应用浊点萃取-液相色谱串联质谱法检测乳或乳制品中β-受体激动剂类药物的方法

摘要

本发明公开了一种应用浊点萃取‑液相色谱串联质谱法检测乳或乳制品中β‑受体激动剂类药物的方法。所述方法包括如下步骤：(1)将所述乳或乳制品进行破乳，经离心后取上清液A；(2)将所述上清液A进行浊点萃取，所得富集相经离心后取上清液B；(3)采用液相色谱‑串联质谱法检测所述上清液B，即实现对所述乳或乳制品中β‑受体激动剂药物的检测。本发明采用浊点萃取方法，通过β‑受体激动剂类药物的添加回收率实验，建立了目标化合物的浊点萃取‑LC‑MS/MS测定方法。该方法不仅大大简化了样品的前处理的步骤，节约了分析时间，而且由于有机溶剂用量少，减少了对环境的污染，是一种环境友好的样品前处理技术，并避免了样品转溶、乳化带来的损失。

权利要求

1.一种检测乳或乳制品中β-受体激动剂药物的方法，包括如下步骤：（1）将所述乳或乳制品进行破乳，经离心后取上清液A；

所述破乳的步骤如下：向所述乳或乳制品中依次加入无水硫酸钠和冰乙酸；

所述无水硫酸钠的用量为：10ml所述乳或乳制品：0.8 1.0g所述无水硫酸钠；

~

所述冰乙酸的用量为：10ml所述乳或乳制品：0.1 0.2ml所述冰乙酸；

~

所述离心的条件如下：温度为5 8ºC；

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转速为8000 10000 rpm；

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时间为8 15 min；

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（2）将所述上清液A进行浊点萃取，所得富集相经离心后取上清液B；

所述浊点萃取的条件如下：表面活性剂为PEG4000，其水溶液的质量体积浓度为200 300 g/L；

~

平衡温度为30 60ºC；

~

平衡时间为20 30min；

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所述浊点萃取步骤中还加入添加剂和盐；

所述添加剂为正丁醇，所述正丁醇的用量为：10ml所述上清液A：0.1 0.3ml所述正丁~醇；

所述盐为无水硫酸钠，所述无水硫酸钠的用量为：10ml所述上清液A：1.0 2.0g所述无~水硫酸钠；

（3）采用液相色谱-串联质谱法检测所述上清液B，即实现对所述乳或乳制品中β-受体激动剂药物的检测；

所述液相色谱-串联质谱法的色谱条件如下：流动相：A相为体积浓度为0.1%的甲酸水溶液，B相为乙腈；

洗脱梯度：0 0.3min，80%A相；0.3 3.5min，80% 15%A相；3.5 7.5min，15% 10%A相；7.5~ ~ ~ ~ ~ ~

7.51min，10% 80%A相；7.51 12.0min，80%，均指的是体积百分含量；

~ ~

柱温为35℃；

进样体积为10μL；

流速为0.3mL/min；

所述液相色谱-串联质谱法的质谱条件如下：电喷雾正离子模式，多反应监测扫描模式；

离子源温度为120℃；

毛细管电压为4.0kV；

脱溶剂温度为350℃；

脱溶剂气流速为600L/h；

碰撞气为氩气；

雾化气压力为35psi；

所述β-受体激动剂药物为克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、马喷特罗、马布特罗、氯丙那林、喷布特罗、西马特罗、妥布特罗、西布特罗、齐帕特罗和心得安中至少一种。

说明书

应用浊点萃取-液相色谱串联质谱法检测乳或乳制品中β-受

体激动剂类药物的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种应用浊点萃取-液相色谱串联质谱法检测乳或乳制品中β-受体激动剂类药物的方法，属于食品检测方法技术领域。

背景技术

[0002] 兽药是指为治疗、预防或者诊断为目的，或者为改变神经功能或行为而用于食品动物的化学物质。兽药的广泛使用在保障畜牧业稳步发展、增加畜牧产品供应量、减少因动物疾病而带来的经济损失以及控制人畜共患疾病在动物和人类之间传播等方面发挥巨大作用。随着畜牧业生产向现代化、集约化和规模化的发展，兽药的使用量必然不断增加，但是肉、蛋、乳中却不可避免地出现各种药物的残留现象。在食品动物在应用农兽药后，农兽药的原形及其代谢产物、与农兽药有关的杂质等有可能蓄积或者残存在动物的细胞、组织或者器官内，或者计入泌乳动物的乳、或者产蛋家禽的蛋中，即残留，又称残毒。然而许多使用者却根本不知晓动物性食品中农兽药残留问题，更不清楚如何控制残留，仍然不正确的应用农兽药，如用药剂量、给药途径、用药部位和用药动物的种类等不符合用药指示，在休药期结束前屠宰动物及屠宰前逃避宰前检查等，这些错误用药方式极易引起农兽药的残留超标。由此在生产实践中违章残留事件屡见不鲜，如1987年，美国加利福尼亚查处了1166例药物残留超量事件。同年，美国农业部检查了117628只肉用犊牛，发现其中有2036只中药物残留超标。

