香精香料中维生素B的提取和检测方法、试剂盒及应用

摘要

本发明属于香精香料检测技术领域，涉及一种提取香精香料中维生素B的方法，包括如下步骤：(1)将香精香料样品与盐酸溶液混合，得到混合物；(2)将混合物固液分离，得到提取液。本发明还涉及一种检测香精香料中维生素B的方法、以及一种提取和/或检测香精香料中维生素B的试剂盒及其用途。本发明的提取方法能有效并同时提取出香精香料中的维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9，本发明的检测方法能准确并同时检测出香精香料中上述四种维生素B的含量。

权利要求

1.一种同时检测烟用香精香料中维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9的方法，包括如下步骤(1)、(2)、B)、可选的步骤(1-A)及可选的步骤(2-A)：(1)将烟用香精香料样品与盐酸溶液混合，得到混合物；其中，盐酸溶液的摩尔浓度为

0.2-0.3mol/L，烟用香精香料样品与盐酸溶液的比例为1:(70-130)g/mL；

(1-A)将步骤(1)得到的混合物与溶液a混合，得到混合物；其中，所述溶液a中包含乙腈和水，溶液a中乙腈的含量为20％-80％(W/W)；

(2)将步骤(1)或(1-A)得到的混合物固液分离，得到提取液；

(2-A)：将步骤(2)得到的提取液与溶液a混合，固液分离，得到提取液；其中，所述溶液a中包含乙腈和水，溶液a中乙腈的含量为20％-80％(W/W)；

B)采用液相色谱-质谱法对步骤(2)或步骤(2-A)得到的提取液进行检测；其中：色谱柱为Waters Atiantis T3色谱柱；液相色谱的流动相由流动相A和流动相B组成，其中，流动相A为包含7-13mmol/L乙酸铵、0.1％(W/W)甲酸和水的溶液b，流动相B为乙腈；

液相色谱的梯度洗脱程序为：

0分钟，99％(V/V)流动相A；1.0分钟，99％(V/V)流动相A；3.0分钟，1％(V/V)流动相A；

4.0分钟，1％(V/V)流动相A；4.1分钟，99％(V/V)流动相A，保持到7分钟结束；

质谱的电喷雾电压为5000-6000V，离子源温度为500-600℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，溶液a中乙腈的含量为40％-60％(W/W)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)得到的混合物或步骤(2)得到的提取液与溶液a混合的体积比为1:(6-12)。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)得到的混合物或步骤(2)得到的提取液与溶液a混合的体积比为1:(8-10)。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述溶液a中还包含乙酸铵。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，溶液a中乙酸铵的摩尔浓度为7-13mmol/L。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，溶液a中乙酸铵的摩尔浓度为9-11mmol/L。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于如下(a)和/或(b)项：(a)步骤(1)中，所述混合在超声条件下进行；

(b)步骤(2)和/或步骤(2-A)中，所述固液分离包括静置沉淀，收集上清液的步骤。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，烟用香精香料样品与盐酸溶液的比例为1:(90-110)g/mL。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，第(a)项中，步骤(1)中，超声时间为20-60分钟。

11.根据权利要求8所述的方法，其中，第(a)项中，步骤(1)中，超声时间为25-50分钟。

12.根据权利要求8所述的方法，其中，第(b)项中，步骤(2)和/或步骤(2-A)中，静置沉淀的时间为6-13分钟。

13.根据权利要求8所述的方法，其中，第(b)项中，步骤(2)中，所述固液分离还包括将上清液过滤，收集滤液的步骤。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，第(b)项中，步骤(2)中，过滤所用滤膜的孔径为

0.1-1μm。

15.根据权利要求13所述的方法，其中，第(b)项中，步骤(2)中，过滤所用滤膜的孔径为

0.4-0.5μm。

16.根据权利要求1所述的方法，其还包括步骤C)：根据步骤B)的检测结果计算烟用香精香料样品中维生素B的含量。

17.根据权利要求1所述的方法，其中，检测方法使用的内标物包括叶酸-13C5、烟酸-D4和泛酸钙-[13C3，15N]。

18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述液相色谱的操作条件包括如下(A)至(C)中的一项或多项：(A)色谱柱的温度为25-35℃；

(B)进样量为6-14μL；

(C)流动相的流速为0.2-0.6mL/min。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，色谱柱的规格为100mm×3mm i.d.,2.6μm粒径。

