一种用于多元蛋白复合物表达的成套载体及其应用

摘要

本发明公开了一种用于多元蛋白复合物表达的成套载体及其应用。该成套载体分为单基因表达载体和共表达接收载体两部分，蛋白复合物各组分可并行克隆到不同的单基因表达载体中，然后将单基因表达载体和共表达载体在同一管中进行组装反应，即可得到蛋白复合物共表达载体。通过试验证明：本发明通过IIs型限制性内切酶的设计，可使酶切和连接在同一管中进行，中间不需要酶切产物纯化等操纵，同时，本发明的设计可以将多个蛋白的转录单元一次实验同时组装到共表达载体上，因此共表达载体的组装极大地缩短了克隆时间，而且不同抗性以及ccdB筛选，提高了克隆的效率，另外，共表达载体转录出单顺反子mRNA，可提高蛋白表达量。

权利要求

1.一种用于在大肠杆菌进行多元蛋白复合物表达的成套产品，由m个核心片段和共表达载体组成；

所述m为大于等于1小于等于6的整数；所述m个核心片段按照阿拉伯数字顺次命名为核心片段A1、核心片段A2、……和核心片段Am；

所述核心片段A1从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N、粘性末端1x、用于构建外源基因表达盒的DNA片段和粘性末端1y、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；

所述核心片段A2从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N、粘性末端2x、用于构建外源基因表达盒的DNA片段和粘性末端2y、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；

依次类推，

所述核心片段Am从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N粘性末端mx、用于构建外源基因表达盒的DNA片段、粘性末端my、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；

每个所述核心片段经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的用于构建外源基因表达盒的DNA片段上游黏性末端和所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段下游黏性末端不同且不匹配；

所述共表达载体由核心片段A和骨架载体组成；

所述共表达载体的核心片段A从5’端起依次包括粘性末端Ax、单碱基N、所述IIs型限制性内切酶1的识别序列、筛选标记基因、所述IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N和粘性末端Ay；

所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的骨架载体上游黏性末端和所述骨架载体下游黏性末端不同且不匹配；

所述核心片段A1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端1y和所述核心片段A2经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端2x匹配；

所述核心片段A2经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端2y和所述核心片段A3经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端3x匹配；

依次类推；

所述核心片段A m-1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端（m-1）y和所述核心片段A m经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端mx匹配；

所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端Ax和所述核心片段A1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端1x匹配；

所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端Ay和所述核心片段A m经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端my匹配；

所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子；

或，所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、核糖体结合位点、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子；

或，所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、乳糖操纵子、核糖体结合位点、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子；

或，所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、乳糖操纵子、核糖体结合位点、蛋白纯化标签、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子；

每个所述核心片段经过所述IIs型限制性内切酶2酶切产生的筛选标记基因上游黏性末端和所述筛选标记基因下游黏性末端不同且不匹配；

每个所述IIs型限制性内切酶酶切产生的粘性末端内部均不能形成回文结构；

所述单碱基N为A、G、C和T中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的成套产品，其特征在于：

所述IIs型限制性内切酶1为BsmBI；

所述IIs型限制性内切酶2为BsaI；

所述筛选标记基因为ccdB基因。

3.根据权利要求1或2 所述的成套产品，其特征在于：所述限制性内切酶1的识别序列如序列表中序列1所示；

所述限制性内切酶2的识别序列如序列表中序列2所示。

4.根据权利要求1或2所述的成套产品，其特征在于：所述m为1、2、3、4、5或6；

m为1时，成套产品由核心片段A1和所述共表达载体组成；

m为2时，成套产品由核心片段A2、核心片段A3和所述共表达载体组成；

m为3时，成套产品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A5和所述共表达载体组成；

m为4时，成套产品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A6、核心片段A7和所述共表达载体组成；

m为5时，成套产品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A6、核心片段A8、核心片段A9和所述共表达载体组成；

m为6时，成套产品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A6、核心片段A8、核心片段A10、核心片段A11和所述共表达载体组成；

所述核心片段A1中的粘性末端1x如序列表中序列3所示；

所述核心片段A1中的粘性末端1y如序列表中序列4所示；

所述核心片段A2中的粘性末端2x如序列表中序列5所示；

所述核心片段A2中的粘性末端2y如序列表中序列6所示；

所述核心片段A3中的粘性末端3x如序列表中序列7所示；

所述核心片段A3中的粘性末端3y如序列表中序列8所示；

所述核心片段A4中的粘性末端4x如序列表中序列9所示；

所述核心片段A4中的粘性末端4y如序列表中序列10所示；

所述核心片段A5中的粘性末端5x如序列表中序列11所示；

所述核心片段A5中的粘性末端5y如序列表中序列12所示；

所述核心片段A6中的粘性末端6x如序列表中序列13所示；

所述核心片段A6中的粘性末端6y如序列表中序列14所示；

所述核心片段A7中的粘性末端7x如序列表中序列15所示；

所述核心片段A7中的粘性末端7y如序列表中序列16所示；

所述核心片段A8中的粘性末端8x如序列表中序列17所示；

所述核心片段A8中的粘性末端8y如序列表中序列18所示；

所述核心片段A9中的粘性末端9x如序列表中序列19所示；

所述核心片段A9中的粘性末端9y如序列表中序列20所示；

所述核心片段A10中的粘性末端10x如序列表中序列21所示；

所述核心片段A10中的粘性末端10y如序列表中序列22所示；

所述核心片段A11中的粘性末端11x如序列表中序列23所示；

所述核心片段A11中的粘性末端11y如序列表中序列24所示；

所述核心片段A中的粘性末端Ax如序列表中序列25所示；

所述核心片段A中的粘性末端Ay如序列表中序列26所示。

5.一种用于多元蛋白复合物表达的成套载体，由m个单基因表达载体和权利要求1-4中任一所述的共表达载体组成；

所述m为大于等于1小于等于6的整数；所述m个单基因表达载体按照阿拉伯数字顺次命名为1号单基因表达载体、2号单基因表达载体、……和m号单基因表达载体；

所述1号单基因表达载体为将权利要求1中的所述核心片段A1插入骨架载体中得到的载体；

所述2号单基因表达载体为将权利要求1中的所述核心片段A2插入骨架载体中得到的载体；

依次类推；

所述m号单基因表达载体为将权利要求1中的所述核心片段Am插入骨架载体中得到的载体；

所述成套载体为在大肠杆菌表达的成套载体。

6.一种构建共表达多元蛋白复合物的重组载体的方法，利用权利要求1-5任一所述产品进行构建，为如下（A）或（B）：（A）包括如下步骤：

1）将若干个外源蛋白的编码基因分别加载到权利要求5中的所述单基因表达载体中，分别得到若干个表达外源蛋白的单基因表达载体；

2）将所述若干个表达外源蛋白的单基因表达载体和权利要求1-4中任一所述的共表达载体用IIs型限制性内切酶1进行酶切和连接，得到连接产物，即为共表达多元蛋白复合物的重组载体；

