一种单纯疱疹病毒II型IgM抗体的免疫层析检测试剂盒

摘要

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种单纯疱疹病毒II型IgM抗体的免疫层析检测试剂盒。所述试剂盒由试剂条和塑料卡组装而成，试剂条包括底板，底板上粘贴有带有检测线和质控线的反应膜，反应膜靠近检测线的一端依次叠加粘贴有胶体金垫、样品垫，反应膜靠近质控线的一端叠加粘贴有吸收垫，检测线包被了单纯疱疹病毒II型抗原，质控线包被了羊抗鼠IgG抗体，胶体金垫上包被了胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体。本发明试剂盒可显著降低环境因素(如低温、高湿)对检测过程和结果的影响，保障检测结果的灵敏度、准确度和稳定性。

权利要求

1.一种单纯疱疹病毒II型IgM抗体的免疫层析检测试剂盒，所述试剂盒由试剂条和塑料卡组装而成，所述试剂条包括底板，所述底板上粘贴有带有检测线和质控线的反应膜，所述反应膜靠近检测线的一端依次叠加粘贴有胶体金垫、样品垫，所述反应膜靠近质控线的一端叠加粘贴有吸收垫，所述反应膜上检测线包被了单纯疱疹病毒II型抗原，所述反应膜上质控线包被了羊抗鼠IgG抗体，所述胶体金垫上包被了胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体，其特征在于：所述反应膜由以下方法制得：用缓冲液将单纯疱疹病毒II型抗原稀释至包被浓度为

0.8 1.2mg/ml，将羊抗鼠IgG抗体稀释至包被浓度为1.5 1.8mg/ml，在反应膜上分别划线单~ ~纯疱疹病毒II型抗原检测线和羊抗鼠IgG抗体质控线，划线后将反应膜置于干燥间，温度20

25℃，湿度小于30%，干燥4 5小时；

~ ~

所述胶体金垫由以下方法制得：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH8.0，按100ml胶体金溶液加入2.0mg鼠抗人IgM单克隆抗体，再缓慢添加0.2M K2CO3将胶体金溶液调至pH9.5，添加K2CO3的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/ml牛血清白蛋白，1mg/ml聚乙烯吡咯烷酮封闭20 30分钟，12000r/m离心30分钟，弃上清，用缓冲液复溶至50ml，按~

1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置于干燥间，温度20 25℃，湿度小于~

30%，干燥4 5小时；

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所述缓冲液由以下方法制得：称取0.06g的NaH2PO4·2H2O和0.58g的Na2HPO4·12H2O，加纯化水80.0mL，搅拌使充分溶解后加入0.80 0.90g的NaCl和0.5 2.0g烷基糖苷，充分混匀，~ ~定容至100ml，测定pH值为7.5 8.0；

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所述烷基糖苷的碳链长度为C8 C10。

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2.如权利要求1所述单纯疱疹病毒II型IgM抗体的免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述反应膜为硝酸纤维素膜。

3.如权利要求1所述单纯疱疹病毒II型IgM抗体的免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维膜。

说明书

一种单纯疱疹病毒II型IgM抗体的免疫层析检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种单纯疱疹病毒II型IgM抗体的免疫层析检测试剂盒。

背景技术

[0002] 单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus,HSV)属于人类疱疹病毒α亚科，是DNA双链病毒，人类是其唯一自然宿主。根据其抗原性质的不同，可分为单纯疱疹病毒I型(HSV-1型)型和单纯疱疹病毒II型(HSV-2型)，两者之间的基因同源序列约为50％。HSV-1型多感染口、面、眼等腰部以上部位，而HSV-2型则通常感染生殖器及肛周等腰以下部位。疱疹的典型临床表现出皮肤粘膜上出现集簇性水疱、脓疱。溃疡和结痂。

[0003] HSV-2型是引起生殖器疱疹最常见的原因，生殖器疱疹已经成为感染率最高的性传播感染之一。孕妇感染单纯疱疹病毒易引起胎儿畸形或分娩后婴儿出现疱疹病毒性脑炎等而严重致残疾病。近年来生殖器疱疹尤其是复发性生殖器的患病率无论在发达国家或是发展中国家均明显增加。80％以上的HSV-2型感染者并不表现出生殖器疱疹症状，或没有显著症状，不易被发现，但仍能间歇性的排毒，在不易察觉的情况下传染给别人。单纯疱疹病毒的特异性抗体和非特异性抗体均在感染后的最初几周内出现，因此，HSV-2型特异性IgM抗体的检测对于隐形感染和流行病学调查具有重要作用。