20.根据权利要求18所述的方法，其中，第(A)项中，色谱柱的温度为29-33℃。

21.根据权利要求18所述的方法，其中，第(B)项中，进样量为7-13μL。

22.根据权利要求18所述的方法，其中，第(C)项中，流动相的流速为0.3-0.5mL/min。

23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述质谱的操作条件包括如下1)至25)中的一项或多项：

1)离子源为电喷雾电离源(ESI)；

2)扫描方式为正离子扫描；

3)检测方式为多反应监测(MRM)；

4)辅助气Gas1和/或辅助气Gas2的压力为40-70psi；

5)维生素B9的定量离子对为442.0/295.0；

6)维生素B9的定性离子对为442.0/176.0；

7)维生素B9的碰撞能为14-48V；

8)维生素B3的定量离子对为124.0/80.0；

9)维生素B3的定性离子对为124.0/53.0；

10)维生素B3的碰撞能为16-22V；

11)维生素B7的定量离子对为245.1/227.0；

12)维生素B7的定性离子对为245.1/97.0；

13)维生素B7的碰撞能为15-33V；

14)维生素B5的定量离子对为220.1/90.0；

15)维生素B5的定性离子对为220.1/202.0；

16)维生素B5的碰撞能为14-16V；

17)叶酸-13C5的定量离子对为447.0/295.0；

13

18)叶酸- C5的定性离子对为447.0/176.0；

19)叶酸-13C5的碰撞能为14-46V；

20)烟酸-D4的定量离子对为128.0/84.0；

21)烟酸-D4的定性离子对为128.0/56.0；

22)烟酸-D4的碰撞能为15-20V；

23)泛酸钙-[13C3，15N]的定量离子对为224.1/94.0；

24)泛酸钙-[13C3，15N]的定性离子对为224.1/206.0；

25)泛酸钙-[13C3，15N]的碰撞能为14-16V。

24.根据权利要求1所述的方法，其中，质谱的电喷雾电压为5300-5700V。

25.根据权利要求1所述的方法，其中，质谱的离子源温度为540-560℃。

26.根据权利要求23所述的方法，其中，第4)项中，辅助气Gas1和/或辅助气Gas2的压力为48-62psi。

27.根据权利要求23所述的方法，其中，第7)项中，维生素B9的碰撞能为15V或44V。

28.根据权利要求23所述的方法，其中，第10)项中，维生素B3的碰撞能为18V或20V。

29.根据权利要求23所述的方法，其中，第13)项中，维生素B7的碰撞能为16V或32V。

30.根据权利要求23所述的方法，其中，第16)项中，维生素B5的碰撞能为15V。

31.根据权利要求23所述的方法，其中，第19)项中，叶酸-13C5的碰撞能为16V或44V。

32.根据权利要求23所述的方法，其中，第22)项中，烟酸-D4的碰撞能为18V。

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33.根据权利要求23所述的方法，其中，第25)项中，泛酸钙-[ C3，N]的碰撞能为15V。

说明书

香精香料中维生素B的提取和检测方法、试剂盒及应用

技术领域

[0001] 本发明属于香精香料检测技术领域，具体涉及一种提取香精香料中维生素B的方法，还涉及一种检测香精香料中维生素B的方法，还涉及一种提取和/或检测香精香料中维生素B的试剂盒及其应用。

背景技术

[0002] 香精香料涵盖香精和香料两类。其中，香料又称香原料，是一种能被嗅感嗅出的气味或被味感品出香味的物质，一般作为调制香精的原料。香料可分为天然香料、单离香料和合成香料等。天然香料是指动物性或植物性香料；单离香料是指用物理或化学方法由天然香料中分出的单体香料；合成香料是运用不同原料经化学或生物合成而制备出的香料。香精是由两种或两种以上的香料按一定比例混合调配出来的混合物，也称为调和香料。目前，我国可生产各类香精香料约七百余种，其中天然香精香料有一百四十余种，包括精油、浸膏、精油、油树脂等，这些香精香料主要用于日用化工、烟用、医药、食品等领域。

