一种家蚕丝素蛋白纳米纤维及其制备方法

摘要

本发明公开一种家蚕丝素蛋白纳米纤维及其制备方法。以家蚕蚕丝为原料，通过溶解再生萃取，得到亲水性家蚕丝素蛋白肽链，再在温和的水相环境中自组装，得到直径为20～500 nm，长度可达1～100μm的纳米纤维。本发明制备家蚕丝素蛋白纳米纤维无需加入任何的添加剂便可自组装得到较长尺寸的纳米纤维，具有工艺简短、条件温和，生产成本低廉的特点，制备得到的纳米纤维可满足实际使用要求。

权利要求

1.一种家蚕丝素蛋白纳米纤维的制备方法，以家蚕蚕丝为原料，脱胶、干燥处理后获得纯丝素蛋白纤维，其特征在于再进行如下步骤：（1）将纯丝素蛋白纤维溶解于浓度为9.3 mol/L的溴化锂溶液中，透析后得到家蚕丝素蛋白溶液，浇注于模具中，在温度为20～25℃、湿度为45～65%的条件下，干燥成型为厚度

0.5～5毫米的丝素蛋白膜；

（2）室温条件下，将丝素蛋白膜置于乙醇中浸泡5～120分钟，获得再结晶的丝素蛋白膜；

（3）按比例1/100～1/10 w/v，将再结晶的丝素蛋白膜浸泡于温度为25～50 ℃的缓冲液中，浸泡时间为0.5～2 h；再经3000～10000转/分钟离心处理，分离获得上清液；

（4）将获得的上清液稀释至0.1～10mg/ml，在恒温水浴环境中进行培养，得到湿态丝素蛋白纳米纤维聚集物；

（5）将湿态丝素蛋白纳米纤维聚集物进行冷冻干燥处理，得到家蚕丝素蛋白纳米纤维。

2.根据权利要求1所述的一种家蚕丝素蛋白纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述的缓冲液为pH＝7.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸或磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为0.01～1 mol/L。

3.根据权利要求1所述的一种家蚕丝素蛋白纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述的恒温水浴环境，温度为25～50 ℃；培养时间为3～8 h。

4.按权利要求1制备方法得到的一种家蚕丝素蛋白纳米纤维，直径为20～500 nm，长度为1～100 μm。

说明书

一种家蚕丝素蛋白纳米纤维及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种纳米纤维，具体涉及一种以家蚕丝素蛋白为原料制备的纳米纤维及其制备方法。

背景技术

[0002] 天然家蚕丝素蛋白纤维因其优异的抗拉强度及延展性能而倍受青睐，广泛用于轻工业、医疗等领域。再生家蚕丝素蛋白因其天然蛋白基材优异的生物相容性、较低的免疫原性、低致敏性、温和的水相加工环境等优势，人们对其在组织修复、药物控释、创面辅料以及美容领域的研究报道已屡见不鲜。然而，无论是再生丝素蛋白膜、多孔支架、凝胶等体系，都难以比拟天然丝素蛋白纤维优异的物理机械性能。再生出的丝素蛋白体系往往都是微观上的各向同性体系，难以满足各向异性化细胞培养以及再生丝素蛋白基材加强的要求。

[0003] 研究发现，天然家蚕丝素蛋白纤维优异的物理机械性能不仅来自于高比例且沿纤维轴向排列的SilkⅡ型结晶结构，也来自于纤维内部由取向排列的Silk Ⅱ型结晶体以及无定型聚集态分子链构成的原纤的取向排列。为此，人们寄以通过诱导再生丝素蛋白体系中的纤维化骨架结构来增强再生丝素蛋白凝胶、多孔支架以及膜等体系，或者通过三维各向异性排列的纤维骨架结构诱导神经元、肌细胞、眼角膜细胞等的体外取向生长并最终用于体内功能性组织修复。

