本发明公开了一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法，包括功能化磁珠的制备、脲酶功能化金纳米探针的制备以及标准溶液和样品中CEA含量的检测，该方法也可用于检测甲胎蛋白（AFP）、胰胚胎抗原（POA）、同工酶（NSE）、激素（HCG）等；本发明方法具有操作简单，成本低廉，反应快速的特点，对待测物的定量检测仅需通过肉眼或者简单的紫外‑可见分光光度计即可进行，因而对推广比色免疫分析在临床诊断、医药分析和食品安全等方面的实际应用具有重要的意义。
1.一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：
取25mg/mL羧基化的磁珠4μL，在外部磁场的作用下，用50mM，pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲盐溶液冲洗三遍，向冲洗后的磁珠中加入0.2M 的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和0.2M 的N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液200μL，室温震荡反应30min以活化磁珠表面的羧酸基团，将活化后的磁珠用50mM Tris-HCl溶液冲洗三遍后重新分散于
400μL浓度为50mM，pH=6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，再加入10μL浓度为1mg/mL 癌胚抗原CEA包被抗体，室温震荡反应3h，再加入200μL含2%（w/v）牛血清白蛋白的50mM，pH=
7.4的Tris-甘氨酸溶液，室温震荡封闭反应1h，在外部磁场作用下，将已进行功能化的磁珠用Tris-HCl溶液洗净，重新分散于400μL浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，于4℃保存待用；
取1mL直径为13nm的金纳米粒子于样品管中，用浓度为0.1M Na2CO3溶液调节至pH=8.5，依次加入5μL浓度为1mg/mL的癌胚抗原CEA标记抗体和100μL浓度为2mg/mL的脲酶，混匀组装1.5h后4℃下放置过夜，再将所得产物离心，除去多余的癌胚抗原CEA标记抗体和脲酶，将产物重新分散于0.8mL浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，再向其中加入200μL含2%（w/v）的牛血清白蛋白溶液，室温封闭反应1h后，将得到的脲酶功能化的金纳米粒子经过离心洗净，分散于1mL浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，于4℃保存待用；
分别取制备好的功能化磁珠40μL置于6个样品管中，将浓度为1mg/mL CEA标准溶液用
50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液分别稀释成浓度梯度为0.001，0.01，0.1，1，10，100ng/mL的CEA标准储备溶液，依次将上述6个不同浓度的CEA标准储备液100μL分别置于上述6个样品管中，在37℃震荡培育20min，在外部磁场作用下，用含0.05%（w/v）吐温的浓度为50mM，pH=
7.4的Tris-HCl溶液和Tris-HCl溶液交替洗净，再分别向每个样品管加入100μL的脲酶功能化金纳米探针，在37℃震荡培育20min，将所得产物在外部磁场作用下洗涤三次后，再向样品管中加入浓度为0.25M的尿素和浓度为0.5M的Cu2+混合液100μL，37℃恒温震荡反应
10min，再将所得产物用浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中清洗干净，再向其中加入10μL浓度为0.1M HCl溶液，静置反应5min后向其中加入100μL浓度为10μM铜离子检测试剂，所述铜离子检测试剂是溶于Tris-HCl和四氢呋喃体积比为1/9的溶液中，首先通过肉眼初步观察颜色变化，初步判断标准品中CEA的浓度，再在外部磁场作用下，磁分离取上层清液在紫外可见分光光度计测定标准品中CEA的含量；
取临床血清样品，每个样品分别进行5个平行试验，样品的处理方法同上述标准溶液，检测血清样品中CEA的含量。
一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法
技术领域
[0001] 本发明涉及比色免疫分析技术领域，具体是一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法。
背景技术
[0002] 免疫分析是一种基于抗原-抗体之间的高特异性免疫识别作用而发展起来的高选择性、高灵敏分析方法。免疫分析的理论基础是抗原-抗体之间的特异性反应，即免疫反应。比色免疫分析一般利用抗体或抗原来作为生物敏感元件，在将其固定于某些载体表面后，通过载体表面的抗原-抗体免疫反应来定量捕获示踪标记物，再利用示踪标记物与特定检测试剂生成有色化合物的显色反应为基础，凭借肉眼或紫外-可见分光光度计等简单仪器来比较或测量有色物质溶液深度来建立起定量分析关系，从而实现对特定的靶向分析物的准确检测。
[0003] 癌胚抗原(carcino-embryonic antigen CEA)是一种存在于结肠癌、正常胚胎肠道、胰腺和肝内的一种蛋白多糖复合物。可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌，也存在于正常胚胎的消化管组织中，在正常人血清中也可有微量存在。癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后是一个较好的肿瘤标志物。
