5是Pim-1重组腺相关病毒2对RGCs的存活作用

[0041] 其中A采用免疫组化(gamma synuclein特异性标记RGCs)，观察假手术组、单纯损伤组、空载体组和治疗组RGCs的存活情况；B为各组视网膜节细胞层RGCs计数的定量结果(n＝6，**P<0.01)；标尺＝100μm。其中C采用FITC-CTB标记RGCs，各组视网膜铺片，观察从视网膜中央到外周不同位置FITC-CTB标记RGCs的存活情况；D：各组视网膜上RGCs的计数(n＝6，**P<0.01)；标尺＝20μm。

[0042] 图6是Pim-1重组腺相关病毒2对视网膜节细胞层细胞凋亡的影响

[0043] 其中A采用各组眼球石蜡切片的TUNEL染色，观察视网膜节细胞层细胞的凋亡情况，细胞核呈棕黄色为凋亡的细胞(箭头所示)；B为各组视网膜节 细胞层细胞凋亡的计数(n＝6，*P<0.05)；标尺＝100μm。

[0044] 图7是Pim-1重组腺相关病毒2表达质粒载体的构建图。

[0045] 图8是Ⅱ型腺相关病毒eGFP和Pim-1重组腺相关病毒2表达质粒载体的线图。

具体实施方式

[0046] 下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

[0047] 实施例1：

[0048] 1.目的基因片段的获得

[0049] 从GenBank中查询Pim-1基因的序列，用VectorNTI软件设计引物，以Pim-1基因CDS区的cDNA克隆为模板，采用PCR扩增Pim-1基因片段。

[0050] PCR扩增目的基因：使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因，反应体系和条件如下：

[0051] 表1：以Pim-1基因cDNA克隆为模板的扩增体系

[0052]

[0053] 2.Pim-1重组腺相关病毒2表达载体构建

[0054] (1)腺相关病毒2表达载体及目的基因PCR产物的酶切

[0055] 将pAOV-CAGMINI-EGFP-2A-MCS-3FLAG载体(购自Addgene公司)，使用NheI进行酶切，同时将PCR产物使用NheI内切酶进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收载体及目的基因DNA。

[0056] 表2：pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-MCS-3FLAG载体以及Pim-1基因PCR产物酶切反应体系

[0057]

[0058]

[0059] (2)连接反应

[0060] 将酶切后的腺相关病毒2载体和Pim-1基因的PCR产物按照表1中的反应体系进行连接反应。

[0061] 表3：同源重组反应体系

[0062]

[0063] 将载体和目的基因的酶切产物混合，4℃连接12小时，连接产物用于转化。

[0064] (3)酶切产物的连接液转化

[0065] 1)取一感受态细胞置于冰上，待溶解后加入10μl连接液，混匀后在在冰中放置30min。

[0066] 2)置于42℃恒温水浴锅中热敷90s。

[0067] 3)快速将其转移到冰浴中，使细胞冷却2-3min。

[0068] 4)加900μlLB培养液，放置37℃摇床上，1h。

[0069] 5)取恰当量的转化菌液涂布于LB琼脂平板上。

[0070] 6)倒置平皿，于恒温培养箱中37℃，16h。

[0071] (4)Pim-1基因腺相关病毒2质粒阳性克隆鉴定

[0072] 1)挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，从中取1μl做模板进行菌落PCR鉴定。

[0073] 2)PCR反应体系：

[0074] 表4：PCR反应体系

[0075]

[0076] 将上述体系配置好后混匀进行PCR，94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1.5min，30个循环；72℃，10min；4℃，∞。

[0077] 3)1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，根据电泳阳性的结果挑选阳性克隆，委托南京金斯瑞生物测序公司测序，基因大小939bp，如SEQ ID NO:1所示，测序结果表明Pim-1基因号1克隆为鉴定正确的阳性克隆，可进入腺相关病毒2包装的实验流程。