[0003] 近年来，由于农兽药的大量使用引起的食品安全问题已被人们广泛的认识、关注和重视。为防止动物性食品中可能出现的药物残留损害人体健康，1984年在食品立法委员会(CAC)的倡导下由联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)联合发起组织了食品中农兽药残留立法委员会。CCRVDF的主要宗旨是：控制食品中的农兽药残留，筛选并建立适用于全球的农兽药及其他化学物残留的分析方法和取样方法，对农兽药进行毒理学评价，制定动物组织及产品中的兽药最高残留限量法规及休药期法规等。目前，一些主要的农产品进口国和组织均建立有庞杂的农产品进口管理技术性法律和法规体系。联合国粮农组织和世界卫生组织食品法典委员会(FAO/WHO/CAC)，制定了300多种食品中170种农、兽药最高残留限量。从2006年5月29日起，日本实施了“食品中农业化学品肯定列表制度”，只有符合“肯定列表制度”要求的食品才能进入日本市场。该制度对目前所有农业化学品在食品中的残留都作出了具体规定。其中，对797种农药、兽药及饲料添加剂制定了53862个残留限量标准，对没有设定限量标准的农业化学品，将执行0.01mg/kg的“一律标准”，只有65种天然和化学合成物质作为豁免物质不设限量。同样，加拿大、德国和东盟其它许多国家和区域性国际组织，也结合本国或本地区的实际情况制定了各种食品中农兽药最高残留限量。与此同时，美国、欧盟、日本等发达国家通过调整、修改政策法规和利用先进科学技术设置技术性贸易壁垒，使得农兽药残留问题不仅是影响人的身体健康，而且也严重影响到国家的对外贸易。

[0004] 牛奶的营养价值非常高，不但可以满足老年人和儿童的营养需求并且能够增强人们的体质。现在我国奶牛业的快速的发展，居民消费水平的不断的提高，人们对牛奶的消费量也随之大幅提高，与此同时人们对牛奶的安全性也提出了更高的要求。目前，测定乳与乳制品中β-受体激动剂类药物的方法主要有GC、GC-MS、HPLC和LC-MS/MS法。由于大量使用有机溶剂，给环境造成污染，限制了其广泛应用。因此，需要提供一种操作简单、分析时间短、准确高效且前处理过程不使用有机溶剂的检测乳或乳制品中β-受体激动剂类药物的方法。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种应用浊点萃取-液相色谱串联质谱法检测乳或乳制品中β-受体激动剂类药物的方法，本发明利用浊点萃取技术的原理，结合LC-MS/MS对乳或乳制品(牛奶)中β-受体激动剂类药物进行提取、富集和分析，建立了浊点萃取(CPE)-LC/MS/MS法分析检测牛奶中β-受体激动剂类药物的理想方法。

[0006] 本发明所提供的检测乳或乳制品中β-受体激动剂药物的方法，包括如下步骤：

[0007] (1)将所述乳或乳制品进行破乳，经离心后取上清液A；

[0008] (2)将所述上清液A进行浊点萃取，所得富集相经离心后取上清液B；

[0009] (3)采用液相色谱-串联质谱法检测所述上清液B，即实现对所述乳或乳制品中β-受体激动剂药物的检测。

[0010] 上述的方法中，所述β-受体激动剂药物可为克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、马喷特罗、马布特罗、氯丙那林、喷布特罗、西马特罗、妥布特罗、西布特罗、齐帕特罗和心得安中至少一种。