[0003] 维生素B是所有人体组织必不可少的营养素，是食物释放能量的关键。其中，维生素B3，又名烟酸(Niacin，NA)或者尼克酸，其耐热、能升华，烟酸在人体内转化为烟酰胺，烟酰胺能够促使辅酶I和辅酶Ⅱ参与体内脂质代谢、组织呼吸的氧化过程以及糖类无氧分解的过程。人体若缺乏烟酸，容易患糙皮病，表现为皮炎、舌炎、腹泻、烦躁、失眠和感觉异常等症状。维生素B5，又名泛酸或遍多酸，泛酸是辅酶A的组成部分，参与体内蛋白质、碳水化合物的生理代谢，尤其是对脂肪的合成和代谢起着十分重要的作用。维生素B7，又名生物素，生物素最重要的生理学作用是作为羧化酶、羧基转移酶和脱羧酶的辅酶参与人体的糖类、脂肪和氨基酸代谢及能量传递过程。维生素B7长期摄入不足会影响蛋白质及RNA的合成，降低身体免疫力。维生素B9，又名叶酸(Folate，FA)，广泛存在于柑橘类水果、十字花科蔬菜、豆类、谷物和肝脏中，叶酸是嘌呤和嘧啶合成所必须的物质，叶酸的缺乏会导致巨红细胞型贫血、癌症及神经障碍等多种疾病。以上四种维生素B为人体必需的维生素，检测这四种维生素B的含量对健康医学的研究有重要意义。

[0004] 目前，叶酸、烟酸、生物素和泛酸四种维生素B的检测主要是针对于奶粉、玉米、鸡蛋等食品，常用的分析方法包括微生物法、高效液相色谱法和生物传感器法。但是，这几种分析方法存在一定程度上的不足：微生物法操作繁琐，重现性差；液相色谱法存在严重的杂质干扰，色谱柱对四种维生素B的分离能力和检测器对四种维生素B的分辨能力均较差，而且无法检测出含量较低的物质；生物传感器法容易受样品基质的干扰，基质效应严重。目前，尚无同时检测出食品样品中叶酸、烟酸、生物素和泛酸四种维生素B的报道。

[0005] 与食品样品相比，香精香料尤其是烟用香精香料的成分更多，含量组成更为复杂，更易对成分检测造成干扰。正是出于这一原因，至今尚无检测香精香料尤其是烟用香精香料中叶酸、烟酸、生物素和泛酸的报道，更加没有同时检测上述这四种维生素B的报道。

[0006] 目前，需要一种同时检测香精香料中叶酸、烟酸、生物素和泛酸四种维生素B的方法。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种能同时并有效提取香精香料(尤其是烟用香精香料)中的四种维生素B(维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9)的方法。本发明还提供了一种能准确同时检测香精香料中四种维生素B(维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9)含量的方法。本发明还提供了一种同时提取和/或检测香精香料中四种维生素的试剂盒。

[0008] 本发明第一方面涉及一种提取香精香料中维生素B的方法，包括如下步骤：

[0009] (1)将香精香料样品与盐酸溶液混合，得到混合物；

[0010] (2)将混合物固液分离，得到提取液；

[0011] 其中，所述维生素B包括维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9中的一种或多种；

[0012] 优选地，所述维生素B为维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9。

[0013] 本发明第一方面的一个实施方式中，在步骤(1)和(2)之间还包括步骤(1-A)：将步骤(1)得到的混合物与溶液a混合，得到混合物；其中，所述溶液a中包含乙腈和水。

[0014] 本发明第一方面的一个实施方式中，其还包括步骤(2-A)：将步骤(2)得到的提取液与溶液a混合，固液分离，得到提取液；其中，所述溶液a中包含乙腈和水。

[0015] 本发明第一方面的一个实施方式中，其中，溶液a中乙腈的含量为20％-80％(W/W)，优选为40％-60％(W/W)，更优选为50％。

[0016] 本发明第一方面的一个实施方式中，其中，步骤(1)得到的混合物或步骤(2)得到的提取液与溶液a混合的体积比为1:(6-12)，优选为1:(8-10)，例如1:9或1:10。

[0017] 本发明第一方面的一个实施方式中，其中，所述溶液a中还包含乙酸铵；

[0018] 优选地，溶液a中乙酸铵的摩尔浓度为7-13mmol/L，更优选为9-11mmol/L，进一步优选为10mmol/L。

[0019] 本发明第一方面的一个实施方式中，其还包括如下(a)至(f)中的一项或多项：

[0020] (a)步骤(1)中，盐酸溶液的摩尔浓度为0.1-0.3mol/L，优选为0.15-0.3mol/L，更优选为0.2mol/L；

[0021] (b)步骤(1)中，香精香料样品与盐酸溶液的比例为1:(70-130)(g/mL)，优选为1:(90-110)(g/mL)，更优选为1:100(g/mL)；

