原百部碱在制备抗哮喘药物中的用途

摘要

本发明公开了一种原百部碱在制备抗哮喘药物中的用途。所述哮喘为DRA诱导型哮喘或Th2介导的哮喘。本发明首次公开了百部的主要活性成分‑原百部碱对哮喘具有显著的抑制作用；说明原百部碱用于临床哮喘的治疗具有重要的价值，为寻找抗哮喘药物提供了新的方向。

权利要求

1.原百部碱作为唯一活性成分在制备治疗或抑制哮喘药物中的用途，所述哮喘为DRA诱导型哮喘。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，以所述原百部碱为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备成药物制剂使用。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物制剂选自片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、喷雾剂、缓释剂中的一种。

说明书

原百部碱在制备抗哮喘药物中的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及药品开发应用技术领域及药物治疗学领域，具体涉及一种原百部碱在制备抗哮喘药物中的用途。

背景技术

[0002] 哮喘是气道慢性炎症性疾病，由免疫系统中的淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞以及上皮细胞共同参与的复杂炎症病理过程。在变应原(过敏原)的作用下，病人出现支气管反应性增加、粘液产生增多、气道壁重塑和气道腔缩小等气道高反应性变化，从而导致短时间内呼吸困难、哮鸣和胸部压迫感。哮喘属于当今社会高发疾病，每10位儿童或12位成年人中就有1位是哮喘患者。在世界范围内，有超过3亿的哮喘发病人群，仅在美国，用于该疾病的总花费每年就超过180亿美元。临床上，皮质类固醇和β肾上腺素能激动剂可以短期控制症状，但是这些药物的长期使用，极易产生耐受。除此之外，约有5％-10％严重哮喘患者对现有药物耐受，无法治愈，全球每年约有30万人因哮喘而丧生。随着空气污染等环境因素变化，哮喘发病率在逐年增加，预计2025年患病人数将达到4亿。因此，寻找并发现潜在的哮喘治疗药物，有效提高病人的生活质量，显得迫在眉睫，也极具药物开发的商业价值。

[0003] 百部为多年生草本，始载于《名医别录》，历代草本均有记载，该药性甘、味苦、归肺经，具有润肺止咳等的功效。在2010版《中国药典》中，以百部科植物直立百部、蔓生百部和对叶百部的干燥块根作为正品百部入药。目前对百部活性的研究主要集中于其提取物上，用于治疗哮喘、肺结核、百日咳等呼吸系统疾病。百部碱是百部主要活性成分之一，依据结构可将百部碱分为斯替宁碱型、原百部碱型、对叶百部螺碱型、蔓生百部碱型和细花百部碱型。其中原百部碱在百部科植物中分布最为广泛。目前，针对原百部碱这一单体成分的活性研究鲜有报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种原百部碱在制备抗哮喘药物中的用途。本发明首次公开了百部的主要活性成分原百部碱对哮喘的治疗作用。本发明选用了与诱发人体哮喘最为接近的变应原DRA(Dust mite，Ragweed，Aspergillus)作为实验性哮喘的诱导剂，使模型更加贴近疾病本身，实验结果能更好地反映药物的治疗作用。

[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

[0006] 本发明涉及一种原百部碱在制备治疗或抑制哮喘药物中的用途。

[0007] 优选的，所述哮喘为DRA诱导型哮喘。

[0008] 优选的，所述哮喘Th2介导的哮喘。

[0009] 优选的，以所述原百部碱为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药物制剂使用。

[0010] 优选的，所述药物制剂选自片剂、粉剂、颗粒剂、喷雾剂、缓释剂中的一种。

[0011] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0012] 大多数哮喘患者的致敏原为环境中的多种抗原，但在多数实验动物模型中只使用一种过敏原，比如卵清蛋白、蟑螂等，不能反应患者发病机制的本质。本发明采用患者常见的尘螨、豚草、曲霉组成的多敏原复合物(DRA)免疫动物，构建了实验动物哮喘模型。该模型能准确的模拟哮喘的发生发展，在给予原百部碱治疗后，也能更加真实的反映原百部碱的治疗效果，为其临床应用提供了切实可行的依据。