[0004] 目前，纳米纤维的获得方法主要有静电纺、气泡膜裂、熔喷等传统工艺以及通过大分子的方法。中国发明专利“一种丝素蛋白纳米纤维膜及其制备方法”（103341209A）及“一种制备功能性纳米纤维的装置”（105734697A） 等是通过常规或者膜裂静电纺的方法制备纳米中长纤维，需要消耗较高的能源以及专用的大型设备，生产成本较大，且制备的纳米纤维沉积在二维平面，难以满足三维使用的要求；中国发明专利“一种线型纳米羟基磷灰石的制备方法”（102491298B）及“一种非晶丝素蛋白纳米纤维溶液及其制备方法”（ 105968384A）等通过诱导培育自组装的方法制备纳米纤维，虽无需固定的大宗型设备，但制备得到的纳米纤维长度短，达不到微米级别，难以满足实际使用要求。

发明内容

[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种工艺简短、条件温和、生产成本低廉的自组装家蚕丝素蛋白纳米纤维及其制备方法。

[0006] 实现本发明目的的技术方案是提供一种家蚕丝素蛋白纳米纤维的制备方法，以家蚕蚕丝为原料，先进行脱胶、干燥处理，获得纯丝素蛋白纤维，再进行如下步骤：

[0007] （1）将纯丝素蛋白纤维溶解于浓度为9.3M的溴化锂溶解中，透析后得到家蚕丝素蛋白溶液，浇注于模具中，在温度为20～25℃、湿度为45～65%的条件下，干燥成型为厚度0.5～5毫米的丝素蛋白膜；

[0008] （2）室温条件下，将丝素蛋白膜置于乙醇中浸泡5～120分钟，获得再结晶的丝素蛋白膜；

[0009] （3）按比例1/100～1/10 w/v，将再结晶的丝素蛋白膜浸泡于温度为25～50 ℃的缓冲液中，浸泡时间为0.5～2 h；再经3000～10000转/分钟离心处理，分离获得上清液；

[0010] （4）将获得的上清液稀释至0.1～10mg/ml，在恒温水浴环境中进行培养，得到湿态丝素蛋白纳米纤维聚集物；

[0011] （5）将湿态丝素蛋白纳米纤维聚集物进行冷冻干燥处理，得到家蚕丝素蛋白纳米纤维。

[0012] 本发明技术方案中，所述的缓冲液为pH＝7.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸或磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为0.01～1 M。

[0013] 所述的恒温水浴环境，温度为25～50 ℃；培养时间为3～8 h。

[0014] 本发明技术方案还包括按上述方法制备得到的一种家蚕丝素蛋白纳米纤维，其直径为20～500 nm，长度为1～100 μm。

[0015] 本发明的原理是：由于亲水性家蚕丝素蛋白于水相环境中，具有相比常规再生家蚕丝素蛋白更伸展的构象，易于相互聚集的特性，以及胶体胶粒间的静电排斥使其更趋于线性聚集的特点，因此亲水丝素蛋白胶体体系具有温和条件下较大的纤维化聚集动力，从而较快地 β-sheet化自聚集为具有较长长度的纳米纤维。在本发明技术方案中，可通过调节丝素蛋白膜在乙醇中的浸泡预处理时间，控制纳米纤维的直径和长度；浸泡时间越长，亲水性萃取物中亲水性氨基酸比例越大，等浓度下的时间越短，所成纤维越细越短；反之则越粗越长。

[0016] 与现有技术相比，本发明的优势在于：

[0017] 1、与现有的静电纺、熔喷法以及气泡膜裂法等工艺相比，本发明所述的亲水性丝素蛋白溶液可于温和的水相环境中生成直径为20～500 nm，长度为1～100 μm纳米纤维，能耗低、工艺简短、无需特定大宗型设备，大大降低了生产成本。

[0018] 2、与现有诱导性自组装技术相比，本发明制备家蚕丝素蛋白纳米纤维无需加入任何的添加剂便可自组装得到较长尺寸的纳米纤维，长度增长百倍以上，能够满足实际使用要求。

附图说明

[0019] 图1是本发明实施例提供的丝素蛋白纳米纤维冻干后的电镜照片图。

具体实施方式

[0020] 下面结合附图和具体实施例，对本发明技术方案作进一步阐述。

[0021] 实施例1

[0022] 本实施例提供一种丝素蛋白纳米纤维的制备方法，具体步骤如下：

[0023] （1）将脱胶干燥后的纯丝素蛋白纤维用9.3M的溴化锂溶解、透析后，获得新鲜家蚕丝素蛋白溶液，浇注于聚苯乙烯模具中，溶液厚度为1毫米，于25℃，50%湿度环境下快速干燥成型。