（B）包括如下步骤：

1）将若干个外源蛋白的编码基因分别加载到权利要求1-4任一所述的核心片段中，分别得到若干个表达外源蛋白的单基因核心片段；

2）将所述若干个表达外源蛋白的单基因核心片段和权利要求1-4中任一所述的共表达载体用IIs型限制性内切酶1进行酶切和连接，得到连接产物，即为共表达多元蛋白复合物的重组载体；

所述重组载体为在大肠杆菌中表达的重组载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述加载的方法为：将所述单基因表达载体、外源蛋白的编码基因用IIs型限制性内切酶2和连接酶同时进行酶切和连接，使所述外源蛋白的编码基因替换所述单基因表达载体中的筛选基因，即实现加载。

8.一种在大肠杆菌进行共表达多元蛋白复合物的方法，包括如下步骤：按照权利要求6所述的方法构建得到共表达多元蛋白复合物的重组载体；将所述共表达多元蛋白复合物的重组载体转化到大肠杆菌菌株中，鉴定正确克隆，提取质粒；将所述质粒转入表达系统中，实现共表达。

说明书

一种用于多元蛋白复合物表达的成套载体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于多元蛋白复合物表达的成套载体及其应用。

背景技术

[0002] 相比于单一的蛋白组分，科学家们将目光逐渐转移到了结构和功能更难研究但也更为重要的多元蛋白复合物上。多元蛋白复合物在许多生物过程中都是重要的调控元件，除此之外，一些蛋白只有作为复合物的组分时才具有活性。因此，如果能直接研究复合物的结构和功能，那么很多生物学问题就能得到更直观的解释。

[0003] 表达和纯化蛋白复合物是结构研究的必要环节。大肠杆菌至今依然是最常用的表达重组蛋白的宿主。首先，利用大肠杆菌，可以用很短的时间和很少的成本获得大量的蛋白；第二，无论是从基因克隆还是蛋白纯化方面，大肠杆菌表达体系都已经非常成熟，便于进行多种条件的选择和检测；第三，作为原核生物，大肠杆菌缺少一些翻译后修饰，这有时更有利于研究。目前利用大肠杆菌表达体系获得蛋白复合物有以下几种途径：第一，将蛋白复合物各组分单独纯化出来(有些组分的纯化可能还涉及变性和复性过程)，在体外重组复合物；第二，在体内共表达复合物。在第一种方法中，复合物中某组分在单独表达的时候可能不可溶，同时体外组装也可能形成错误的复合物。然而，如果将复合物在体内实现共表达，可有利于每一蛋白的正确折叠，以及复合物各组分之间正确的互作，更有可能形成可溶的复合物。综上所述，大肠杆菌体内共表达系统在研究蛋白复合物过程中具有巨大的优势。

[0004] 共表达可以通过单个或多个载体实现。在单基因载体共表达方法中，每个载体携带一个基因。在使用多个载体时，每个载体都需要带有不同的选择标记、相互兼容的复制子和相似的拷贝数。然而，大肠杆菌的标记通常为抗生素，在培养时添加多种抗生素会影响细菌的生长速率。而且上述严格的要求也为选择多载体增加了难度。相比于单基因载体，多基因载体可将数个基因克隆到单个载体上进行共表达。通常情况下，这种载体需要更复杂的多克隆位点，利用不同组限制性内切酶实现每一步的克隆。在基因的转录方面，几个基因可以位于同一个启动子下，得到的mRNA是多顺反子；如果每个基因都单独的启动子控制，那么得到的mRNA是单顺反子。一些研究报道，多顺反子表达载体会导致不同蛋白表达量不一致，靠近启动子的蛋白表达量高于下游蛋白，这样会影响复合物不同组分的得量。

[0005] 在单顺反子表达载体中，每个蛋白都由单独的启动子控制，可以掌控表达水平，从而获得表达量更高的蛋白。这类的载体有：Novagen的pETDuet系列，pET-MCP系列以及pQLink系列等。这些表达载体需要多种限制性内切酶位点，为克隆增加了难度。此外，目前这些载体基本上都是以串联的方式将各蛋白逐个依次连入，因此随着复合物中所需组分数目的增加，共表达载体的构建时间需要不断的延长。所以，构建一种可将复合物中各组分进行并联拼接的、具有多重转录单元的共表达载体是当前的迫切需求。

发明内容

[0006] 本发明的一个目的是提供一种用于多元蛋白复合物表达的成套产品。

[0007] 本发明提供的用于多元蛋白复合物表达的成套产品由m个核心片段和共表达载体组成；

[0008] 所述m为大于等于1的整数；所述m个核心片段按照阿拉伯数字顺次命名为核心片段A1、核心片段A2、……和核心片段Am；

[0009] 所述核心片段A1从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N、粘性末端1x、用于构建外源基因表达盒的DNA片段和粘性末端1y、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；

[0010] 所述核心片段A2从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N、粘性末端2x、用于构建外源基因表达盒的DNA片段和粘性末端2y、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；

[0011] 依次类推，

[0012] 所述核心片段Am从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N粘性末端mx、用于构建外源基因表达盒的DNA片段、粘性末端my、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；

[0013] 每个所述核心片段经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的用于构建外源基因表达盒的DNA片段上游黏性末端和所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段下游黏性末端不同且不匹配；

[0014] 所述共表达载体由核心片段A和骨架载体组成；

[0015] 所述共表达载体的核心片段A从5’端起依次包括粘性末端Ax、单碱基N、所述IIs型限制性内切酶1的识别序列、筛选标记基因、所述IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N和粘性末端Ay；

[0016] 所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的骨架载体上游黏性末端和所述骨架载体下游黏性末端不同且不匹配；

[0017] 所述核心片段A1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端1y和所述核心片段A2经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端2x匹配；

[0018] 所述核心片段A2经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端2y和所述核心片段A3经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端3x匹配；

[0019] 依次类推；

[0020] 所述核心片段A m-1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端(m-1)y和所述核心片段A m经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端mx匹配；

[0021] 所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端Ax和所述核心片段A1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端1x匹配；

[0022] 所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端Ay和所述核心片段A m经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端my匹配。

[0023] 上述成套产品中，所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子；

[0024] 或，所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、核糖体结合位点、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子；

[0025] 或，所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、乳糖操纵子、核糖体结合位点、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子；

[0026] 或，所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、乳糖操纵子、核糖体结合位点、蛋白纯化标签、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子。

[0027] 上述成套产品中，每个所述核心片段经过所述IIs型限制性内切酶2酶切产生的筛选标记基因上游黏性末端和所述筛选标记基因下游黏性末端不同且不匹配；

[0028] 每个所述IIs型限制性内切酶酶切产生的粘性末端内部均不能形成回文结构；

[0029] 所述核心片段除描述的位置外，其他部分不含所述IIs型限制性内切酶2的识别序列；

[0030] 所述共表达载体除描述的位置外，其他部分不含所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；