[0011] 上述的方法中，所述乳制品指的是以牛羊奶等为主要原料，经加工制成的各种食品，如牛奶等。

[0012] 上述的方法中，步骤(1)中，所述破乳的步骤如下：

[0013] 向所述乳或乳制品中依次加入无水硫酸钠和冰乙酸；

[0014] 所述无水硫酸钠的用量为：10ml所述乳或乳制品：0.8～1.0g所述无水硫酸钠；

[0015] 所述冰乙酸的用量为：10ml所述乳或乳制品：0.1～0.2ml所述冰乙酸。

[0016] 上述的方法中，步骤(1)中，所述离心的条件如下：

[0017] 温度为5～8℃；

[0018] 转速为8000～10000rpm；

[0019] 时间为8～15min。

[0020] 上述的方法中，步骤(2)中，所述浊点萃取的条件如下：

[0021] 表面活性剂为PEG4000，其水溶液的质量体积浓度为200～300g/L；

[0022] 平衡温度为30～60℃；

[0023] 平衡时间为20～30min。

[0024] 上述的方法中，步骤(2)中，所述浊点萃取步骤中还加入添加剂和盐；

[0025] 所述添加剂为正丁醇，所述正丁醇的用量为：10ml所述上清液A：0.1～0.3ml所述正丁醇；

[0026] 所述盐为无水硫酸钠，所述无水硫酸钠的用量为：10ml所述上清液A：1.0～2.0g所述无水硫酸钠。

[0027] 上述的方法中，步骤(3)中，所述液相色谱-串联质谱法的色谱条件如下：

[0028] 流动相：A相为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液，B相为乙腈；

[0029] 洗脱梯度：0～0.3min，80％A相；0.3～3.5min，80％～15％A相；3.5～7.5min，15％～10％A相；7.5～7.51min，10％～80％A相；7.51～12.0min，80％，均指的是体积百分含量。

[0030] 上述的方法中，步骤(3)中，所述液相色谱-串联质谱法的色谱条件如下：

[0031] 柱温为35℃；

[0032] 进样体积为10μL；

[0033] 流速为0.3mL/min。

[0034] 上述的方法中，步骤(3)中，所述液相色谱-串联质谱法的质谱条件如下：

[0035] 电喷雾正离子模式，多反应监测扫描模式。

[0036] 上述的方法中，步骤(3)中，所述液相色谱-串联质谱法的质谱条件如下：

[0037] 离子源温度为120℃；

[0038] 毛细管电压为4.0kV；

[0039] 脱溶剂温度为350℃；

[0040] 脱溶剂气流速为600L/h；

[0041] 碰撞气为氩气；

[0042] 雾化气压力为35psi。

[0043] 本发明提供的乳或乳制品中β-受体激动剂类药物的多残留检测方法，进行了萃取溶剂的选择、净化方法的研究、反应条件的确定、色谱质谱条件的优化，建立药物的LC-MS/MS(ESI)数据库，测定目标化合物的标准曲线和最低检出限，并用回收率、相对标准偏差等参数对其进行评价，使各目标物在线性范围内的相关系数大于0.99；检出限满足监管需要；方法回收率达到60％以上，方法重现性RSD在20％以内，均符合药物残留分析的要求。

[0044] 本发明采用浊点萃取方法，通过β-受体激动剂类药物的添加回收率实验，建立了目标化合物的浊点萃取-LC-MS/MS测定方法。该方法不仅大大简化了样品的前处理的步骤，节约了分析时间，而且由于有机溶剂用量少，减少了对环境的污染，是一种环境友好的样品前处理技术，并避免了样品转溶、乳化带来的损失。添加回收率试验表明：β-受体激动剂类药物的回收率和相对标准偏差均符合农兽药残留分析要求。

附图说明

[0045] 图1为13种β-受体激动剂及3种同位素内标的MRM谱图(10μg/L)。

[0046] 图2为表面活性剂种类对目标物回收率的影响。

[0047] 图3为表面活性剂浓度对目标物回收率的影响。

[0048] 图4为正丁醇添加量对目标物回收率的影响。

[0049] 图5为平衡温度对目标物回收率的影响。

[0050] 图6为平衡时间对目标物回收率的影响。

具体实施方式

[0051] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0052] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0053] 一、材料与方法

[0054] 1、实验材料

[0055] 1.1样品原料：牛奶为伊利集团纯牛奶。

[0056] 1.2β-受体激动剂类兽药标准品标准品克伦特罗(Clenbuterol)、莱克多巴胺(Ractopamine)、沙丁胺醇(Salbutamol)、特布他林(Terbutaline)、马喷特罗(Mapenterol)、马布特罗(Mabuterol)、喷布特罗(Penbutolol)、妥布特罗(Tulobuterol)、氯丙那林(Clorprenaline)、西马特罗(Cimaterol)、西布特罗(Cimbuterol)、齐帕特罗(Zilpaterol)、心得安(Propranolol)、同位素内标沙丁醇胺-d3(salbuterol-d3)、克伦特罗-d9(clenbuterol-d9)、莱卡多巴胺-d3(ractopamine-d3)均购于Dr.Ehrenstorfer公司，纯度>95％，