[0022] (c)步骤(1)中，所述混合在超声条件下进行；

[0023] 优选地，超声时间为20-60分钟，更优选为25-50分钟，进一步优选为30分钟；

[0024] (d)步骤(2)和/或步骤(2-A)中，所述固液分离包括静置沉淀，收集上清液的步骤；

[0025] 优选地，静置沉淀的时间为6-13分钟，更优选为10分钟；

[0026] 优选地，步骤(2)中，所述固液分离还包括将上清液过滤，收集滤液的步骤；

[0027] 更优选地，过滤所用滤膜的孔径为0.1-1μm，进一步优选为0.4-0.5μm，更进一步优选为0.45μm；

[0028] (e)所述香精香料样品为烟用香精香料样品；

[0029] (f)所述提取方法为同时提取香精香料中维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9的方法。

[0030] 本发明第二方面涉及一种检测香精香料中维生素B的方法，包括如下步骤：

[0031] A)采用本发明第一方面任一所述提取方法对香精香料样品进行前处理，将步骤(2)得到的提取液或步骤(2-A)得到的提取液作为待测样品；

[0032] B)采用液相色谱-质谱法对待测样品进行检测；

[0033] 优选地，所述检测方法还包括步骤C)：根据步骤B)的检测结果计算香精香料样品中维生素B的含量；

[0034] 优选地，所述检测方法使用的内标物包括叶酸-13C5、烟酸-D4和泛酸钙-[13C3，15N]；

[0035] 更优选地，泛酸、生物素的检测都采用泛酸钙-[13C3，15N]作为内标物；

[0036] 优选地，所述检测方法为同时检测香精香料中维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9的方法；

[0037] 优选地，所述香精香料样品为烟用香精香料样品。

[0038] 本发明第二方面的一个实施方式中，其中，所述液相色谱的操作条件包括如下(A)至(E)中的一项或多项：

[0039] (A)色谱柱为Waters Atiantis T3色谱柱；

[0040] 优选地，色谱柱的规格为100mm×3mm i.d.,2.6μm粒径；

[0041] (B)色谱柱的温度为25-35℃，优选为29-33℃，更优选为30℃；

[0042] (C)进样量为6-14μL，优选为7-13μL，更优选为10μL；

[0043] (D)流动相为甲醇溶液或者流动相由流动相A和流动相B组成；

[0044] 优选地，流动相A为包含有乙酸铵和水的溶液b，流动相B为乙腈；

[0045] 更优选地，溶液b中乙酸铵的摩尔浓度为7-13mmol/L，进一步优选为10mmol/L；

[0046] 更优选地，溶液b还包含0.1％(W/W)的甲酸；

[0047] 优选地，梯度洗脱程序为：

[0048]时刻(分钟) 流动相中流动相A的体积百分数
0 99％
1.0 99％
3.0 1％
4.0 1％
4.1 99％
7 结束

[0049] 即梯度洗脱程序为：0分钟，99％(V/V)流动相A；1.0分钟，99％(V/V)流动相A；3.0分钟，1％(V/V)流动相A；4.0分钟，1％(V/V)流动相A；4.1分钟，99％(V/V)流动相A，保持到7分钟结束；