[0004] 目前，检测肿瘤标志物普遍采用的是电分析化学和荧光、化学发光、电致化学发光等光学免疫分析方法。与这些方法相比，比色免疫分析所使用的仪器更加简单，且可与磁珠分析平台相结合，操作更加方便、高效。传统比色免疫分析主要采用基于金/银纳米粒子聚集和基于酶/模拟酶催化底物显色反应这两种比色检测策略，前者灵敏度一般较低，后者在酶催化反应中通常面临着检测试剂较为昂贵，显色稳定性较差等缺点。因此，建立一种成本更加低廉，灵敏度更高，且可方便、快速检测肿瘤标志物的免疫分析方法是本技术领域亟待解决的问题。
发明内容
[0005] 本发明的目的就是针对目前检测肿瘤标志物的仪器昂贵、操作繁杂、检测试剂成本高等问题，提供一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法，该方法操作简便，成本低廉，不需要昂贵的仪器和试剂，灵敏度高，反应时间短。
[0006] 本发明的一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法，包括以下步骤：
[0007] （1）功能化磁珠的制备
[0008] 取25mg/mL羧基化的磁珠4μL，在外部磁场的作用下，用50mM，pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲盐溶液冲洗三遍，向冲洗后的磁珠中加入0.2M 的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和0.2M 的N-羟基丁二酰亚胺（NHS）的混合溶液200μL，室温震荡反应30min以活化磁珠表面的羧酸基团，将活化后的磁珠用50mM Tris-HCl溶液冲洗三遍后重新分散于400μL浓度为50mM，pH=6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，再加入10μL浓度为1mg/mL 癌胚抗原CEA包被抗体，室温震荡反应3h，再加入200μL含2%（w/v）牛血清白蛋白的50mM，pH=7.4的Tris-甘氨酸溶液，室温震荡封闭反应1h，在外部磁场作用下，将已进行功能化的磁珠用Tris-HCl溶液洗净，重新分散于400μL浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，于4℃保存待用；
[0009] （2）脲酶功能化金纳米探针的制备
[0010] 取1mL直径为13nm的金纳米粒子于样品管中，用浓度为0.1M Na2CO3溶液调节至pH=8.5，依次加入5μL浓度为1mg/mL的癌胚抗原CEA标记抗体和100μL浓度为2mg/mL的脲酶，混匀组装1.5h后4℃下放置过夜，再将所得产物离心，除去多余的癌胚抗原CEA标记抗体和脲酶，将产物重新分散于0.8mL浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，再向其中加入200μL含
2%（w/v）的牛血清白蛋白溶液，室温封闭反应1h后，将得到的脲酶功能化的金纳米粒子经过离心洗净，分散于1mL浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，于4℃保存待用；
[0011] （3）标准溶液中CEA含量的检测
[0012] 分别取制备好的功能化磁珠40μL置于6个样品管中，将浓度为1mg/mL CEA标准溶液用50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液分别稀释成浓度梯度为0.001，0.01，0.1，1，10，100ng/mL的CEA标准储备溶液，依次将上述6个不同浓度的CEA标准储备液100μL分别置于上述6个样品管中，在37℃震荡培育20min，在外部磁场作用下，用含0.05%（w/v）吐温的浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液和Tris-HCl溶液交替洗净，再分别向每个样品管加入100μL的脲酶功能化金纳米探针，在37℃震荡培育20min，将所得产物在外部磁场作用下洗涤三次后，再向样品管中加入浓度为0.25M的尿素和浓度为0.5M的Cu2+混合液100μL，37℃恒温震荡反应10min，再将所得产物用浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中清洗干净，再向其中加入10μL浓度为0.1M HCl溶液，静置反应5min后向其中加入100μL浓度为10μM铜离子检测试剂，所述铜离子检测试剂是溶于Tris-HCl和四氢呋喃体积比为1/9的溶液中，首先通过肉眼初步观察颜色变化，初步判断标准品中CEA的浓度，再在外部磁场作用下，磁分离取上层清液在紫外可见分光光度计测定标准品中CEA的含量；
[0013] （4）样品中CEA含量的检测
[0014] 取临床血清样品，每个样品分别进行5个平行试验，样品的处理方法同上述标准溶液，检测血清样品中CEA的含量。
[0015] 本发明中的一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法在检测肿瘤标志物中的应用，所述肿瘤标志物为甲胎蛋白（AFP）、胰胚胎抗原（POA）、同工酶（NSE）、激素（HCG）等。