[0078] (5)去内毒素质粒抽提

[0079] 采用Axygen质粒抽提试剂盒提取去内毒素质粒，具体抽提步骤如下：

[0080] 1)过夜培养的5ml菌液用2ml做甘油菌保，剩余3ml分两次于一个1.5ml离心管中12,000×g离心1分钟，彻底去除上清；

[0081] 2)加入250μl细菌悬浮液，振荡器充分重悬细菌，接着加入250μl细菌裂解液，颠倒混匀4－6次；注意：不能剧烈混合，否则会出现基因组DNA污染；

[0082] 3)加入250μl细菌裂解液，五分钟内加入350μl中和液，轻轻颠倒混匀6－8次；12,000×g，离心10分钟；

[0083] 4)将上清转移到小量纯化柱中，小量纯化柱插于废液收集管中，12,000×g离心1分钟；不要吸到沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染；弃收集管中的废液，将小量纯化柱插于收集管中，加700μl细菌裂解液到小量纯化柱中，12,000×g离心1分钟；重复该步骤一遍；弃收集管中的废液，将小量纯化 柱放入同一支收集管中，12,000×g离心1分钟彻底去除细菌裂解液；

[0084] 5)将小量纯化柱放入新的干净的1.5ml离心管中，加50μl 2.5mM Tris-HCl洗脱液，室温放置1分钟后，12,000×g离心1分钟；离心管中的溶液即为所抽提的质粒；

[0085] 6)将抽提质粒用EcorI和XhoI酶切鉴定，确定酶切后片段大小正确，测量质粒浓度，用于腺相关病毒包装。

[0086] 3.Pim-1基因腺相关病2毒包装

[0087] (1)腺相关病毒2载体系统质粒基本信息

[0088] 该病毒包装系统为三质粒系统，由AAV载体pAOV-CAGMINI-EGFP-2A-Pim-1-3FLAG、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper组成(所有质粒均购自Addgene公司)。目的基因Pim-1由CAGMINI启动子启动，具有神经特异性的表达性质。Pim-1基因插入到载体的MCS多克隆位点，基因的C端连接3×Flag。分别包装含目的基因Pim-1的腺相关病毒2，以及不含目的基因Pim-1的对照腺相关病毒2(如图8所示)。

[0089] (2)质粒转染与病毒纯化

[0090] 1)将3×106个AAV-293细胞接种于10cm2细胞培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中培养，48h后用于转染。

[0091] 2)转染前检查传代的AAV-293细胞，融合度达到70％-80％。

[0092] 3)用PH＝7.5的TE缓冲液将质粒的浓度调整到1mg/ml，根据包装盘数计算所需的转染体系和质粒用量，吸取三种质粒各10μl置于离心管中，加入1ml的0.3M CaCl2，轻轻混合。

[0093] 4)将混合后的DNA/CaCl2/HBS溶液滴加到细胞培养盘上，加入时同时轻轻晃动细胞培养盘，使得溶液尽量均一的分布在培养基中，37℃，5％CO2培养箱中培养6h。

[0094] 5)转染结束后，更换新鲜的培养基10ml，继续培养66-72h。

[0095] 6)将产毒的细胞连同培养基收集到15ml的离心管中，200g，3min，离心分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1ml PBS重悬。

[0096] 7)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反复转移，冻融四次。每次冻融后稍加震荡。

[0097] 8)10000g离心去除细胞碎片，将离心上清液转移到一个新离心管中。

[0098] 9)在上清中加入40％PEG8000直到终浓度8％，在冰上放置2h(每15min来回混匀一次)，2500g离心30min，去掉上清液，沉淀用PBS重悬后与细胞裂解上清合并。

[0099] 10)3000g离心30min，将上清转移到另一个离心管中(不要有细胞碎片)。

[0100] 11)加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA，充分混合后在37℃孵育30min，用0.45μm过滤头过滤，取出滤液。