[0050] (E)流动相的流速为0.2-0.6mL/min，优选为0.3-0.5mL/min，更优选为0.4mL/min。

[0051] 本发明第二方面的一个实施方式中，其中，所述质谱的操作条件包括如下1)至27)中的一项或多项：

[0052] 1)离子源为电喷雾电离源(ESI)；

[0053] 2)扫描方式为正离子扫描；

[0054] 3)检测方式为多反应监测(MRM)；

[0055] 4)电喷雾电压为5000-6000V，优选为5300-5700V，更优选为5500V；

[0056] 5)离子源温度为500-600℃，优选为540-560℃，更优选为550℃；

[0057] 6)辅助气Gas1和/或辅助气Gas2的压力为40-70psi，优选为48-62psi，更优选为50psi或60psi；

[0058] 7)维生素B9的定量离子对为442.0/295.0；

[0059] 8)维生素B9的定性离子对为442.0/176.0；

[0060] 9)维生素B9的碰撞能为14-48V，优选为15V或44V；

[0061] 10)维生素B3的定量离子对为124.0/80.0；

[0062] 11)维生素B3的定性离子对为124.0/53.0；

[0063] 12)维生素B3的碰撞能为16-22V，优选为18V或20V；

[0064] 13)维生素B7的定量离子对为245.1/227.0；

[0065] 14)维生素B7的定性离子对为245.1/97.0；

[0066] 15)维生素B7的碰撞能为15-33V，优选为16V或32V；

[0067] 16)维生素B5的定量离子对为220.1/90.0；

[0068] 17)维生素B5的定性离子对为220.1/202.0；

[0069] 18)维生素B5的碰撞能为14-16V，优选为15V；

[0070] 19)叶酸-13C5的定量离子对为447.0/295.0；

[0071] 20)叶酸-13C5的定性离子对为447.0/176.0；

[0072] 21)叶酸-13C5的碰撞能为14-46V，优选为16V或44V；

[0073] 22)烟酸-D4的定量离子对为128.0/84.0；

[0074] 23)烟酸-D4的定性离子对为128.0/56.0；

[0075] 24)烟酸-D4的碰撞能为15-20V，优选为18V；

[0076] 25)泛酸钙-[13C3，15N]的定量离子对为224.1/94.0；

[0077] 26)泛酸钙-[13C3，15N]的定性离子对为224.1/206.0；

[0078] 27)泛酸钙-[13C3，15N]的碰撞能为14-16V，优选为15V。

[0079] 本发明第三方面涉及一种提取和/或检测香精香料中维生素B的试剂盒，其包含：

[0080] 盐酸溶液、含有乙酸铵的乙腈水溶液和孔径为0.4-0.5μm的滤膜；

[0081] 其中，所述维生素B包括维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9中的一种或多种。

[0082] 本发明第三方面的一个实施方式中，所述维生素B为维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9。

[0083] 本发明第三方面的一个实施方式中，所述试剂盒中还包含：Waters Atiantis T3色谱柱、含有甲酸的乙酸铵水溶液和乙腈。

[0084] 本发明第三方面的一个实施方式中，所述试剂盒中还包含：叶酸-13C5、烟酸-D4和13 15
泛酸钙-[ C3，N]。

[0085] 本发明第三方面的一个实施方式中，其还包括如下(Ⅰ)至(Ⅸ)中的一项或者多项：

[0086] (Ⅰ)盐酸溶液的摩尔浓度为0.1-0.3mol/L，优选为0.15-0.3mol/L，更优选为0.2mol/L；

[0087] (Ⅱ)含有乙酸铵的乙腈水溶液中乙腈的含量为20％-80％(W/W)，优选为40％-60％(W/W)，更优选为50％(W/W)；

[0088] (Ⅲ)含有乙酸铵的乙腈水溶液中乙酸铵的摩尔浓度为7-13mmol/L，优选为9-11mmol/L，更优选为10mmol/L。

[0089] (Ⅳ)滤膜的孔径为0.45μm；

[0090] (Ⅴ)色谱柱的规格为100mm×3mm i.d.,2.6μm粒径；

[0091] (Ⅵ)含有甲酸的乙酸铵水溶液中乙酸铵的摩尔浓度为7-13mmol/L，优选为10mmol/L；

[0092] (Ⅶ)含有甲酸的乙酸铵水溶液中甲酸的含量为0.1％(W/W)；

[0093] (Ⅷ)所述试剂盒为同时提取和/或检测香精香料中维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9的试剂盒；

[0094] (Ⅸ)所述香精香料为烟用香精香料。

[0095] 本发明第四方面涉及本发明第一方面任一所述的试剂盒在提取和/或检测香精香料中维生素B中的用途；所述维生素B包括维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9中的一种或多种；

[0096] 优选地，所述维生素B为维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9；

[0097] 优选地，所述香精香料为烟用香精香料。

[0098] 本发明中，如无特别说明，

[0099] 术语“香精香料”涵盖香精和香料两类。其中，香料又称香原料，是一种能被嗅感嗅出的气味或被味感品出香味的物质，一般作为调制香精的原料。香料可分为天然香料、单离香料和合成香料等。香精是由两种或两种以上的香料按一定比例混合调配出来的混合物，也称为调和香料。

[0100] 术语“维生素B”旧称维他命B，是B族维生素的总称，它们常常来自于相同的食物来源，如酵母等，属于水溶性维生素,是所有人体组织必不可少的营养素，是食物释放能量的关键。维生素B有十二种以上，包括维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B8、维生素B9、维生素B12、维生素B13、维生素B15、维生素B17。