[0057] 1.3试剂：PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000、PEG 8000(上海凌峰化学试剂公司，化学纯)；乙腈(天津博迪化工股份有限公司，色谱纯)；冰乙酸、浓氨水、正丁醇、乙酸铵、硫酸铵、氯化钠、无水硫酸钠均为分析纯(天津博迪化工股份有限公司)。

[0058] 1.4仪器：1200型高效液相色谱和6410B三重四级杆质谱仪(美国Agilent公司)；CF16RXⅡ型高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)；Milli-Q超纯水(美国Millipore公司)；
SHA-B型恒温水浴振荡器(金坛市新航仪器厂)；氮吹浓缩仪(美国Organomation Associates公司)；SB5200型超声波清洗机(SHANGHAI BRANSON)。

[0059] 2、实验方法

[0060] 2.1标准溶液的配置

[0061] 分别称取适量的13种β-受体激动剂和3种同位素内标，用甲醇溶解并定容至10mL，配成浓度为100mg/L的标准储备液。将标准储备液用甲醇稀释，配制成溶度为1.0mg/L的混合标准中间液。分别吸取3种同位素内标用甲醇稀释为1.0mg/L的混合同位素内标中间液，标准工作液现用现配。上述标准储备液均于-18℃冰箱中保存，标准中间液均于4℃冰箱中保存。

[0062] 2.2样品前处理技术

[0063] (1)破乳步骤

[0064] 准确移取10mL牛奶于25mL刻度试管中，依次准确加入3mL 300g/L Triton X-100溶液、0.95gNa2SO4，混合均匀。当加入的无水硫酸钠全部溶解后，准确加入冰乙酸0.14mL，混合均匀。用纯净水稀释此混合液至15mL。将上述溶液超声15min，然后使其在5℃、10000rpm条件下离心10min。取上清液过0.45μm滤膜，得澄清溶液。

[0065] (2)浊点萃取步骤

[0066] 准确移取上述澄清溶液10.0mL于25mL刻度试管中，依次准确加入1.0mL 300g/L PEG 4000溶液、1.10g无水硫酸钠，混合均匀并超声辅助全部溶解后，准确加入0.25mL正丁醇，混合均匀。将上述混合溶液于50℃条件下水浴20min；将定容后的富集相在10000rpm条件下离心5min，上清液过0.22μm滤膜，滤液待测。

[0067] 2.3色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(2.1×150mm，3.5μm)；柱温：35℃；进样体积：10μL；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；流速：0.3mL/min；梯度洗脱见表1。

[0068] 表1液相流动相变化梯度表

[0069]

[0070]

[0071] 2.4质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；离子源温度120℃；毛细管电压4.0kV；脱溶剂温度350℃；脱溶剂气流速(氮气)：600L/h；碰撞气：氩气；雾化气压力：35psi；检测方式：多反应监测(MRM)模式。

[0072] 3、结果与分析

[0073] 3.1色谱质谱条件的优化

[0074] 本发明分别比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1％甲酸水、乙腈-0.1％甲酸水四种流动相体系对13种化合物色谱分离的影响，实验结果表明用乙腈-0.1％甲酸水作流动相，在梯度洗脱条件下，LC-MS/MS分析的色谱峰分离度较好，峰形好且响应高，因此选择乙腈-0.1％甲酸水作为流动相体系。

[0075] 在ESI正离子扫描模式下，对10μg/L的13种β-受体激动剂标准溶液进行全扫描，确定其准分子离子。然后分别对准分子离子进行子离子扫描，得到碎片离子的信息，找出响应较强的两个子离子，进一步优化碰撞能量使其响应最大。选择母离子和这两个子离子作为特征离子对，将其中信号大的子离子作为定量离子，由此得到的特征子离子和碰撞能量等(见表2)。

[0076] 表2 13种β-受体激动剂的MRM参数

[0077]