[0101] 12)向病毒浓缩液中添加固体CsCl(密度1.41g/ml)，振荡溶解。

[0102] 13)将样品加入到超速离心管中，用预先配好的CsCl溶液将离心管剩余空间填满。

[0103] 14)175000g离心24h，形成密度梯度，按顺序分布收集不同密度的样品，收集AAV颗粒的组分，重复上述过程一次。

[0104] 15)在Amicon-15超滤装置中加入4ml离子水，将密度梯度离心得到的病毒液加入到超滤装置中，加PBS至总体积为4ml。

[0105] 16)1500g离心5-10min，每5min检查一次剩余体积数，直到最终体积为200-250μl。

[0106] 17)将滤除液收集到一起做消毒处理，滤膜放回到装置中。

[0107] 18)加1×PBS稀释浓缩后的病毒使体积为4ml，重复上述过程3次，离心超滤管，使最终体积大约为0.5ml，取样用于病毒滴度检测。

[0108] 19)病毒液分装后，-80℃保存。

[0109] (3)腺相关病毒2滴度测定

[0110] 使用定量PCR测定病毒滴度：

[0111] 1)梯度稀释标准品质粒和待测样品至原浓度10-5，10-6，10-7，10-8。

[0112] 2)定量PCR的反应体系

[0113] 表5：定量PCR反应体系

[0114]

[0115] 3)在每个反应孔中加入反应液15μl，然后加入5μl的模板。

[0116] 4)上机，退火温度设为60℃，按照标准操作得到Ct值并计算AAV样品中的拷贝数。

[0117] 实施例2：

[0118] 1.大鼠视神经压榨伤模型的建立

[0119] 每组的实验动物常规消毒后，按照每只大鼠10％水合氯醛(0.4ml/100mg)进行腹腔麻醉，麻醉后备皮大鼠的左眼，置于显微镜下进行手术。用显微剪在角膜缘处剪开球结膜，然后用显微镊进行钝性剥离直至球后，操作过程中不要伤及血管和其他组织以免造成出血，充分暴露出视神经，在球后2mm处采用临时动脉瘤夹夹伤5s(具体操作参照本发明人已发表文献[31]Wang R,Xu J,Xie J,et al.Hyperbaric oxygen preconditioning promotes survival of retinal ganglion cells in a rat model of optic nerve crush.J Neurotrauma.2010(27):763-770.)模拟临床造成视神经不完全损伤(如图1所示)。

[0120] 2.实验动物分组

[0121] (1)假手术组：暴露视神经不损伤，玻璃体注射生理盐水；

[0122] (2)单纯损伤组：暴露视神经并损伤，玻璃体注射生理盐水；

[0123] (3)空载体组：损伤视神经，玻璃体注射AAV2-GFP；

[0124] (4)治疗组：损伤视神经，玻璃体注射AAV2-Pim-1；

[0125] 3.Pim-1重组腺相关病毒2转染大鼠视网膜以及转染后Pim-1的过表达[0126] 玻璃体腔注射AAV2-Pim-1 4周后，全身灌注取材，取出眼球后固定于4％多聚甲醛中1天，蔗糖梯度脱水后，行冰冻切片，然后分别与RGCs特异性标记物gamma-synuclein、星型胶质细胞特异性标记物GFAP的免疫荧光染色，发现AAV2-Pim-1转染大部分的RGCs，效率约为70％以上；而几乎不转染星型胶质细胞。玻璃体腔注射AAV2-Pim-1 4周后，全身灌注取材，取出眼球后固定于4％多聚甲醛中，4-6小时后行视网膜铺片，DPAI染核后，荧光显微镜观察，可见AAV2-Pim-1转染视网膜上的大部分细胞和神经纤维，呈绿色荧光；与无长突细胞特异性标记物HPC-1荧光共定位后，观察到AAV2-Pim-1转染一部分的无长突细胞(如图2所示)。

[0127] 采用免疫组织化学、Real-time PCR以及Western blot的方法观察Pim-1腺相关病毒2转染大鼠视网膜后，Pim-1分子、Pim-1 mRNA和Pim-1蛋白在正 常及视神经损伤后各组视网膜中的过表达情况(如图3所示)。