[0024] （2）将快速干燥成型后的丝素蛋白膜室温下于乙醇中浸泡30分钟，获得再结晶丝素蛋白膜。

[0025] （3）将再结晶处理后的丝素蛋白膜按1 / 30（w/v）比例浸泡于37 ℃,0.001M， pH=7.0的tris-盐酸缓冲液中，浸泡时间为0.5h，然后以5000转/分钟离心处理14 min，分离获得上清液。

[0026] （4）将以上获得的上清液稀释至0.5mg/ml后，于恒温水浴环境中培养3h，获得湿态丝素蛋白纳米纤维聚集物。

[0027] （5）将上述湿态丝素蛋白纳米纤维聚集物冷冻干燥，获得干态丝素蛋白纳米纤维。

[0028] 参见附图1，它是本实施例制备得到的丝素蛋白纳米纤维冻干后的电镜照片图。

[0029] 实施例2

[0030] （1）将脱胶干燥后的纯丝素蛋白纤维用9.3M的溴化锂溶解并透析后，获得新鲜家蚕丝素蛋白溶液，浇注于聚苯乙烯模具中，溶液厚度为3毫米，于25℃，60%湿度环境下快速干燥成型。

[0031] （2）将快速干燥成型后的丝素蛋白膜室温下于乙醇中浸泡60分钟，获得再结晶丝素蛋白膜。

[0032] （3）将再结晶处理后的丝素蛋白膜按1/50（w/v）比例浸泡于37 ℃，0.01M,pH=7.0的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中，浸泡时间为1h，然后3000转/分钟离心17 min，分离获得上清液。

[0033] （4）将以上获得的上清液稀释至0.25mg/ml后，于恒温水浴环境中培养6h，获得湿态丝素蛋白纳米纤维聚集物。

[0034] （5）将上述湿态丝素蛋白纳米纤维聚集物冷冻干燥，获得干态丝素蛋白纳米纤维。

[0035] 实施例3

[0036] （1）将脱胶干燥后的纯丝素蛋白纤维用9.3M的溴化锂溶解并透析后，获得新鲜家蚕丝素蛋白溶液，浇注于聚苯乙烯模具中，溶液厚度为2毫米，于23℃，55%湿度环境下快速干燥成型。

[0037] （2）将快速干燥成型后的丝素蛋白膜室温下于乙醇中浸泡120分钟，获得再结晶丝素蛋白膜。

[0038]  （3）将再结晶处理后的丝素蛋白膜按1/30（w/v）比例浸泡于37 ℃，0.05M  ,pH=7.0的tris-盐酸缓冲液中，浸泡时间为0.5h，然后7000转/分钟离心10 min，分离获得上清液。

[0039]  （4）将以上获得的上清液稀释至0.75mg/ml后，于恒温水浴环境中培养3h，获得湿态丝素蛋白纳米纤维聚集物。

[0040] （5）将上述湿态丝素蛋白纳米纤维聚集物冷冻干燥，获得干态丝素蛋白纳米纤维。

[0041] 实施例4

[0042] （1）将脱胶干燥后的纯丝素蛋白纤维用9.3M的溴化锂溶解并透析后，获得新鲜家蚕丝素蛋白溶液，浇注于聚苯乙烯模具中，溶液厚度为1毫米，于22℃，50%湿度环境下快速干燥成型；（2）将快速干燥成型后的丝素蛋白膜室温下于乙醇中浸泡90分钟，获得再结晶丝素蛋白膜。

[0043] （3）将再结晶处理后的丝素蛋白膜按1/100（w/v）比例浸泡于37 ℃,0.01M,pH=7.0的磷酸氢钾-磷酸二氢钾缓冲液中，浸泡时间为0.5h，然后4000转/分钟离心15 min，分离获得上清液。

[0044] （4）将以上获得的上清液稀释至0.25mg/ml后，于恒温水浴环境中培养6h，获得湿态丝素蛋白纳米纤维聚集物。

[0045] （5）将上述湿态丝素蛋白纳米纤维聚集物冷冻干燥，获得干态丝素蛋白纳米纤维。