[0004] 目前，单纯疱疹病毒的实验室诊断方法有细胞培养、抗原检测、PCR、血清抗体检测等。细胞培养及PCR方法对实验场地等实验条件及人员的要求较高，均不能在大部分的实验室开展。检测抗原的直接免疫荧光或ELISA方法均需依赖相应的仪器设备，而且试剂多为进口，价格昂贵。血清抗体检测如常用的胶体金免疫层析法，其特异性强、灵敏度高、操作简捷等优点而并广泛应用，但是胶体金免疫层析法受环境和人为因素的影响较大，如当环境温度较低时(如冬季)，层析速度慢，需延长反应时间，否则容易造成漏检；或放置于空气中过长时间，导致受潮，或当环境湿度过高，膜上毛细作用加强，点膜容易引起T线、C线变宽甚至扩散，影响检测过程和结果。因此，需对胶体金免疫层析法检测HSV-2型特异性IgM抗体的试剂盒进行优化，以得到一种受环境因素影响小、检测稳定性高的单纯疱疹病毒II型免疫层析检测试剂盒。

发明内容

[0005] 为了解决现有技术中存在的问题(如胶体金免疫层析法受环境因素影响大，导致灵敏度和稳定性下降等)，本发明提供了一种单纯疱疹病毒II型IgM抗体的免疫层析检测试剂盒，该试剂盒可显著降低环境因素对检测过程和结果的影响，保障检测结果的灵敏度、准确度和稳定性。

[0006] 本发明提供的一种单纯疱疹病毒II型IgM抗体的免疫层析检测试剂盒，所述试剂盒由试剂条和塑料卡组装而成，所述试剂条包括底板，所述底板上粘贴有带有检测线(T)和质控线(C)的反应膜，所述反应膜靠近检测线(T)的一端依次叠加粘贴有胶体金垫、样品垫，所述反应膜靠近质控线(C)的一端叠加粘贴有吸收垫，所述反应膜上检测线(T)包被了单纯疱疹病毒II型抗原，所述反应膜上质控线(C)包被了羊抗鼠IgG抗体，所述胶体金垫上包被了胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体。

[0007] 在本发明试剂盒中，所述反应膜由以下方法制得：用缓冲液将单纯疱疹病毒II型抗原稀释至包被浓度为0.8～1.2mg/ml，将羊抗鼠IgG抗体稀释至包被浓度为1.5～1.8mg/ml，在反应膜上分别划线单纯疱疹病毒II型抗原检测线和羊抗鼠IgG抗体质控线，划线后将反应膜置于干燥间，温度20～25℃，湿度小于30％，干燥4～5小时；

[0008] 所述胶体金垫由以下方法制得：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH8.0，按100ml胶体金溶液加入2.0mg鼠抗人IgM单克隆抗体，再缓慢添加0.2M K2CO3将胶体金溶液调至pH9.5，添加K2CO3的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/ml牛血清白蛋白，1mg/ml聚乙烯吡咯烷酮封闭20～30分钟，12000r/m离心30分钟，弃上清，用缓冲液复溶至50ml，按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置于干燥间，温度20～25℃，湿度小于30％，干燥4～5小时。

[0009] 进一步的，所述缓冲液由以下方法制得：称取0.06g的NaH2PO4·2H2O和0.58g的Na2HPO4·12H2O，加纯化水80.0mL，搅拌使充分溶解后加入0.80～0.90g的NaCl和0.5～2.0g烷基糖苷，充分混匀，定容至100ml，测定pH值为7.5～8.0。