[0101] 术语“维生素B3”又名烟酸(Niacin，NA)或者尼克酸，其耐热、能升华，烟酸在人体内转化为烟酰胺，烟酰胺能够促使辅酶I和辅酶Ⅱ参与体内脂质代谢、组织呼吸的氧化过程以及糖类无氧分解的过程。

[0102] 术语“维生素B5”又名泛酸或遍多酸，泛酸是辅酶A的组成部分，参与体内蛋白质、碳水化合物的生理代谢，尤其是对脂肪的合成和代谢起着十分重要的作用。

[0103] 术语“维生素B7”又名生物素，生物素最重要的生理学作用是作为羧化酶、羧基转移酶和脱羧酶的辅酶参与人体的糖类、脂肪和氨基酸代谢及能量传递过程。

[0104] 术语“维生素B9”又名叶酸(Folate，FA)，广泛存在于柑橘类水果、十字花科蔬菜、豆类、谷物和肝脏中，叶酸是嘌呤和嘧啶合成所必须的物质，叶酸的缺乏会导致巨红细胞型贫血、癌症及神经障碍等多种疾病。

[0105] 术语“烟用香精香料”是指由多种烟用香料按一定配比并加入适当溶剂和可选的适用辅料调配出来的，具有一定香型、可专供各种烟草制品加香矫味使用的添加剂。

[0106] 术语“超声”是指频率高于20000赫兹的声波。

[0107] 术语“过滤”是指推动力或者其他外力作用下悬浮液中的液体透过介质，固体颗粒及其他物质被过滤介质截留，从而使固体及其他物质与液体分离的操作。

[0108] 术语“内标物”是指采用内标法定量分析时，加入到已知量试样中的已知量标准物质。

[0109] 术语“色谱柱”是指装填有固定相用以分离混合组分的柱管。

[0110] 术语“流动相”是指在色谱分离中用以携带试样及洗脱组分的气体或液体。

[0111] 术语“梯度洗脱”又称为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。

[0112] 术语“离子源”是指质谱分析粒子加速器中，使样品分子发生离解产生快速运动的离子的部件。

[0113] 术语“试剂盒”是指用于盛放所需要的化学试剂及实验室用品的盒子。

[0114] 本发明取得的有益效果：

[0115] 1、本发明的提取方法，能同时并有效提取出香精香料样品中的维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9。

[0116] 2、本发明的检测方法，能同时并准确检测出香精香料样品中维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9的含量。

[0117] 3、本发明的试剂盒可用于同时提取和/或检测香精香料样品中的维生素B3、维生素B5、维生素B7和维生素B9。

附图说明

[0118] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

[0119] 图1为本发明实施例1中30ng/mL标准溶液的色谱图。

[0120] 图2为本发明实施例4中盐酸溶液浓度与叶酸、烟酸、生物素和泛酸回收率之间关系的柱形图。

具体实施方式

[0121] 实施例1

[0122] 1、材料

[0123] 烟用香精香料：为华宝香精股份有限公司的烟用香精。

[0124] 叶酸标准品：购买自百灵威科技公司，纯度96％。

[0125] 烟酸标准品：购买自百灵威科技公司，纯度97％。

[0126] 生物素标准品:购买自百灵威科技公司，纯度99％。

[0127] 泛酸标准品：购买自百灵威科技公司，纯度95％。

[0128] 叶酸-13C5标准品：购买自百灵威科技公司，纯度99％。

[0129] 烟酸-D4标准品：购买自百灵威科技公司，纯度99％。

[0130] 泛酸钙-[13C3，15N]标准品：购买自百灵威科技公司，纯度98％。

[0131] 2、检测方法

[0132] (1)制备提取液：

[0133] 取0.1g香精香料(精确至0.0001g)作为样品，置于50mL锥形瓶中，加入10mL 0.2mol/L的盐酸水溶液，超声混合30分钟，静置10分钟，分离出上清液并定容至10mL。将上清液过0.45μm的滤膜，取1mL滤液，用重量比为1:1的乙腈和水混合形成的溶液(含10mmol/L乙酸铵)定容至10.0mL，混合均匀，静置10分钟，分离出上清液即提取液。