[0031] 所述单碱基N为A、G、C和T中的任意一种。

[0032] 上述成套产品中，所述IIs型限制性内切酶1为BsmBI；

[0033] 所述IIs型限制性内切酶2为BsaI；

[0034] 所述筛选标记基因为ccdB基因。

[0035] 上述成套产品中，

[0036] 所述IIs型限制性内切酶1的识别序列如序列表中序列1所示；

[0037] 所述IIs型限制性内切酶2的识别序列如序列表中序列2所示。

[0038] 上述成套产品中，所述m为1、2、3、4、5或6；

[0039] m为1时，成套产品由核心片段A1和所述共表达载体组成；

[0040] m为2时，成套产品由核心片段A2、核心片段A3和所述共表达载体组成；

[0041] m为3时，成套产品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A5和所述共表达载体组成；

[0042] m为4时，成套产品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A6、核心片段A7和所述共表达载体组成；

[0043] m为5时，成套产品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A6、核心片段A8、核心片段A9和所述共表达载体组成；

[0044] m为6时，成套产品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A6、核心片段A8、核心片段A10、核心片段A11和所述共表达载体组成；

[0045] 所述核心片段A1中的粘性末端1x如序列表中序列3所示；

[0046] 所述核心片段A1中的粘性末端1y如序列表中序列4所示；

[0047] 所述核心片段A2中的粘性末端2x如序列表中序列5所示；

[0048] 所述核心片段A2中的粘性末端2y如序列表中序列6所示；

[0049] 所述核心片段A3中的粘性末端3x如序列表中序列7所示；

[0050] 所述核心片段A3中的粘性末端3y如序列表中序列8所示；

[0051] 所述核心片段A4中的粘性末端4x如序列表中序列9所示；

[0052] 所述核心片段A4中的粘性末端4y如序列表中序列10所示；

[0053] 所述核心片段A5中的粘性末端5x如序列表中序列11所示；

[0054] 所述核心片段A5中的粘性末端5y如序列表中序列12所示；

[0055] 所述核心片段A6中的粘性末端6x如序列表中序列13所示；

[0056] 所述核心片段A6中的粘性末端6y如序列表中序列14所示；

[0057] 所述核心片段A7中的粘性末端7x如序列表中序列15所示；

[0058] 所述核心片段A7中的粘性末端7y如序列表中序列16所示；

[0059] 所述核心片段A8中的粘性末端8x如序列表中序列17所示；

[0060] 所述核心片段A8中的粘性末端8y如序列表中序列18所示；

[0061] 所述核心片段A9中的粘性末端9x如序列表中序列19所示；

[0062] 所述核心片段A9中的粘性末端9y如序列表中序列20所示；

[0063] 所述核心片段A10中的粘性末端10x如序列表中序列21所示；

[0064] 所述核心片段A10中的粘性末端10y如序列表中序列22所示；

[0065] 所述核心片段A11中的粘性末端11x如序列表中序列23所示；

[0066] 所述核心片段A11中的粘性末端11y如序列表中序列24所示；

[0067] 所述核心片段A中的粘性末端Ax如序列表中序列25所示；

[0068] 所述核心片段A中的粘性末端Ay如序列表中序列26所示。

[0069] 上述粘性末端序列均指如附图1所示的核心片段上面那条模板DNA链从5’到3’端的序列。

[0070] 本发明的另一个目的是提供一种用于多元蛋白复合物表达的成套载体。

[0071] 本发明提供的用于多元蛋白复合物表达的成套载体由m个单基因表达载体和上述共表达载体组成；

[0072] 所述m为大于等于1的整数；所述m个单基因表达载体按照阿拉伯数字顺次命名为1号单基因表达载体、2号单基因表达载体、……和m号单基因表达载体；

[0073] 所述1号单基因表达载体为将权利要求1中的所述核心片段A1插入骨架载体中得到的载体；

[0074] 所述2号单基因表达载体为将权利要求1中的所述核心片段A2插入骨架载体中得到的载体；

[0075] 依次类推；

[0076] 所述m号单基因表达载体为将权利要求1中的所述核心片段Am插入骨架载体中得到的载体。

[0077] 上述成套载体中，所述单基因表达载体中的骨架载体不含有IIs型限制性内切酶2的识别序列。

[0078] 上述成套载体中，所述m为1、2、3、4、5或6；

[0079] m为1时，成套载体由1号单基因表达载体和上述共表达载体组成；

[0080] m为2时，成套载体由2号单基因表达载体、3号单基因表达载体和上述共表达载体组成；

[0081] m为3时，成套载体由2号单基因表达载体、4号单基因表达载体、5号单基因表达载体和上述共表达载体组成；

[0082] m为4时，成套载体由2号单基因表达载体、4号单基因表达载体、6号单基因表达载体、7号单基因表达载体和上述共表达载体组成；

[0083] m为5时，成套载体由2号单基因表达载体、4号单基因表达载体、6号单基因表达载体、8号单基因表达载体、9号单基因表达载体和上述共表达载体组成；

[0084] m为6时，成套载体由2号单基因表达载体、4号单基因表达载体、6号单基因表达载体、8号单基因表达载体、10号单基因表达载体、11号单基因表达载体和上述共表达载体组成；

[0085] 所述1号单基因表达载体为将序列27插入到表达载体A的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0086] 所述2号单基因表达载体为将序列28插入到表达载体A的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0087] 所述3号单基因表达载体为将序列29插入到表达载体A的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0088] 所述4号单基因表达载体为将序列30插入到表达载体A的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0089] 所述5号单基因表达载体为将序列31插入到表达载体A的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0090] 所述6号单基因表达载体为将序列32插入到表达载体A的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0091] 所述7号单基因表达载体为将序列33插入到表达载体A的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0092] 所述8号单基因表达载体为将序列34插入到表达载体A的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0093] 所述9号单基因表达载体为将序列35插入到表达载体A的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0094] 所述10号单基因表达载体为将序列36插入到表达载体A的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0095] 所述11号单基因表达载体为将序列37插入到表达载体A的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0096] 所述共表达载体为将序列38插入到表达载体B的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体B的其他序列不变，得到的载体；

[0097] 所述表达载体A为pET-28b；所述表达载体B为BsmBI和BsaI识别序列均被突变掉的pET-15b载体。

[0098] 本发明还有一个目的是提供一种构建共表达多元蛋白复合物的重组载体的方法。

[0099] 本发明提供的构建共表达多元蛋白复合物的重组载体的方法是利用上述产品进行构建的，为如下(A)或(B)：

[0100] (A)包括如下步骤：

[0101] 1)将若干个外源蛋白的编码基因分别加载到上述单基因表达载体中，分别得到若干个表达外源蛋白的单基因表达载体；

[0102] 2)将所述若干个表达外源蛋白的单基因表达载体和上述共表达载体用IIs型限制性内切酶1进行酶切和连接，得到连接产物，即为共表达多元蛋白复合物的重组载体；