附图说明

[0013] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

[0014] 图1为采用BCA试剂盒对小鼠肺灌洗液上清蛋白浓度的测定结果统计图；

[0015] 图2为对小鼠肺灌洗液离心收集到的细胞PBS悬浮后进行细胞计数的结果统计图；

[0016] 图3为对小鼠肺灌洗液中的细胞与流式抗体SiglecF和CD11c一同孵育，并用流式细胞仪进行分析得到的流式细胞分布图；其中，a为阴性对照组，b为DRA诱导组，c为原百部碱治疗组；

[0017] 图4为对小鼠肺灌洗液中的细胞与流式抗体SiglecF和CD11c一同孵育，并用流式细胞仪进行分析得到的细胞比例统计图；其中，a为嗜酸性粒细胞比例图，b为巨噬细胞比例图；

[0018] 图5为对小鼠肺组织的H&E染色示意图；

[0019] 图6为对小鼠肺组织的PAS染色示意图；

[0020] 图7为收集小鼠肺组织，提取其总RNA后用RT-PCR的方法检测IL-4mRNA的表达情况的示意图。

具体实施方式

[0021] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

[0022] 实施例1

[0023] 本发明使用的化合物原百部碱的结构式如下：

[0024]

[0025] 本发明中，DRA与铝剂的混合物配制方法如下：

[0026] DRA混合物的配制：D(m)：R(m)：A(m)＝1：10：1，溶于PBS，浓度为6mg/ml，在将其与铝剂以体积比1:19进行混合，4℃在混悬仪上混合4-5小时，得DRA与铝剂的混合物。

[0027] 鼻内给予DRA混合物配制：D(m)：R(m)：A(m)＝1：10：1，溶于PBS，浓度为2mg/ml。

[0028] 本实施例中，经动物实验，发现原百部碱对哮喘具有显著治疗作用，实验方法与结果如下：

[0029] 1实验材料

[0030] 1.1实验动物：

[0031] C57/BL小鼠，雄性，体重20-25g，上海交通大学实验动物中心。空调控制室温20-25℃，湿度40-70％，自由饮水，摄食。

[0032] 1.2药品与试剂：

[0033] 原百部碱(Protostemonine，PSN)，用时以乙醇：聚氧乙烯蓖麻油EL：生理盐水＝1：1：8配成所需浓度的药物(1.0mg/ml)。小鼠的给药剂量为20mg/kg。乙醇、聚氧乙烯蓖麻油EL均为分析纯；铝剂佐剂购自Thermo Scientific。

[0034] 1.3主要仪器设备：

[0035] BD LSRFortessa流式细胞仪；多功能酶标仪；显微镜；酶标仪；混悬仪[0036] 2方法与结果

[0037] 2.1构建小鼠哮喘模型

[0038] 小鼠15只，随机分为正常对照组，模型组和治疗(原百部碱)组，每组5只。在建模的第0天和第5天小鼠腹腔注射PBS或DRA和铝剂佐剂的混合物，200μl/只，在第12,13,14天分别鼻内给予PBS或DRA 50μl/只/天，其中治疗组小鼠在第12,13,14天给予DRA刺激的前1小时，以20mg/kg的剂量腹腔注射原百部碱予以治疗；在第15天时收集各组小鼠外周血、肺灌洗液和肺组织进行分析。

[0039] 2.2实验结果

[0040] 2.2.1药物对肺灌洗液上清蛋白浓度的影响

[0041] 对实验中收集的肺灌洗液离心(3000rpm，4℃，5min)，收集上清，采用BCA试剂盒对上清蛋白浓度进行测定，组间采用t检验，实验结果统计如图1所示；

[0042] 图1实验结果显示，在DRA诱导之后，由于组织和血管通透性增加，导致渗入组织的物质增多，表现为灌洗液上清蛋白浓度增加，而在给予原百部碱治疗之后，可以明显降低其蛋白浓度(p<0.05)，说明原百部碱能抑制DRA诱导的哮喘。

[0043] 2.2.2肺灌洗液中细胞总数统计及嗜酸性粒细胞和巨噬细胞比例的统计

[0044] 将实验中收集的肺灌洗液离心(3000rpm，4℃，5min)，收集细胞，PBS悬浮后进行细胞计数，组间采用t检验，实验结果如图2所示；

[0045] 由于在哮喘的发生过程中会有较多的嗜酸性粒细胞等细胞的募集和浸润，组织中的细胞会明显增加，因此，在DRA诱导的小鼠的肺灌洗液中可以收集到较多的细胞，图2实验数据统计结果与此一致，同时在给予药物之后可以显著降低总细胞数，实验组与治疗组具有显著性差异(p<0.01)，从侧面反映了药物对哮喘的治疗作用。