[0134] (2)配制标准溶液：

[0135] 分别取10.0mg的叶酸标准品、烟酸标准品、生物素标准品和泛酸标准品，分别置于四个100mL棕色容量瓶中，用50％(W/W)甲醇水溶液稀释至刻度，配成浓度均为0.1mg/mL的四种标准储备液。将四种标准储备液各取1.0mL，放入一个100mL容量瓶中，用50％(W/W)甲醇水溶液稀释至刻度，配制成叶酸、烟酸、生物素和泛酸的浓度均为1.0μg/mL的混合标准溶液。

[0136] 分别取10.0mg的叶酸-13C5标准品、烟酸-D4标准品和泛酸钙-[13C3，15N]标准品，分别置于三个10mL棕色容量瓶中，用50％(W/W)甲醇水溶液稀释至刻度，配成浓度均为1.0mg/mL的三种内标储备液。移取1.0mL的叶酸-13C5储备液、1.0mL的烟酸-D4储备液和1.0mL的泛酸钙-[13C3，15N]储备液，放入一个100mL容量瓶中，用50％(W/W)甲醇水溶液稀释至刻度，配13 13 15
成叶酸- C5，烟酸-D4和泛酸钙-[ C3，N]浓度均为10.0μg/mL的混合内标溶液。

[0137] 分别移取0.05mL、0.1mL、0.5mL、1.0mL、3.0mL、5.0mL和10.0mL的混合标准溶液，分别置于不同的100mL容量瓶中，再向每个容量瓶中加入0.5mL混合内标溶液，用50％(W/W)甲醇水溶液定容至刻度，分别配制成叶酸、烟酸、生物素和泛酸四种物质浓度均为0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的系列浓度标准溶液，其中，内标物叶酸-13C5，烟酸-D4和泛酸钙-[13C3，15N]的浓度均为50.0ng/mL。

[0138] 泛酸、生物素的测定都采用泛酸钙-[13C3，15N]作为内标。若样品浓度超出了系列浓度标准溶液的浓度范围，可适当扩展溶液浓度的范围。

[0139] (3)液相色谱串联质谱分析：

[0140] 利用液相色谱串联质谱仪(AB公司，Qtrap5500)分别对系列浓度标准溶液和提取液检测分析。其中，30ng/mL标准溶液的色谱图如图1所示。

[0141] 其中，液相色谱的操作条件如下：

[0142] 采用Waters Atiantis T3色谱柱，色谱柱的规格为100mm×3mm i.d.,2.6μm粒径；

[0143] 色谱柱温度为30℃；

[0144] 进样量为10μL；

[0145] 流动相：流动相A为10mmol/L乙酸铵水溶液(其中，甲酸的重量百分数为0.1％)，流动相B为乙腈；

[0146] 梯度洗脱程序如表1：

[0147] 表1

[0148]时刻(分钟) 流动相中流动相A的体积百分数
0 99％
1.0 99％
3.0 1％
4.0 1％
4.1 99％
7 结束

[0149] 流速为0.4mL/min。

[0150] 质谱操作条件如下：

[0151] 离子源：电喷雾电离源(ESI)；

[0152] 扫描方式：正离子扫描；

[0153] 检测方式：多反应监测(MRM)；

[0154] 电喷雾电压：5500V；

[0155] 离子源温度：550℃；

[0156] 辅助气Gas1压力：60psi；辅助气Gas2压力：50psi；

[0157] 各分析物的定量离子对、定性离子对及相应的碰撞能(CE)见表2。

[0158] 表2

[0159]

[0160]

[0161] (4)计算样品中四种维生素含量：

[0162] 根据(3)中系列浓度标准溶液的检测结果，对各标准溶液中叶酸、烟酸、生物素和泛酸的峰面积和其对应内标物峰面积的比值(y)和其浓度比值(x)进行线性回归分析，分别得到叶酸、烟酸、生物素和泛酸的线性回归方程。将0.5ng/mL标准溶液连续稀释，以3倍和10倍信噪比(S/N)来作为分析方法的检出限和定量限。结果如表3所示。

[0163] 表3

[0164]化合物 线性方程 相关系数 检出限(ng/mL) 定量限(ng/mL)
叶酸 y＝0.0299x+0.0928 0.9997 0.1 0.4
烟酸 y＝0.078x-1.49 0.9996 0.03 0.1
生物素 y＝0.0279x-0.377 0.9994 0.03 0.1
泛酸 y＝0.00999x-0.1 0.9995 0.03 0.1