[0103] (B)包括如下步骤：

[0104] 1)将若干个外源蛋白的编码基因分别加载到上述核心片段中，分别得到若干个表达外源蛋白的单基因核心片段；

[0105] 2)将所述若干个表达外源蛋白的单基因核心片段和上述共表达载体用IIs型限制性内切酶1进行酶切和连接，得到连接产物，即为共表达多元蛋白复合物的重组载体。

[0106] 上述方法中，所述加载的方法为：将所述单基因表达载体、外源蛋白的编码基因用IIs型限制性内切酶2和连接酶同时进行酶切和连接，使所述外源蛋白的编码基因替换所述单基因表达载体中的筛选基因，即实现加载。

[0107] 上述方法中，

[0108] 所述IIs型限制性内切酶1为BsmBI；

[0109] 所述IIs型限制性内切酶2为BsaI。

[0110] 上述方法中，为操作可行，所述核心片段的上下游两端还需要添加保护碱基。

[0111] 上述方法中，所述若干个表达外源蛋白的单基因表达载体由表达外源蛋白1的单基因表达载体、表达外源蛋白2的单基因表达载体、表达外源蛋白3的单基因表达载体、表达外源蛋白4的单基因表达载体和表达外源蛋白5的单基因表达载体组成。

[0112] 所述表达外源蛋白1的单基因表达载体为将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps25蛋白的编码基因的部分片段替换上述2号单基因表达载体中的筛选标记基因；

[0113] 所述表达外源蛋白2的单基因表达载体为将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps30蛋白的编码基因替换上述4号单基因表达载体中的筛选标记基因；

[0114] 所述表达外源蛋白3的单基因表达载体为将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps50蛋白的编码基因替换上述6号单基因表达载体中的筛选标记基因；

[0115] 所述表达外源蛋白4的单基因表达载体为将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps60蛋白的编码基因的部分片段替换上述8号单基因表达载体中的筛选标记基因；

[0116] 所述表达外源蛋白5的单基因表达载体为将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Set1蛋白的编码基因的部分片段替换上述9号单基因表达载体中的筛选标记基因。

[0117] 上述方法中，

[0118] 所述酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps25蛋白的编码基因的部分片段序列为序列39；

[0119] 所述酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps30蛋白的编码基因序列为序列41；

[0120] 所述酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps50蛋白的编码基因序列为序列43；

[0121] 所述酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps60蛋白的编码基因的部分片段序列为序列45中第25-1467位；

[0122] 所述酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Set1蛋白的编码基因的部分片段序列为序列47中第19-576位。

[0123] 本发明的最后一个目的是提供一种共表达多元蛋白复合物的方法。

[0124] 本发明提供的共表达多元蛋白复合物的方法包括如下步骤：按照上述方法构建得到共表达多元蛋白复合物的重组载体；将所述共表达多元蛋白复合物的重组载体转化到大肠杆菌菌株中，鉴定正确克隆，提取质粒；将所述质粒转入表达系统中，实现共表达。

[0125] 上述方法或者上述成套载体或上述成套产品中，所述匹配为互补配对，即粘性末端(m-1)y与粘性末端mx的互补链可以互补配对。

[0126] 本发明提供了一种用于多元蛋白复合物表达的成套载体及其应用。该成套载体分为单基因表达载体和共表达接收载体两部分，单基因克隆载体为卡那霉素抗性，启动子上游和终止子下游有BsmBI酶切位点，启动子和终止子间插入ccdB选择标记基因，ccdB两侧有BsaI酶切位点；而共表达接收载体为氨苄青霉素抗性，也选择ccdB作为选择标记，ccdB两侧有BsmBI酶切位点。通过试验证明：蛋白复合物各组分可并行克隆到不同的单基因表达载体中，然后将单基因表达载体和共表达载体在一个管中进行组装反应，即可得到蛋白复合物共表达载体。本发明通过IIs型限制性内切酶的设计，可使酶切和连接在同一管中进行，中间不需要酶切产物纯化等操纵，同时，本发明的设计可以将多个蛋白的转录单元一次实验同时组装到共表达载体上，因此共表达载体的组装极大地缩短了克隆时间，而且不同抗性以及ccdB筛选，提高了克隆的效率，另外，共表达载体转录出单顺反子mRNA，可提高蛋白表达量。

附图说明

[0127] 图1为单基因表达载体结构示意图。其中，BioBrick prefix：生物砖前缀序列；BsmBI:BsmBI识别序列；fx:BsmBI酶切序列；T7 promoter：T7启动子；lac operator：乳糖操纵基因；RBS:核糖体结合位点；tag：蛋白纯化标签；BsaI:BsaI识别序列；ccdB:毒素蛋白CcdB基因；T7 terminator:T7终止子；fy:BsmBI酶切序列；BioBrick suffix：生物砖后缀序列。

[0128] 图2为蛋白复合物共表达接收载体结构示意图。其中，BioBrick prefix：生物砖前缀序列；BsmBI:BsmBI识别序列；ccdB:毒素蛋白CcdB基因；BioBrick suffix：生物砖后缀序列。

[0129] 图3为单基因表达载体构建流程图。

[0130] 图4为复合物共表达接收载体构建流程图。

[0131] 图5为将蛋白复合物某组分克隆到单基因表达载体的示意图。

[0132] 图6为蛋白复合物共表达载体的克隆示意图。

[0133] 图7为经分子排阻色谱纯化后的SDS-PAGE图像，其中数字代表收集管编号。

具体实施方式

[0134] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0135] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0136] 下述实施例中的用于多元蛋白复合物表达的成套载体的构建方法具体包括如下步骤：

[0137] 1、设计m个核心片段；

[0138] m个核心片段按照阿拉伯数字顺次命名为核心片段A1、核心片段A2、……和核心片段Am；

[0139] 核心片段A1从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N、粘性末端1x、用于构建外源基因表达盒的DNA片段、粘性末端1y、单碱基N和识别序列；

[0140] 核心片段A2从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N、粘性末端2x、用于构建外源基因表达盒的DNA片段、粘性末端2y、单碱基N和识别序列；

[0141] 依次类推，

[0142] 核心片段Am从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N、粘性末端mx、用于构建外源基因表达盒的DNA片段、粘性末端my、单碱基N和识别序列；

[0143] 每个核心片段经过IIs型限制性内切酶1酶切产生的用于构建外源基因表达盒的DNA片段上游黏性末端和用于构建外源基因表达盒的DNA片段下游黏性末端不同且不互补；

[0144] 共表达载体由核心片段A和骨架载体组成；

[0145] 共表达载体的核心片段从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的粘性末端Ax、单碱基N、识别序列、筛选标记基因、IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N和粘性末端Ay；