[0016] 本发明基于比色免疫分析的特点，开展了一种快速检测CEA的新型比色免疫分析方法。所述比色免疫分析平台通过抗体功能化磁珠而构建，样品中的肿瘤标记物CEA通过免疫反应被定量捕获到磁珠表面，进一步通过夹心免疫反应定量捕获脲酶功能化金纳米探针于其表面形成免疫复合物，固定在金纳米粒子表面的高含量脲酶催化尿素底物水解，生成的产物与溶液中游离态的铜离子在金纳米粒子表面矿化生成碱式碳酸铜沉淀，外部磁场作用进行分离之后在稀酸的作用下释放出铜离子，加入高效显色剂使溶液产生颜色的变化，从而演变成可测的光信号，该信号与待测样品中CEA的浓度成正相关，通过工作曲线即可得到样品中CEA的含量。本发明中使用的铜离子高效显色剂在专利《一种吡啶腙类化合物及其制备方法和用途》，公布号为CN104529887A中公开。
[0017] 本发明具有操作简单，成本低廉，反应快速的特点，对待测物的定量检测仅需通过肉眼或者简单的紫外-可见分光光度计即可进行，因而对推广比色免疫分析在医药分析、食品安全等方面的实际应用具有重要的意义。
附图说明
[0018] 图1是功能化磁珠的制备及其CEA免疫识别示意图；
[0019] 图2是脲酶功能化金纳米探针的制备示意图；
[0020] 图3是CEA比色免疫检测原理示意图。
具体实施方式
[0021] 实施例1 一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物CEA的比色免疫分析方法，包括以下步骤：
[0022] （1）功能化磁珠的制备
[0023] 取25mg/mL羧基化的磁珠4μL，在外部磁场的作用下，用50mM，pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲盐溶液冲洗三遍，向冲洗后的磁珠中加入0.2M 的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和0.2M 的N-羟基丁二酰亚胺（NHS）的混合溶液200μL，室温震荡反应30min以活化磁珠表面的羧酸基团，将活化后的磁珠用50mM Tris-HCl溶液冲洗三遍后重新分散于400μL浓度为50mM，pH=6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，再加入10μL浓度为1mg/mL 癌胚抗原CEA包被抗体，室温震荡反应3h，再加入200μL含2%（w/v）牛血清白蛋白的50mM，pH=7.4的Tris-甘氨酸溶液，室温震荡封闭反应1h，在外部磁场作用下，将已进行功能化的磁珠用Tris-HCl溶液洗净，重新分散于400μL浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，于4℃保存待用；
[0024] （2）脲酶功能化金纳米探针的制备
[0025] 取1mL直径为13nm的金纳米粒子于样品管中，用浓度为0.1M Na2CO3溶液调节至pH=8.5，依次加入5μL浓度为1mg/mL的癌胚抗原CEA标记抗体和100μL浓度为2mg/mL的脲酶，混匀组装1.5h后4℃下放置过夜，再将所得产物离心，除去多余的癌胚抗原CEA标记抗体和脲酶，将产物重新分散于0.8mL浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，再向其中加入200μL含
2%（w/v）的牛血清白蛋白溶液，室温封闭反应1h后，将得到的脲酶功能化的金纳米粒子经过离心洗净，分散于1mL浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，于4℃保存待用。
[0026] 实施例2 标准溶液中CEA含量的检测
[0027] 分别取制备好的功能化磁珠40μL置于6个样品管中，将浓度为1mg/mL CEA标准溶液用50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液分别稀释成浓度梯度为0.001，0.01，0.1，1，10，100ng/mL的CEA标准储备溶液，依次将上述6个不同浓度的CEA标准储备液100μL分别置于上述6个样品管中，在37℃震荡培育20min，在外部磁场作用下，用含0.05%（w/v）吐温的浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液和Tris-HCl溶液交替洗净，再分别向每个样品管加入100μL的脲酶功能化金纳米探针，在37℃震荡培育20min，将所得产物在外部磁场作用下洗涤三次后，再向样品管中加入浓度为0.25M的尿素和浓度为0.5M的Cu2+混合液100μL，37℃恒温震荡反应10min，再将所得产物用浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中清洗干净，再向其中加入10μL浓度为0.1M HCl溶液，静置反应5min后向其中加入100μL浓度为10μM铜离子检测试剂，所述铜离子检测试剂是溶于Tris-HCl和四氢呋喃体积比为1/9的溶液中，首先通过肉眼初步观察颜色变化，初步判断标准品中CEA的浓度，再在外部磁场作用下，磁分离取上层清液在紫外可见分光光度计测定标准品中CEA的含量，得到的CEA标准溶液工作曲线，见下表1。
[0028] 表1 CEA标准溶液工作曲线
[0029]
[0030] 实施例3 人血清中CEA含量的检测
[0031] 取三个临床血清样品，每个样品分别进行5个平行试验，样品的处理方法同上述标准溶液，经检测样品中CEA的浓度见下表2，将上述三个临床血清样品使用本实施例方法与贝克曼化学发光免疫分析仪的测定结果比较，结果下表2。
[0032] 表2 本实施例与贝克曼化学发光免疫分析仪的测定结果比较
[0033]
[0034] 从上表2可以看出，本实施例测试结果的相对标准偏差（RSD）为1.8-5.6%，相对误差为-3.7-3.1%，说明本实施例的免疫分析方法具有较高的重复性和稳定性。将本实施例的测试结果与贝克曼化学发光免疫分析仪检测结果相比较，1号样品的相对误差为-2.2%，2号样品的相对误差为3.1%，3号样品的相对误差为-3.7%，由此可见，本实施例的免疫分析方法具有较高的准确度。