[0078] 注：加“*”的离子用于定量。

[0079] 在优化后的色谱质谱条件下，13种β-受体激动剂及3种同位素内标得到很好的分离，峰形对称、尖锐，具有良好的质谱响应(见图1)。

[0080] 3.2破乳条件的优化

[0081] 牛奶基质组成复杂，含有大量蛋白质、脂肪及其他干扰物质，易被表面活性剂增溶于疏水性的胶束内核中而对浊点现象及两相分离产生很大影响，由此可见，牛奶中的杂质直接关系着实验分析的准确性和效率，同时基于对色谱柱的保护，需要先将其除去。β-受体激动剂类药物在牛奶中的分布主要是在其水溶液和脂肪球内，并且药物的疏水性越大越倾向存在于脂肪颗粒中，因此需要进行破乳操作将脂肪球内的药物释放出来，否则会直接影响实验的提取效率和分析的准确性。

[0082] 本发明选择冰乙酸对牛奶进行破乳操作。电解质的加入能够降低蛋白质的溶解度，从而对牛奶破乳有一定的辅助作用，常用的破乳无机盐有硫酸铵、无水硫酸钠及氯化钠。离心对于沉淀蛋白、去除大部分脂肪是必不可少的步骤，乳脂肪在5℃以下呈固态，将破乳后的溶液在5℃下冷冻离心，可以去除乳脂肪和蛋白质等固体杂质。

[0083] 因此本发明在0～0.2mL范围内优化冰乙酸的用量；选择硫酸铵、无水硫酸钠及氯化钠辅助破乳，并在0～1.8g范围内进行添加量的优化，并对冷冻离心条件加以优化，破乳的效果通过离心后上清液的澄清程度来判断。最终确定了最佳破乳条件：冰乙酸用量0.15mL；无水硫酸钠用量0.95g；5℃，10000r/min，离心10min。

[0084] 3.3浊点萃取条件的优化

[0085] 本发明选用4种β-受体激动剂类药物作为代表对浊点萃取技术对牛奶中的兽药进行富集分离，确定表面活性剂种类及用量等条件，优化前处理条件。

[0086] (1)表面活性剂种类的选择

[0087] 浊点萃取效率受直接受表面活性剂疏水和亲水两部分的影响，表面活性剂的疏水部分增大，疏水性加强，有机物的萃取效率提高；当表面活性剂中的亲水部分增加，有机物的分配系数及萃取率下降。

[0088] 本发明选择8种HLB值不同的表面活性剂(Tween-20、Tween-40、Triton X-100、Triton X-114、PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000、PEG 8000)作为优化对象进行研究。Tween-20、Tween-40、Triton X-100和Triton X-114均未与反萃取溶剂正己烷分层或分层不明显，无法取样进行色谱分析，而PEG 2000需要的水浴温度过高(超过60℃)，所以Tween-20、Tween-40、Triton X-100、Triton X-114和PEG 2000不能满足要求，因而重点对PEG 4000、PEG 6000和PEG 8000进行比较，结果见图2。由图2可以看出，PEG 6000和PEG 8000的添加回收率较PEG 4000低，故将PEG 4000作为浊点萃取的表面活性剂来进一步完成实验研究。

[0089] (2)表面活性剂浓度的优化

[0090] 表面活性剂的用量显著影响回收率、浓缩因子、相比等参数。用量少会出现回收率低、准确度和重现性欠佳等问题，严重影响实验定量研究。本发明在PEG4000的浓度为300g/L时研究，PEG 4000浓度太高时溶液粘稠不利于吸取转移；浓度太低需要的体积过大时会降低富集倍数。当PEG 4000添加量0.6～1.4ml时，4种兽药的回收率如图3。由图3可以看出，当其添加量为1.0ml时4种兽药的添加回收率最高，能够满足兽药残留分析的要求。

[0091] (3)正丁醇量的优化

[0092] 萃取过程中加入适当的添加剂可以改变表面活性剂的浊点温度，引发表面活性剂的相分离。常用的添加剂有：盐析型电解质、醇、酸、聚合物等，直链醇、支链醇及有机酸的亲水性能、溶解度、空间位置及其在胶束的增溶位置对表面活性剂CPT有影响，正丁醇、丙三醇可以使表面活性剂的CPT降低。本发明在300～450μL范围内对正丁醇的用量进行优化，图4为正丁醇添加量对目标物回收率的影响。实验结果表明：当不添加正丁醇时，分相后富集相粘度过大，在移出水相的过程中易造成富集相的损失，所以弃掉。正丁醇的添加量在250μL时，回收率最好，因此选择250μL为最优的正丁醇添加量。