[0010] 再进一步的，所述烷基糖苷的碳链长度为C8～C10。

[0011] 进一步的，所述反应膜为硝酸纤维素膜。

[0012] 进一步的，所述样品垫为玻璃纤维膜。

[0013] 在本发明的技术方案中，烷基糖苷是一种非离子表面活性剂，其兼具非离子和阴离子表面活性剂的特性，而发明人意外地发现在磷酸盐缓冲液中添加烷基糖苷，并且同时应用于反应膜和胶体金垫的制备中，可有效提高试剂盒在低温环境下的层析速度，并且减弱环境湿度对检测过程及结果的影响，从而提高检测结果的准确度和稳定性。这可能是因为烷基糖苷的非离子和阴离子特性，一方面在检测时能加快胶体金标记颗粒与配体结合形成复合物的速度，以及T线和C线的捕获速度，从而提高层析速度，所以即使在低温环境下检测反应时间也在20分钟以内；另一方面能提高胶体金标记颗粒和复合物稳定性，维持T线和C线的稳定，使其受环境湿度的影响大大减弱，一是能延长其使用期效，二避免因受潮导致检测过程受影响和检测结果不准确，从而保障检测结果的灵敏度、准确度和稳定性。

[0014] 本发明试剂盒的检测方法为：1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸盒，平放；2)10μI血清、血浆样本，样本为全血时吸取20ul样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL样本稀释液(生理盐水或PBS)，5～20分钟内可判定结果。3)检测结果分析：阳性：出现紫红色质控线(C线)和检测线(T线)两条条带；阴性：只出现一条紫红色质控线(C线)条带；无效：未出现紫红色质控线(C线)条带，表明不正确的操作过程或试剂已变质损坏，实验无效，60分钟后检验结果也无效。

[0015] 因此，与现有技术相比，本发明的优势在于：

[0016] 本发明单纯疱疹病毒II型IgM抗体的免疫层析检测试剂盒通过对缓冲液的优化，增加了烷基糖苷这一组分，同时对单纯疱疹病毒II型抗原、羊抗鼠IgG抗体的包被浓度，鼠抗人IgM单克隆抗体的标记浓度，以及胶体金标记时的pH值进行调整优化以显著降低环境因素对检测过程的影响，加快低温环境下的层析速度，提高试剂盒的耐潮性，从而保障检测结果的灵敏度、准确度和稳定性，并且延长试剂盒的使用期效。

具体实施方式

[0017] 下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

[0018] 在本发明实施例和对比例中，单纯疱疹病毒II型抗原经单纯疱疹病毒II型G株培养、纯化获得，其他原料均源于市售，如羊抗鼠IgG抗体购自杭州启泰生物技术有限公司，鼠抗人IgM单克隆抗体购自上海鼎杰生物科技有限公司，C8～C10烷基糖苷(活性物52.0wt％)购自广州市西陆化工有限公司。

[0019] 实施例1、本发明单纯疱疹病毒II型IgM抗体的免疫层析检测试剂盒[0020] 本实施例的试剂盒由试剂条和塑料卡组装而成，所述试剂条的宽度为4mm，包括底板，所述底板上粘贴有带有检测线(T)和质控线(C)的反应膜，所述反应膜靠近检测线(T)的一端依次叠加粘贴有胶体金垫、样品垫，T线一端搭接胶体金垫的1/5处粘贴，样品垫搭接胶体金垫的1/3处粘贴；所述反应膜靠近质控线(C)的一端叠加粘贴有吸收垫，搭接吸样垫的1/10处粘贴，所述反应膜上检测线(T)包被了单纯疱疹病毒II型抗原，所述反应膜上质控线(C)包被了羊抗鼠IgG抗体，所述胶体金垫上包被了胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体。

[0021] 所述反应膜由以下方法制得：用缓冲液将单纯疱疹病毒II型抗原稀释至包被浓度为0.8mg/ml，将羊抗鼠IgG抗体稀释至包被浓度为1.5mg/ml，在反应膜上分别划线单纯疱疹病毒II型抗原检测线和羊抗鼠IgG抗体质控线，划线后将反应膜置于干燥间，温度20℃，湿度小于30％，干燥5小时；

[0022] 所述胶体金垫由以下方法制得：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH8.0，按100ml胶体金溶液加入2.0mg鼠抗人IgM单克隆抗体，再缓慢添加0.2M K2CO3将胶体金溶液调至pH9.5，添加K2CO3的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/ml牛血清白蛋白，1mg/ml聚乙烯吡咯烷酮封闭20分钟，12000r/m离心30分钟，弃上清，用缓冲液复溶至50ml，按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置于干燥间，温度20℃，湿度小于30％，干燥5小时。