[0146] 共表达载体经过IIs型限制性内切酶1酶切产生的骨架载体上游黏性末端和骨架载体下游黏性末端不同且不互补；

[0147] 核心片段A1经过IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端1y和核心片段A2经过IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端2x匹配；

[0148] 核心片段A2经过IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端2y和核心片段A3经过IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端3x匹配；

[0149] 依次类推；

[0150] 核心片段A m-1经过IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端(m-1)y下游黏性末端和核心片段A m经过IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端mx匹配；

[0151] 共表达载体经过IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端Ax和核心片段A1经过IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端1x匹配；

[0152] 共表达载体经过IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端Ay和核心片段A m经过IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端my匹配。

[0153] 用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、乳糖操纵子、核糖体结合位点、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止外源基因表达的终止子；

[0154] 每个核心片段经过IIs型限制性内切酶2酶切产生的筛选标记基因上游黏性末端和筛选标记基因下游黏性末端不同且不互补；

[0155] 每个IIs型限制性内切酶酶切产生的粘性末端内部均不能形成回文结构；

[0156] 单碱基N为A、G、C和T中的任意一种。

[0157] 2、单基因表达载体的构建

[0158] 将上述m个核心片段分别插入骨架载体中，分别得到每个单基因表达载体。

[0159] 实施例1、用于多元蛋白复合物表达的成套载体的构建及其应用

[0160] 一、单基因表达载体的构建

[0161] 本实施例共构建了11个单基因表达载体，具体如下：

[0162] 1号单基因表达载体为将序列27插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0163] 2号单基因表达载体为将序列28插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0164] 3号单基因表达载体为将序列29插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0165] 4号单基因表达载体为将序列30插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0166] 5号单基因表达载体为将序列31插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0167] 6号单基因表达载体为将序列32插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0168] 7号单基因表达载体为将序列33插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0169] 8号单基因表达载体为将序列34插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0170] 9号单基因表达载体为将序列35插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0171] 10号单基因表达载体为将序列36插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0172] 11号单基因表达载体为将序列37插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0173] 上述各单基因表达载体的构建方法如图3所示，具体步骤如下：

[0174] 1、1号单基因表达中间载体的构建

[0175] (1)特征序列的合成

[0176] 5‘-CAGGAAACAGCTATGACGCATGCGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGCGTCTCATGGATAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGtAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACGATGCGAGACCATGCGGTCTCCTAGCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTCACTGAGACGTACTAGTAGCGGCCGCTGCAGCTCGAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3’(序列1)；

[0177] 利用gene design网站(http://54.235.254.95/gd/)的Building Block Design(constant length overlap)的功能，输入序列3所示的核苷酸分子，得到如下oligos:

[0178] 5’-CAGGAAACAGCTATGACGCATGCGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGCGTCTC-3’；

[0179] 5’-GCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTATCCATGAGACGCTCTAGAAGCGGC-3’；

[0180] 5’-CTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGTAATAATTTTGTTTAACTTTAAG-3’；

[0181] 5’-GTCTCGCATCGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTACTAGAGGGGAA-3’；

[0182] 5’-AGAAGGAGATATACGATGCGAGACCATGCGGTCTCCTAGCTAGCATAACCCCT-3’；

[0183] 5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGCTAGGAG-3’；

[0184] 5’-AACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTCACTGAGACGTACTAGTAGCGGCCGCTG-3’；

[0185] 5’-GTAAAACGACGGCCAGTCTCGAGCTGCAGCGGCCGCTACTAGTAC-3’。

[0186] (2)PCR扩增

[0187] PCR分两步进行：

[0188] 第一步PCR为以上述步骤(1)合成的特征序列为模板进行PCR扩增，得到第一步PCR扩增产物。

[0189] 第一步PCR反应体系(终浓度)：dNTP(GenStar A114-01)0.2mM、1xQ5reaction buffer(NEB B9027S)、Q5( High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491S)0.02units/μl、引物(终浓度均为30nM)。第一步PCR反应条件如下：98℃,2min，55℃,30s；72℃,20s；1个循环；98℃,10s,69℃,30s,72℃,20s；5个循环；98℃,10s,65℃,30s,72℃,20s；5个循环；98℃,10s,61℃,30s,72℃,20s；20个循环；72℃2min；10℃保存。

[0190] 第二步PCR以稀释5倍的第一步PCR扩增产物为模板，用M13Forward和M13Reverse通用引物扩增进行PCR扩增，得到第二步PCR扩增产物。

[0191] 第二步PCR反应体系(终浓度)：dNTP(GenStar A114-01)0.2mM、1xQ5reaction buffer(NEB B9027S)、Q5( High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491S)0.02units/μl、引物(终浓度均为0.5mM)、模板为上述稀释5倍的基础上再稀释10倍。

[0192] 第二步PCR反应条件如下：98℃2min,55℃30s,72℃,20s；1个循环；98℃20s；55℃,30s；72℃,20s；25个循环；72℃3min；10℃保存。

[0193] 将第二步PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带。

[0194] (3)用SphI(SphI-HF NEB R3182L)和XhoI(NEB R0146L)对第二步PCR扩增产物和pET-28b载体(Novagen公司)进行双酶切，连接，得到重组载体，将其命名为1号单基因表达中间载体，并将其转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定后送测序。

[0195] 测序结果表明：1号单基因表达中间载体为将pET-28b载体的SphI和XhoI酶切位点间的DNA片段替换为序列49所示的DNA分子且保持pET-28b载体其他序列不变得到的载体。

[0196] 2、2-11号单基因表达中间载体的构建

[0197] 以1号单基因表达中间载体为模板，分别用表1中2-11号载体对应的引物进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物(粘端方向是按照载体模板链5’-3’的方向)。

[0198] 表1、2-11号单基因表达中间载体的构建的引物

[0199]

[0200]

[0201] PCR反应体系(终浓度)：dNTP(GenStar A114-01)0.2mM、1xQ5reaction buffer(NEB B9027S)、Q5( High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491S)0.02units/μl、引物(终浓度均为0.5mM)、质粒模板30ng。PCR反应条件如下：98℃,2min；1个循环；98℃,30s，54℃,30s，72℃,20s；30个循环；72℃3min；10℃保存。

[0202] 分别将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带，分别得到PCR回收产物。分别用EcoRI(EcoRI-HF NEB R3101L)和SpeI(SpeI-HF NEB R3133L)双酶切PCR回收产物和1号单基因表达中间载体，连接，分别得到重组载体，分别将其命名为2-11号单基因表达中间载体，并将其转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定后送测序。

[0203] 测序结果表明：2号单基因表达中间载体为将1号单基因表达中间载体的EcoRI和SpeI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列50所示的DNA分子，且保持1号单基因表达中间载体的其他序列不变的载体；