[0093] (4)盐种类及用量的优化

[0094] 添加惰性盐于溶液中可以增大溶液离子强度，使水相密度增大，加速两相分离；降低表面活性剂的浊点，利于热敏性药物的萃取；同时可以增加目标物的回收率。本发明经初步预选后使用无水Na2SO4和无水MgSO4进行添加回收率实验。研究表明，在添加量相同的条件下，添加无水Na2SO4比添加无水MgSO4时农药的平均回收率高且较稳定，所以选择无水Na2SO4做进一步用量优化实验。当无水Na2SO4添加量低于1.10g时，浊点现象不明显，而添加量高于1.10g时回收率已无明显提高，故选择1.10g作为无水硫酸钠的最适添加量。

[0095] (5)平衡温度的优化

[0096] 采用非离子表面活性剂萃取目标物时，提高平衡温度会导致非离子表面活性剂与水作用的氢键破坏而发生脱水现象，从而使萃取率增加，富集相体积减小。本发明在40～60℃范围内对平衡温度进行优化，图5为当表面活性剂为PEG 4000，其浓度为300g/L，正丁醇添加量为0.25mL，无水硫酸钠添加量为1.1g时，平衡温度对目标物回收率的影响情况。实验结果显示：在50℃时，4种兽药的回收率达到最高。因此，选择50℃为最优平衡温度来进一步完成实验研究。

[0097] (6)平衡时间的优化

[0098] 浊点萃取中存在表面活性剂、单体和待测物在水相、胶束相两个平衡过程，这两个过程都需要一定的时间达到平衡。本发明在10～40min范围内对平衡时间进行优化，图6为当表面活性剂为PEG 4000，其浓度为300g/L，正丁醇添加量为0.25mL，无水硫酸钠添加量为1.1g时，平衡温度为50℃时，平衡时间对目标物回收率的影响。实验结果表明：平衡20min，4种兽药的回收率达到最高。因此，选择20min作为最优平衡温度来进一步完成实验研究。

[0099] (7)超声时间的优化

[0100] 浊点萃取过程中一些辅助手段也可以加速两相的分离、提高萃取率，如离心、超声、微波和搅拌等。本研究发现增加超声步骤对提高兽药的萃取率效果不显著，反而增加实验操作的复杂性，因此，实验放弃超声处理。

[0101] 3.4方法学验证

[0102] 3.4.1添加回收率实验

[0103] 在优化的浊点萃取对牛奶中β-受体激动剂类药物进行富集分离的条件下(包括破乳方式和浊点萃取方法，确定了冰乙酸的用量为0.15mL及无水硫酸钠添加量为0.95g，离心参数为5℃、10000r/min条件下离心10min的最佳破乳条件；以表面活性剂为PEG 4000，其浓度为300g/L，正丁醇添加量为0.25mL，无水硫酸钠添加量为1.1g，平衡温度为50℃，平衡时间为20min的浊点萃取条件)，在牛奶基质中分别进行三个浓度0.5、1.0、5.0μg/kg的加标回收实验(n＝3)，加标回收率为83.2～102.6％，相对标准偏差为4.98～12.1％。实验结果准确，精密度高，符合药物残留检测的要求(见表3)。

[0104] 表3 13种β-受体激动剂类药物的添加回收率及相对标准偏差(n＝3)

[0105]

[0106]

[0107] 3.4.2方法的线性范围和检出限

[0108] 在质量浓度为10.0～100.0μg/kg时，以基质标准品峰面积Y为纵坐标，工作溶液的质量浓度X为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液的响应值应在仪器测定的线性范围内。在10.0～100.0μg/kg范围内，11种药物的线性方程、相关系数、定性检出限和定量检出限见表4，由表4中的数据可以看出，11种目标物线性方程具有良好的线性关系，且实验添加浓度高于方法的检测限并低于线性方程的浓度上限，能达到分析的要求。

[0109] 表4 13种药物的线性方程、相关系数、定性检出限和定量检出限

[0110]

[0111] 3.4.3基质效应的消除

[0112] 本发明在建立方法过程中，发现很多药物均存在不同程度的基质效应，消除基质效应除改进样品净化手段外，还有使用同位素内标(理化性质与目标物几乎一致)、稀释样品溶液(降低基质成分浓度)、配制基质匹配标准溶液(为标准液提供与样品溶液相似的离子化环境)等方法。综合考虑，本发明采用同位素内标的方法，很好地消除了基质影响，完全能满足残留检测的要求。

[0113] 3.5实际样品检测

[0114] 将建立的方法用于37份超市售牛奶的检测，结果37份样品均未检出β-受体激动剂。