[0165] 本发明检测方法的线性相关性较好，检出限为0.03-0.1ng/mL。

[0166] 将由提取液检测的四种维生素的峰面积与内标物峰面积的比值代入表3的线性方程中，分别得到提取液中四种维生素的含量。再通过下式计算得到香精香料样品中四种维生素的含量。

[0167] m＝10×(A×S)/n

[0168] 其中，

[0169] m-香精香料样品中维生素B的含量(μg/g)；

[0170] A-提取液中维生素B的含量(μg/mL)；

[0171] S-提取液体积(mL)；

[0172] n-香精香料样品的重量(g)。

[0173] 本实施例的香精香料样品中，叶酸含量为0.64μg/g，烟酸含量为61.35μg/g，生物素含量为5.28μg/g，泛酸含量为21.07μg/g。

[0174] 实施例2

[0175] 参照实施例1的方法重复测定5次，计算包括实施例1在内的6次测定的平均值和相对标准偏差，结果见表4。

[0176] 表4

[0177]

[0178] 由表4可知，本发明方法检测香精香料样品中叶酸、烟酸、生物素和泛酸的相对标准偏差均小于6％，其中，检测烟酸、生物素和泛酸的相对标准偏差小于5％，表明本发明检测方法的重复性较好。

[0179] 实施例3

[0180] 向多份同重量的实施例1香精香料样品中分别加入叶酸、烟酸、生物素和泛酸标准品。每种标准品考察三个加入浓度，每个加入浓度平行测试三次，计算叶酸、烟酸、生物素和泛酸的回收率，结果见表5-8。

[0181] 表5叶酸回收率

[0182]

[0183]

[0184] *测定方法参照实施例1。

[0185] 表6烟酸回收率

[0186]

[0187] *测定方法参照实施例1。

[0188] 表7生物素回收率

[0189]

[0190] *测定方法参照实施例1。

[0191] 表8泛酸回收率

[0192]

[0193] *测定方法参照实施例1。

[0194] 由表5-8可知，本发明检测方法对叶酸、烟酸、生物素和泛酸四种物质的回收率在92.7％-98.7％之间，符合化学检测的要求。

[0195] 实施例4

[0196] 分别用0.1mol/L的盐酸水溶液、0.3mol/L的盐酸水溶液和0.4mol/L的盐酸水溶液代替制备提取液步骤中的0.2mol/L盐酸水溶液，其余参照实施例3进行，结果如图2所示。

[0197] 图2表明，盐酸水溶液浓度为0.1mol/L时，叶酸、烟酸、生物素和泛酸四种物质的回收率比较低；当盐酸水溶液浓度达到0.4mol/L时，杂质干扰较为严重；而盐酸水溶液浓度为0.2-0.3mol/L时，回收率较好，并且，盐酸水溶液浓度为0.2mol/L时，回收率最佳。

[0198] 对比例1提取溶剂的影响

[0199] 分别用水、0.2mol/L氢氧化钠溶液、甲醇代替实施例1中0.2mol/L的盐酸水溶液，其余参照实施例1进行。

[0200] 结果表明：与实施例1相比，采用水、0.2mol/L氢氧化钠溶液、甲醇分别作提取溶剂时，检测信号的强度均较弱，响应值均较低。

[0201] 对比例2不加含乙酸铵的乙腈水溶液的影响

[0202] 采用水代替重量比为1:1的乙腈和水混合形成的溶液(含10mmol/L乙酸铵)进行定容，其余参照实施例1进行。

[0203] 结果表明：与实施例1相比，对比例2检测得到的谱图中杂峰较多，杂质干扰较为严重。

[0204] 对比例3色谱柱的影响

[0205] 用Agilent Kinetex C18色谱柱代替实施例1中的Waters Atiantis T3色谱柱，其余参照实施例1进行。

[0206] 结果表明：Agilent Kinetex C18色谱柱上生物素和泛酸拖尾严重。使用Atiantis T3色谱柱保留效果好，仪器响应值较高，能够很好的满足实验要求。

[0207] 对比例4流动相和洗脱程序的影响

[0208] 用如下的流动相和洗脱程序代替实施例1的流动相和梯度洗脱程序，其余参照实施例1进行。

[0209] 流动相A为水，流动相B为乙腈，采用等度洗脱：流动相A和B的体积比始终为1:1，洗脱时间与实施例1相同。

[0210] 结果表明：与实施例1相比，对比例4检测得到的谱图中叶酸、烟酸、生物素和泛酸四种维生素B的峰型拖尾均比较严重。

[0211] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。