[0204] 3号单基因表达中间载体为将1号单基因表达中间载体的EcoRI和SpeI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列51所示的DNA分子，且保持1号单基因表达中间载体的其他序列不变的载体；

[0205] 4号单基因表达中间载体为将1号单基因表达中间载体的EcoRI和SpeI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列52所示的DNA分子，且保持1号单基因表达中间载体的其他序列不变的载体；

[0206] 5号单基因表达中间载体为将1号单基因表达中间载体的EcoRI和SpeI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列53所示的DNA分子，且保持1号单基因表达中间载体的其他序列不变的载体；

[0207] 6号单基因表达中间载体为将1号单基因表达中间载体的EcoRI和SpeI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列54所示的DNA分子，且保持1号单基因表达中间载体的其他序列不变的载体；

[0208] 7号单基因表达中间载体为将1号单基因表达中间载体的EcoRI和SpeI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列55所示的DNA分子，且保持1号单基因表达中间载体的其他序列不变的载体；

[0209] 8号单基因表达中间载体为将1号单基因表达中间载体的EcoRI和SpeI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列56所示的DNA分子，且保持1号单基因表达中间载体的其他序列不变的载体；

[0210] 9号单基因表达中间载体为将1号单基因表达中间载体的EcoRI和SpeI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列57所示的DNA分子，且保持1号单基因表达中间载体的其他序列不变的载体；

[0211] 10号单基因表达中间载体为将1号单基因表达中间载体的EcoRI和SpeI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列58所示的DNA分子，且保持1号单基因表达中间载体的其他序列不变的载体；

[0212] 11号单基因表达中间载体为将1号单基因表达中间载体的EcoRI和SpeI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列59所示的DNA分子，且保持1号单基因表达中间载体的其他序列不变的载体。

[0213] 3、1-11号单基因表达载体的构建

[0214] 人工合成序列表中序列60所示的含ccdB基因的序列(内部不含BsaI识别序列)，并将其分别插入到1-11号单基因表达中间载体的BsaI(BsaI-HF NEB R3535L)识别序列间，分别得到重组载体，分别将其命名为1-11号单基因表达载体(序列特征见图1)，并分别将其转TM化大肠杆菌One ccdB Survival  2 T1R，经酶切鉴定后送测序。

[0215] 测序验证表明：1号单基因表达载体为将序列27插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0216] 2号单基因表达载体为将序列28插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0217] 3号单基因表达载体为将序列29插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0218] 4号单基因表达载体为将序列30插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0219] 5号单基因表达载体为将序列31插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0220] 6号单基因表达载体为将序列32插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0221] 7号单基因表达载体为将序列33插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0222] 8号单基因表达载体为将序列34插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0223] 9号单基因表达载体为将序列35插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0224] 10号单基因表达载体为将序列36插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0225] 11号单基因表达载体为将序列37插入到pET-28b载体的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体A的其他序列不变，得到的载体；

[0226] 二、共表达接收载体的构建

[0227] 共表达载体为将序列38插入到pET-15b载体(载体上BsaI和BsmBI识别序列被突变掉)的SphI和XhoI识别序列之间，且保持表达载体B的其他序列不变，得到的载体。共表达接收载体的结构示意图如图2所示，共表达接收载体的构建方法如图4所示，具体步骤如下：

[0228] 1、移除pET-15b上的BsaI和BsmBI位点

[0229] 以pET-15b载体(Novagen公司)为模板，分别采用如下三对引物进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物。

[0230] YQO001:5’-GCTAGGTCTCGCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCG-3’；

[0231] YQO002:5’-CGATGGTCTCCTGTGACCTTCTCCGGGAGCTGCATGTG-3’；

[0232] YQO003:5’-GCTAGGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCC-3’；

[0233] YQO004:5’-GCTAGGTCTCACCAGTGATACGGGCAACAGCTGATTGCCC-3’；

[0234] YLO006:5’-CTGCAATGATACCGCggtctcgactacCACGCTCACCGG-3’；

[0235] YLO005:5’-CCGGTGAGCGTGggtctcgtagtcGCGGTATCATTGCAG-3’。

[0236] PCR反应体系(终浓度)：dNTP(GenStar A114-01)0.2mM、1xQ5reaction buffer(NEB B9027S)、Q5( High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491S)0.02units/μl、引物(终浓度均为0.5mM)、质粒模板30ng。PCR反应条件如下：98℃,2min；1个循环；98℃,30s，54℃,30s，72℃,1min；30个循环；72℃7min；10℃保存。

[0237] 分别将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带，得到3个PCR回收产物；用BsaI酶切3个PCR回收产物，胶回收目的条带后进行常规连接，得到重组载体，并将其转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定后送测序。

[0238] 2、插入ccdB基因

[0239] 以序列60中的ccdB基因为模板，采用如下引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

[0240] YQO040:CATGCATGCGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGTGGAAGAGACGCTCTAGAGGATCCGGCTTAC；

[0241] YQO041:GGCTCGAGCTGCAGCGGCCGCTACTAGTAGTGATGAGACGGTCGACCTGCAGACTGGCTG。

[0242] PCR反应体系(终浓度)：DNTP(GENSTAR A114-01)0.2MM、1XQ5REACTION BUFFER(NEB B9027S)、Q5( HIGH-FIDELITY DNA POLYMERASE NEB M0491S)0.02UNITS/ΜL、引物(终浓度均为0.5MM)、质粒模板30NG。PCR反应条件如下：98℃,2min；1个循环；98℃,30s，54℃,30s，72℃,1min；30个循环；72℃7min；10℃保存。

[0243] 分别用SphI和XhoI双酶切PCR回收产物和上述步骤1得到的重组载体，连接，得到共表达接收载体，并将其转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定后送测序。

[0244] 测序验证表明：共表达接收载体为将步骤1得到的重组载体的SphI和XhoI酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列60所示的含有ccdB基因的序列(内部不含BsaI识别序列)，且保持步骤1得到的重组载体的其他序列不变得到的载体。

[0245] 三、利用单基因表达载体和共表达接收载体表达蛋白复合物

[0246] 1、表达外源蛋白的单基因表达载体的构建

[0247] 表达外源蛋白的单基因表达载体为将表达外源蛋白的编码基因或其部分片段替换步骤一的单基因表达载体中的筛选标记基因得到的载体。本实施例中的蛋白复合物由A、B、C、D和E五个组分构成，本发明的表达外源蛋白的单基因表达载体共有5个，具体如下：

[0248] 表达外源蛋白A的单基因表达载体为将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps25蛋白的编码基因的部分片段替换上述2号单基因表达载体中的筛选标记基因；

[0249] 表达外源蛋白B的单基因表达载体为将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps30蛋白的编码基因替换上述4号单基因表达载体中的筛选标记基因；

[0250] 表达外源蛋白C的单基因表达载体为将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps50蛋白的编码基因替换上述6号单基因表达载体中的筛选标记基因；