[0023] 所述缓冲液由以下方法制得：称取0.06g的NaH2PO4·2H2O和0.58g的Na2HPO4·12H2O，加纯化水80.0mL，搅拌使充分溶解后加入0.80g的NaCl和0.5g烷基糖苷，充分混匀，定容至100ml，测定pH值为7.5。

[0024] 所述烷基糖苷的碳链长度为C8～C10；所述反应膜为硝酸纤维素膜；所述样品垫为玻璃纤维膜。

[0025] 实施例2、本发明单纯疱疹病毒II型IgM抗体的免疫层析检测试剂盒[0026] 本实施例的试剂盒由试剂条和塑料卡组装而成，所述试剂条的宽度为4mm，包括底板，所述底板上粘贴有带有检测线(T)和质控线(C)的反应膜，所述反应膜靠近检测线(T)的一端依次叠加粘贴有胶体金垫、样品垫，T线一端搭接胶体金垫的1/5处粘贴，样品垫搭接胶体金垫的1/3处粘贴；所述反应膜靠近质控线(C)的一端叠加粘贴有吸收垫，搭接吸样垫的1/10处粘贴，所述反应膜上检测线(T)包被了单纯疱疹病毒II型抗原，所述反应膜上质控线(C)包被了羊抗鼠IgG抗体，所述胶体金垫上包被了胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体。

[0027] 所述反应膜由以下方法制得：用缓冲液将单纯疱疹病毒II型抗原稀释至包被浓度为1.2mg/ml，将羊抗鼠IgG抗体稀释至包被浓度为1.8mg/ml，在反应膜上分别划线单纯疱疹病毒II型抗原检测线和羊抗鼠IgG抗体质控线，划线后将反应膜置于干燥间，温度25℃，湿度小于30％，干燥4小时；

[0028] 所述胶体金垫由以下方法制得：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH8.0，按100ml胶体金溶液加入2.0mg鼠抗人IgM单克隆抗体，再缓慢添加0.2M K2CO3将胶体金溶液调至pH9.5，添加K2CO3的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/ml牛血清白蛋白，1mg/ml聚乙烯吡咯烷酮封闭30分钟，12000r/m离心30分钟，弃上清，用缓冲液复溶至2
50ml，按1ml溶液铺20cm的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置于干燥间，温度25℃，湿度小于30％，干燥5小时。

[0029] 所述缓冲液由以下方法制得：称取0.06g的NaH2PO4·2H2O和0.58g的Na2HPO4·12H2O，加纯化水80.0mL，搅拌使充分溶解后加入0.90g的NaCl和2.0g烷基糖苷，充分混匀，定容至100ml，测定pH值为8.0。

[0030] 所述烷基糖苷的碳链长度为C8～C10；所述反应膜为硝酸纤维素膜；所述样品垫为玻璃纤维膜。

[0031] 实施例3、本发明单纯疱疹病毒II型IgM抗体的免疫层析检测试剂盒[0032] 本实施例的试剂盒由试剂条和塑料卡组装而成，所述试剂条的宽度为4mm，包括底板，所述底板上粘贴有带有检测线(T)和质控线(C)的反应膜，所述反应膜靠近检测线(T)的一端依次叠加粘贴有胶体金垫、样品垫，T线一端搭接胶体金垫的1/5处粘贴，样品垫搭接胶体金垫的1/3处粘贴；所述反应膜靠近质控线(C)的一端叠加粘贴有吸收垫，搭接吸样垫的1/10处粘贴，所述反应膜上检测线(T)包被了单纯疱疹病毒II型抗原，所述反应膜上质控线(C)包被了羊抗鼠IgG抗体，所述胶体金垫上包被了胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体。

[0033] 所述反应膜由以下方法制得：用缓冲液将单纯疱疹病毒II型抗原稀释至包被浓度为1.0mg/ml，将羊抗鼠IgG抗体稀释至包被浓度为1.6mg/ml，在反应膜上分别划线单纯疱疹病毒II型抗原检测线和羊抗鼠IgG抗体质控线，划线后将反应膜置于干燥间，温度20℃，湿度小于30％，干燥5小时；