[0128] 4.Pim-1过表达对受损视神经及其RGCs的保护作用

[0129] (1)Pim-1过表达对RGCs层细胞数的影响

[0130] HE染色：将各组的眼球取出经流水过夜，脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片后行HE染色，从形态上观察RGCs层细胞数量。定量结果显示视神经损伤后2周，Pim-1重组腺相关病毒2增加了RGCs层细胞的数量(如图4所示)。

[0131] (2)Pim-1过表达对RGCs的存活作用

[0132] 1)免疫组织化学：各组SD大鼠全身灌注后，取眼球常规石蜡包埋，一抗采用gamma synuclein兔多克隆抗体，另外不加一抗组作为阴性对照。DAB显色观察RGCs存活情况。视神经损伤后2周，Pim-1重组腺相关病毒2对RGCs的存活有促进作用(如图5A、B所示)。

[0133] 2)CTB标记RGCs：各组大鼠取材前2天，玻璃体注射荧光素标记的霍乱毒素B亚单位(CTB)，动物存活2天后，全身灌注取材视网膜后行视网膜铺片，以视乳头为中心呈十字花瓣剪开视杯，剥离出视网膜，将视网膜节细胞层朝上，抗荧光衰减剂封片后置于荧光显微镜下观察并拍照。每个象限取3个视野(20×10)拍照，分别在视网膜的中央、中间和外周，并采用Image-Pro Plus6.0图像处理软件对CTB标记的RGCs进行细胞计数，取平均值。视神经损伤后2周，Pim-1过表达后促进了视网膜的RGCs的存活(如图5C、D所示)。

[0134] (3)Pim-1过表达对RGCs层细胞凋亡情况的检测

[0135] 各组视网膜石蜡切片后行TUNEL染色，细胞核呈棕黄色为凋亡的细胞，观察Pim-1过表达后对RGCs层细胞的凋亡情况，定量结果显示视神经损伤后2周，Pim-1重组腺相关病毒2过表达减少了RGCs层细胞凋亡数，对细胞凋亡有抑制作用(如图6所示)。

[0136] (4)Pim-1重组腺相关病毒2对视神经再生的作用

[0137] 于大鼠玻璃体腔注射罗丹明(RITC)，2天后取材视神经，观察RGCs轴突再生的情况。视神经置于4％PFA，4℃固定过夜，经30％蔗糖脱水沉底。视神经置于已经用冷冻切片机切平的OCT胶上，后用OCT胶包埋，-20℃冻存。于-20℃冷冻切片机中纵向连续切片，厚度为9μm。37℃烤箱烤干，碳酸甘油封片后荧光显微镜下观察RITC示踪轴突的情况。

[0138] 5.Pim-1过表达对视功能恢复的作用

[0139] 1)瞳孔对光反射

[0140] 各组动物(假手术组、单纯损伤组、空载体组、治疗组，n＝6)，损伤后2周，麻醉后，于暗室适应30min后，将未做手术侧眼睛用锡箔纸避光，用一定的光线刺激手术侧眼睛，采用体视显微镜拍照(实验方法参考文献[32]de Lima S,Koriyama Y,Kurimoto T,et al.Full-length axon regeneration in the adult mouse optic nerve and partial recovery of simple visual behaviors.Proc Natl Acad Sci U S A,2012(109):9149-54)。屏幕录像专家软件开始记录左眼瞳孔从最大缩小至最小的时间，并检测每组最小瞳孔的直径和最大瞳孔的直径比，每隔5min重复一次，至少重复5次。

[0141] 2)闪光视觉诱发电位

[0142] 各组动物麻醉后，用直径约为5mm钻头的电钻在右侧的大脑皮质枕叶区先造成颅骨缺损，但不能损伤硬脑膜，随后固定大鼠于脑立体定位仪上，刺激参数设置：波宽为5-10ms，幅度为10v，延时为32s，分别叠加30次，选出稳定的波形，记录视觉诱发电位P波的潜伏期和波幅，检测其闪光视觉诱发电位。具体方法(参见文献[33]Pangratz-Fuehrer S,Kaur K,Ousman SS,et al.Functional rescue of experimental ischemic optic neuropathy with alphaB-crystallin.Eye(Lond),2011(25):809-17)。

[0143] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。