[0251] 表达外源蛋白D的单基因表达载体为将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps60蛋白的编码基因的部分片段替换上述8号单基因表达载体中的筛选标记基因；

[0252] 表达外源蛋白E的单基因表达载体为将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Set1蛋白的编码基因的部分片段替换上述9号单基因表达载体中的筛选标记基因。

[0253] 上述各个表达外源蛋白的单基因表达载体的构建过程具体如下：

[0254] (1)表达外源蛋白A的单基因表达载体的构建

[0255] 以酿酒酵母BY4741的基因组DNA(BioVector NTCC Inc，货号：ATCC 201388D-5)为模板，采用YQO052和YQO053引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为组分A(酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps25蛋白编码基因部分片段)，其核苷酸序列如序列表中序列23所示。引物序列如下：

[0256] YQO052：5’-AGCGTGGGTCTCAGATGAATGTGAACCTTGCCGCGACGG-3’；YQO053：5’-GTGCTGGGTCTCGGCTATTTACTAGCATTACTCTCTTTTTCTCC-3’。

[0257] PCR反应体系(终浓度)：dNTP(GenStar A114-01)0.2mM、1xbuffer for KOD-Plus-(TOYOBO)、MgSO4(TOYOBO)2mM、KOD-Plus-(TOYOBO)0.02units/μl、引物(终浓度均为0.5mM)、基因组模板150ng。PCR反应条件如下：94℃,4min；1个循环；94℃,30s，55℃,30s，68℃,40s；30个循环；68℃7min；10℃保存。

[0258] 将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带，得到回收产物。

[0259] 将回收产物(100ng)和上述步骤一制备的2号单基因表达载体(20ng)加入到反应体系中反应，得到反应产物A(即表达外源蛋白A的单基因表达载体)。反应体系：5units BsaI(BsaI-HF NEB R3535L)、1U T4DNA连接酶(Thermo Scientific EL0011)、0.1mg/ml BSA(NEB B9001S)、1x T4连接酶缓冲液(Thermo Scientific B69)；反应程序：37℃，60min；50℃，15min；80℃，15min；10℃保存。

[0260] 将反应产物A直接转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定后送测序。

[0261] 经测序表明：表达外源蛋白A的单基因表达载体为将2号单基因表达载体的BsaI酶切位点间的DNA片段替换为序列中序列39所示的组分A(Cps25蛋白编码基因部分片段)的编码基因且保持2号单基因表达载体其他序列不变后得到的载体。表达的组分A的氨基酸序列如序列表中序列40所示。

[0262] (2)表达外源蛋白B的单基因表达载体的构建

[0263] 组分B中有一个BsmBI和一个BsaI酶切位点，设计两对引物进行扩增以移除BsmBI酶切位点。

[0264] 以酿酒酵母BY4741的基因组DNA为模板，分别采用引物YQO058和YQO060、引物YQO061和YQO059进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物。

[0265] YQO058：5’-AgcgtgGGTCTCaGATGTTCCAGTTTGTTACTCCTGTG-3’；

[0266] YQO059:5’-GtgctgGGTCTCgGCTAAACCCATCTCCATAAACAGC-3’；

[0267] YQO060:5’-AgcgtgGGTCTCGTTTCTGCATCAAAGATCCGTATGAG-3’；

[0268] YQO061:5’-GtgctgGGTCTCaGAAACGGGCCATTGTTTGAAG-3’。

[0269] PCR反应体系(终浓度)：dNTP(GenStar A114-01)0.2mM、1xbuffer for KOD-Plus-(TOYOBO)、MgSO4(TOYOBO)2mM、KOD-Plus-(TOYOBO)0.02units/μl、引物(终浓度均为0.5mM)、基因组模板150ng。

[0270] 第一对引物的PCR反应条件如下：94℃,5min；1个循环；94℃,30s，45℃,30s，68℃,1min；10个循环；94℃,30s，55℃,30s，68℃,1min；20个循环；68℃7min；10℃保存。

[0271] 第二对引物的PCR反应条件如下：94℃,4min；1个循环；94℃,30s，55℃,30s，68℃,2min；30个循环；68℃7min；10℃保存。

[0272] 将两个PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带，得到两个回收产物。

[0273] 将两个回收产物(较大片段100ng、另一个与其等摩尔数)和4号单基因表达载体(20ng)加入到反应体系中反应，得到反应产物B(即表达外源蛋白B的单基因表达载体)。反应体系：2units BsaI(BsaI-HF NEB R3535L)、0.5U T4DNA连接酶(Thermo Scientific EL0011)、0.1mg/ml BSA(NEB B9001S)、1x T4连接酶缓冲液(Thermo Scientific B69)；反应程序：37℃，5min；1个循环；37℃，5min,25℃5min；3个循环；50℃，5min；80℃，5min；降温后加入1unit连接酶；25℃40min；10℃保存。

[0274] 将反应产物B直接转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定后送测序。

[0275] 经测序表明：表达外源蛋白B的单基因表达载体为将4号单基因表达载体的BsaI酶切位点间的DNA片段替换为序列中序列41所示的组分B(Cps30蛋白)的编码基因(BsmBI位点被突变)保持4号单基因表达载体其他序列不变后得到的载体。表达的组分B的氨基酸序列如序列表中序列42所示。

[0276] (3)表达外源蛋白C的单基因表达载体的构建

[0277] 以酿酒酵母BY4741的基因组DNA为模板，采用YQO056和YQO057引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为组分C(Cps50蛋白的编码基因)，其核苷酸序列如序列表中序列27所示。

[0278] YQO056：5’-agcgtgGGTCTCaGATGAACATCCTTTTACAGGATCC-3’；

[0279] YQO057:5’-GtgctgGGTCTCgGCTATGATGACTGCATCTTAATTATC-3’。

[0280] PCR反应体系(终浓度)：dNTP(GenStar A114-01)0.2mM、1xbuffer for KOD-Plus-(TOYOBO)、MgSO4(TOYOBO)2mM、KOD-Plus-(TOYOBO)0.02units/μl、引物(终浓度均为0.5mM)、基因组模板150ng。

[0281] PCR反应条件如下：94℃,4min；1个循环；94℃,30s，55℃,30s，68℃,2min；30个循环；68℃7min；10℃保存。

[0282] 将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带，得到回收产物。

[0283] 将回收产物(100ng)和6号单基因表达载体(20ng)加入到反应体系中反应，得到反应产物C(即表达外源蛋白C的单基因表达载体)。反应体系：2units BsaI(BsaI-HF NEB R3535L)、0.5U T4DNA连接酶(Thermo Scientific EL0011)、0.1mg/ml BSA(NEB B9001S)、1x T4连接酶缓冲液(Thermo Scientific B69)；反应程序：37℃，5min；1个循环；37℃，
5min,25℃5min；3个循环；50℃，5min；80℃，5min；降温后加入1unit连接酶；25℃40min；10℃保存。