[0034] 所述胶体金垫由以下方法制得：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为20nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH8.0，按100ml胶体金溶液加入2.0mg鼠抗人IgM单克隆抗体，再缓慢添加0.2M K2CO3将胶体金溶液调至pH9.5，添加K2CO3的时间为5分钟，然后室温搅拌30分钟，加入终浓度为10mg/ml牛血清白蛋白，1mg/ml聚乙烯吡咯烷酮封闭25分钟，12000r/m离心30分钟，弃上清，用缓冲液复溶至50ml，按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置于干燥间，温度20℃，湿度小于30％，干燥5小时。

[0035] 所述缓冲液由以下方法制得：称取0.06g的NaH2PO4·2H2O和0.58g的Na2HPO4·12H2O，加纯化水80.0mL，搅拌使充分溶解后加入0.8g的NaCl和1.0g烷基糖苷，充分混匀，定容至100ml，测定pH值为7.8。

[0036] 所述烷基糖苷的碳链长度为C8～C10；所述反应膜为硝酸纤维素膜；所述样品垫为玻璃纤维膜。

[0037] 对比例1

[0038] 与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：缓冲液中不添加烷基糖苷。

[0039] 对比例2

[0040] 与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：缓冲液中添加4.0g烷基糖苷。

[0041] 试验例一

[0042] 使用实施例1～3和对比例1～2的试剂盒，以及市售试剂盒(单纯疱疹病毒II型(IgM)抗体检测试剂盒，购自福建省明溪海天蓝波生物技术有限公司)，在不同环境条件下，同时对12份单纯疱疹病毒II型IgM抗体阳性血清样本进行检测，结果如下：

[0043] 1)实施例1～3和对比例1～2的试剂盒，以及市售试剂盒在常温条件(温度：25±2℃，湿度：58±2％)下对12例血清样本的检测结果均为有效，且12例血清样本的T线均呈深紫红色，与C线颜色基本一致，均显示出阳性；其中，实施例1～3试剂盒在4～6分钟内可判定结果，对比例1～2试剂盒和市售试剂盒在10～20分钟内可判定结果。

[0044] 2)见下表1：实施例1～3试剂盒在低温条件(温度：8±2℃，湿度：58±2％)下对12例血清样本的检测结果均为有效，且均显示出阳性，可在20分钟内判定结果，并且12例血清样本的T线均呈深紫红色，与C线颜色基本一致。而对比例1试剂盒和市售试剂盒在低温环境下均出现了漏检情况，有3例阳性样本检出为阴性，并且层析速度慢，显色时间延长长，并且检测线显色浅，灵敏度和准确度降低；而对比例2试剂盒在低温环境下出现了2例无效，同时显色时间也延长，检测线显色浅，灵敏度和准确度降低。

[0045] 表1各试剂盒在低温条件(温度：8±2℃，湿度：58±2％)下的检测结果[0046]

[0047] (注：表格中的显色时间和显色深浅均针对检测线，“+”表示浅紫红色，“++”表示深紫红色)

[0048] 3)见下表2：实施例1～3试剂盒在高湿条件(温度：25±2℃，湿度：90±2％)下对12例血清样本的检测结果均为有效，且均显示出阳性，可在10～15分钟内判定结果，并且12例血清样本的T线均呈深紫红色，与C线颜色基本一致。而对比例1试剂盒在高湿条件下出现了4例无效，并且有效样本中T线显色均较浅；对比例2试剂盒和市售试剂盒在高湿条件下同样出现了多例无效，并且检测出2例假阴性，与实施例相比，检测灵敏度和准确度均明显降低。

[0049] 另外，在高湿条件下，本发明实施例1～3试剂盒的T线和C线在呈色后60分钟内仍保持清晰不褪色，也没有变宽；而对比例1试剂盒和市售试剂盒的T线和C线在显色后即开始出现褪色、变宽、扩散的现象，对比例2试剂盒的T线和C线在显色后约5分钟后开始出现褪色、变宽、扩散的现象，说明本发明试剂盒能在高湿条件下，在一定时间内能维持T线和C线的稳定，加长结果判定时间。

[0050] 表2各试剂盒在高湿条件(温度：25±2℃，湿度：90±2％)下的检测结果[0051]

[0052] (注：各试剂盒在高湿环境下放置30min后再进行试验，表格中的显色时间和显色深浅均针对检测线，“+”表示浅紫红色，“++”表示深紫红色)

[0053] 本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。