[0046] 另一方面对肺灌洗液中的细胞与流式抗体SiglecF和CD11c一同孵育，并用流式细胞仪进行分析。其中SiglecF+CD11c+为嗜酸性粒细胞，SiglecF+CD11c-为巨噬细胞，流式细胞分布图及两类细胞比例统计图如图3、4所示；

[0047] 从图3的流式细胞分析结果来看，在阴性对照组小鼠的肺灌洗液中以巨噬细胞为主，而在DRA诱导之后，由于有嗜酸性粒细胞的募集和浸润，可以看到嗜酸性粒细胞的比例明显增高，导致巨噬细胞的比例相对减少，这也可以在一定程度上反映哮喘的严重程度。由图4可知，给予原百部碱治疗组，嗜酸性粒细胞所占总细胞的比例较模型组显著(p<0.01)下降，表明原百部碱能够减轻DRA诱导的哮喘的病变。

[0048] 2.2.3肺组织病理切片分析

[0049] 将收集的肺组织进行固定、脱水、浸蜡、包埋后切片、染色。分别进行H&E染色和PAS染色。结果如图5、6；

[0050] 图5中，H&E染色反映的是炎性细胞的浸润情况，从病理切片染色结果可以明显看出DRA诱导之后肺组织炎性细胞浸润明显增多，直观地反映了哮喘的严重程度，治疗组减弱了该症状，表现出对哮喘的缓解作用。

[0051] 图6中，PAS染色是对哮喘发生过程中增生的杯状细胞所分泌的粘液中的糖原进行染色，呈紫红色，定位于胞浆，因此在DRA诱导的模型组中可以清楚的看到被染成紫红色的阳性细胞，这表明DRA诱导了哮喘的发生。药物治疗后几乎未见被染成紫红色的细胞，反映出原百部碱对哮喘的治疗效果。

[0052] 2.2.4药物对哮喘发生过程中相关信使RNA(mRNA)表达的影响

[0053] 对于哮喘的发病机制，目前认为是当机体受到变应原刺激，上皮细胞受到损伤，释放白细胞介素25(IL-25)和IL-33，进一步活化Th2细胞，使IL-4、IL-5和IL-13分泌增多，IL-5使嗜酸性粒细胞活化和募集及气道高反应性，同时，IL-4和IL-13可以导致杯状细胞组织转移，粘液分泌增多，并活化B细胞释特异性IgE，其和IL-4可以使肥大细胞活化，导致气管收缩，最终致哮喘的发生。

[0054] 因此我们对哮喘发生过程中所涉及的信使RNA(IL-4)的表达进行了检测。即，将实验中各组小鼠的肺组织收集，并提取其总RNA，用RT-PCR的方法检测IL-4mRNA的表达情况。统计结果如图7所示；

[0055] 从图7的实验统计结果可以看出，DRA刺激小鼠后会导致IL-4mRNA表达上调，原百部碱可以显著(p<0.05)降低这种上调作用，从免疫学的角度展现了原百部碱对哮喘的抑制作用。

[0056] 实施例2

[0057] 片剂的制备：

[0058] 取原百部碱300g，加入适量淀粉制成颗粒，加入硬脂酸镁适量，混匀，压制成口服片剂1000片，每天2次，每次2片。

[0059] 实施例3

[0060] 胶囊剂的制备:

[0061] 取原百部碱300g，加入适量稀释剂，混匀，分装填入空胶囊即得。制成胶囊剂1000粒，每天2次，每次2粒。

[0062] 实施例4

[0063] 颗粒剂的制备

[0064] 取原百部碱40g，加入蔗糖670g以及辅料糊精290g，混匀，用滚筒平压制粒机制粒，得原百部碱颗粒1000g，每次1包(10g)，每日3次。

[0065] 结论：本实验研究结果表明，本发明的原百部碱对哮喘具有显著的抑制作用。说明原百部碱用于临床哮喘的治疗具有重要的价值，为寻找抗哮喘药物提供了新的方向。

[0066] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。