[0284] 将反应产物C直接转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定后送测序。

[0285] 经测序表明：表达外源蛋白C的单基因表达载体为将6号单基因表达载体的BsaI酶切位点间的DNA片段替换为序列中序列43所示的组分C(Cps50蛋白)的编码基因保持6号单基因表达载体其他序列不变后得到的载体。表达的组分C的氨基酸序列如序列表中序列44所示。

[0286] (4)表达外源蛋白D的单基因表达载体的构建

[0287] 以酿酒酵母BY4741的基因组DNA为模板，采用YQO054和YQO055引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为组分D(Cps60蛋白编码基因部分片段并且N端带有FLAG融合标签)，其核苷酸序列如序列表中序列29所示。

[0288] YQO054：5’-AGCGTGGGTCTCAGATGGATTATAAAGACGATGATGACAAGGAAGGGAAGAGACCTAATT-3’；

[0289] YQO055：5’-GTGCTGGGTCTCGGCTATTGCTGTAGGGCAATTTGCTCCAAC-3’。

[0290] PCR反应体系(终浓度)：dNTP(GenStar A114-01)0.2mM、1xbuffer for KOD-Plus-(TOYOBO)、MgSO4(TOYOBO)2mM、KOD-Plus-(TOYOBO)0.02units/μl、引物(终浓度均为0.5mM)、基因组模板150ng。

[0291] PCR反应条件如下：94℃,5min；1个循环；94℃,30s，45℃,30s，68℃,2min30s；5个循环；94℃,30s，50℃,30s，68℃,2min30s；5个循环；94℃,30s，52℃,30s，68℃,2min30s；20个循环；68℃7min；10℃保存。

[0292] 将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带，得到回收产物。

[0293] 将回收产物(100ng)和8号单基因表达载体(20ng)加入到反应体系中反应，得到反应产物D(即表达外源蛋白D的单基因表达载体)。反应体系：2units BsaI(BsaI-HF NEB R3535L)、0.5U T4DNA连接酶(Thermo Scientific EL0011)、0.1mg/ml BSA(NEB B9001S)、1x T4连接酶缓冲液(Thermo Scientific B69)；反应程序：37℃，5min；1个循环；37℃，
5min,25℃5min；3个循环；50℃，5min；80℃，5min；降温后加入1unit连接酶；25℃40min；10℃保存。

[0294] 将反应产物D直接转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定后送测序。

[0295] 经测序表明：表达外源蛋白D的单基因表达载体为将8号单基因表达载体的BsaI酶切位点间的DNA片段替换为序列中序列45所示的组分D(Cps60蛋白编码基因部分片段并且N端带有FLAG融合标签)的编码基因保持8号单基因表达载体其他序列不变后得到的载体。表达的组分D的氨基酸序列如序列表中序列46所示。

[0296] (5)表达外源蛋白E的单基因表达载体的构建

[0297] 以酿酒酵母BY4741的基因组DNA为模板，采用YQO050和YQO051引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为组分E(Set1蛋白编码基因部分片段并且N端带有His融合标签)，其核苷酸序列如序列表中序列31所示。

[0298] YQO050：5’-AGCGTGGGTCTCAGATGCATCATCATCACCACCACCAAGAAGTTTCATCCTCTAGAG-3’；

[0299] YQO051：5’-GTGCTGGGTCTCGGCTAGTTCAAGAAACCTTTACAATTAGG-3’。

[0300] PCR反应体系(终浓度)：dNTP(GenStar A114-01)0.2mM、1xbuffer for KOD-Plus-(TOYOBO)、MgSO4(TOYOBO)2mM、KOD-Plus-(TOYOBO)0.02units/μl、引物(终浓度均为0.5mM)、基因组模板150ng。

[0301] PCR反应条件如下：94℃,4min；1个循环；94℃,30s，45℃,30s，68℃,2min；5个循环；94℃,30s，50℃,30s，68℃,2min；5个循环；94℃,30s，52℃,30s，68℃,2min；20个循环；68℃7min；10℃保存。

[0302] 将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带，得到回收产物。

[0303] 将回收产物(100ng)和9号单基因表达载体(20ng)加入到反应体系中反应，得到反应产物E(即表达外源蛋白E的单基因表达载体)。反应体系：2units BsaI(BsaI-HF NEB R3535L)、0.5U T4DNA连接酶(Thermo Scientific EL0011)、0.1mg/ml BSA(NEB B9001S)、1x T4连接酶缓冲液(Thermo Scientific B69)；反应程序：37℃，60min；50℃，15min；80℃，
15min；10℃保存。

[0304] 将反应产物E直接转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定后送测序。

[0305] 经测序表明：表达外源蛋白E的单基因表达载体为将9号单基因表达载体的BsaI酶切位点间的DNA片段替换为序列中序列47所示的组分E(Set1蛋白编码基因部分片段并且N端带有His融合标签)的编码基因保持9号单基因表达载体其他序列不变后得到的载体。表达的组分E的氨基酸序列如序列表中序列48所示。

[0306] 2、复合物共表达载体的构建(图5)

[0307] 将步骤1得到的表达外源蛋白A的单基因表达载体、表达外源蛋白B的单基因表达载体、表达外源蛋白C的单基因表达载体、表达外源蛋白D的单基因表达载体和表达外源蛋白E的单基因表达载体与共表达接收载体(共表达接收载体150ng，其余单基因载体与其等摩尔量)加入到反应体系中反应，得到复合物共表达载体(图6)。

[0308] 反应体系：5units BsmBI(NEB R0580S)、0.1mg/ml BSA(NEB B9001S)、1x T4连接酶缓冲液(Thermo Scientific B69)。

[0309] 反应程序：55℃，60min；降温后加入1U T4连接酶(Thermo Scientific EL0011)25℃，50min；55℃，15min；80℃，15min；10℃保存。

[0310] 将复合物共表达载体直接转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR鉴定后送测序。

[0311] 3、复合物的表达与纯化

[0312] 将复合物共表达载体转化到大肠杆菌BL21Rosetta(DE3)(购自百恩维生物CC009)中，得到含有复合物共表达载体的重组菌；挑取含有复合物共表达载体的单克隆到5ml加有氨苄青霉素和氯霉素的双抗培养基中，37℃过夜培养；转接到1L加有氨苄青霉素和氯霉素的双抗培养基中，待OD600达到0.6-0.8时，降温2小时，加入IPTG，18℃诱导培养过夜；离心收菌后经镍柱亲和层析、离子交换层析和分子排阻色谱的纯化，得到纯化后的蛋白复合物。

[0313] 纯化后的蛋白复合物的SDS-PAGE检测结果如图7所示：从图中可以看出，纯化后的蛋白复合物的SDS-PAGE检测结果为5条带，大小与各组分分子量一致，表明本发明的方法可以实现蛋白复合物各组分的共表达，并极大的缩短了克隆时间，提高了克隆的效率。