一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测尿液的方法

摘要

本发明公开了一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测尿液的方法，包括以下步骤：仪器与试剂的准备；制备含铁氧化物纳米颗粒基质；制备尿液样品，分别取不同比例稀释后的尿液样品点样在靶板上，室温下干燥；在尿液样品上点含铁氧化物纳米颗粒基质，室温下干燥；进行质谱检测并分析质谱检测结果，得出结论。以上方法可以实现特异性检测指定类别分子，排除其他分子干扰并具有一定的耐盐性，适用于生物体液体系的检测。本发明作为一种快速高效的检测手段，其所带来的极少的样品消耗，有利于生物样品库的微型化，值得推广和应用。

权利要求

1.一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测尿液的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：仪器与试剂的准备：激光解析电离质谱，正离子模式检测，只有信噪比大于10的质谱信号用于定性和定量分析；

步骤2：制备含铁氧化物纳米颗粒基质，所述含铁氧化物纳米颗粒基质的制备包括以下步骤：步骤2.1：将三氯化铁和柠檬酸三钠溶解在乙二醇溶液中；

步骤2.2：在上述的混合溶液中加入乙酸钠，并在室温下超声半小时直到溶液变成均相体系；

步骤2.3：反应在铁氟龙高压反应釜中进行，150～195摄氏度条件下反应10小时以上，从而形成含铁氧化物纳米颗粒；

步骤2.4：将步骤2.3中得到的所述含铁氧化物纳米颗粒用乙醇和去离子水反复冲洗，最后在62～65摄氏度下干燥以备使用；

步骤2.5：将所述含铁氧化物纳米颗粒重悬在去离子水中超声震荡分散，作为基质使用；

步骤3：表征所述含铁氧化物纳米颗粒基质，所述含铁氧化物纳米颗粒基质的直径小于

1μm，接触角为20.9°，颗粒粒度均一，所述含铁氧化物纳米颗粒基质具有粗糙表面；

步骤4：对尿液的稀释倍数小于10000倍以得到尿液样品，将0.5μL稀释后的尿液点样在靶板上，室温下干燥；

步骤5：在尿液样品上点所述含铁氧化物纳米颗粒基质，室温下干燥；

步骤6：对步骤4中得到的尿液样品进行质谱检测；

步骤7：对质谱检测结果进行分析，得出结论。

2.根据权利要求1所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测尿液的方法，其特征在于，所述含铁氧化物纳米颗粒基质为FexOy或其混合物,其中x为小于等于10，y为大于等于0小于等于10。

3.根据权利要求1所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测尿液的方法，其特征在于，所述含铁氧化物纳米颗粒基质的尺寸范围为200nm～300nm。

4.根据权利要求2所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测尿液的方法，其特征在于，所述含铁氧化物纳米颗粒基质的所述粗糙表面由50nm以下的纳米小球组成。

5.根据权利要求2所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测尿液的方法，其特征在于，所述含铁氧化物纳米颗粒基质的所述粗糙表面由直径为5nm～8nm的纳米小球组成。

6.根据权利要求1所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测尿液的方法，其特征在于，所述尿液来源包括健康人群和患病人群，所述健康人群和患病人群包括儿童和成年人。

7.根据权利要求1所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测尿液的方法，其特征在于，检测分子量范围为小于等于10000Da。

8.根据权利要求1所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测尿液的方法，其特征在于，检测的分子包括糖类、氨基酸。

说明书

一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测尿液的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及质谱检测领域，尤其涉及一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测尿液的方法。

背景技术

[0002] 基质辅助激光解析电离质谱(MALDI MS)是一种新型的软电离检测技术，其通过测量精确的质量和电荷比(m/z)来对待测分子进行定性和定量分析。基质辅助激光解析电离质谱可以实现对样品快速高效的检测，其仅需要极少的样品量，同时还可以用于同位素的区分鉴别。在MALDI MS中，待测样品和基质形成共结晶，当紫外激光激发时，基质会吸收大多数的激光能量，并随后将能量传递给待测样品，从而发生解析电离。在此过程中会发生质子传递或转移，以便待测样品形成气态离子团。最终，气态离子团会进入加速电场，最后到达检测器得到质谱图。

[0003] 在MALDI MS中，基质起着吸收、传递激光能量、使样品离子化的决定性作用，而且辅助基质的引入还解决了非挥发性和热不稳定性的生物大分子在质谱中的解析离子化问题，使其能被成功检测。目前，传统的有机基质为α—氰基—4—羟基肉桂酸(CHCA)、2,5—二羟基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA)等。有机基质的存在对于能量传递以及保持分子的完整性及其重要，但有机基质的引入大大限制了该方法在小分子分析中的应用。其原因主要归结于两点：1.传统基质的结晶不均匀易带来热噪声。2.传统有机基质在激光能量下极易碎裂，在小分子区域形成极强的背景噪声。因此，基质种类的选择，浓度的大小，样品和基质的比例大小等选择因素使样品制备更加复杂，很难实现对小分子化合物的快速分析。

[0004] 如上所述，传统的基质容易在小分子量端(m/z<1000)产生背景噪声，对于小分子的检测带来极大的干扰。并且在实际体系的检测当中，由于体系的PH值，盐离子的浓度以及众多生物大分子的干扰，都将会影响体系中小分子的检测。因此传统的基质难以满足对于小分子检测的需求，一种新型的可以用于生物体系检测，且具有一定的抗干扰和一定的耐盐性的基质材料亟待开发。

[0005] 尿液是人类新陈代谢的产物。当人体的血液流经肾脏时，肾小球会滤过其中的水分和晶体物以此形成原尿。紧接着，原尿中的营养物，无机盐和绝大多数的水在肾小管中重新吸收回血液当中。最终形成的终尿中伴有少量的氨的代谢物和含盐水溶液，并排除人体。由此可以看出，尿液可以调节人体的水盐平衡，并及时的清理人体的代谢废物。众多的疾病都会影响到尿液的成分，所以通过尿液成分的定性和定量分析可以揭示人的健康状况以及疾病的发生。

发明内容

[0006] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测尿液的方法，可以克服传统基质的不足。

[0007] 本发明的技术方案如下：

[0008] 本发明提供了一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测尿液的方法，包括以下步骤：

[0009] 步骤1：仪器与试剂的准备：激光解析电离质谱，正离子模式检测，只有信噪比大于10的质谱信号用于定性和定量分析；

[0010] 步骤2：制备含铁氧化物纳米颗粒基质，步骤如下：

[0011] 步骤2.1：三氯化铁和柠檬酸三钠溶解在乙二醇溶液中；

[0012] 步骤2.2：在上述的混合溶液中加入乙酸钠，并在室温下超声半小时直到溶液变成均相体系；

[0013] 步骤2.3：反应在铁氟龙高压反应釜中进行，在150～195摄氏度下反应10小时以上，从而形成含铁氧化物纳米颗粒；

[0014] 步骤2.4：将步骤2.3中得到的含铁氧化物纳米颗粒用乙醇和去离子水反复冲洗，最后在62～65摄氏度下干燥以备使用；

[0015] 步骤2.5：将含铁氧化物纳米颗粒重悬在去离子水中，作为基质使用；

[0016] 步骤3：将稀释后的尿液点样在靶板上，室温下干燥；

[0017] 步骤4：在尿液样品上点含铁氧化物纳米颗粒基质，室温下干燥；

[0018] 步骤5：对步骤4中得到的尿液样品进行质谱检测；

[0019] 步骤6：对质谱检测结果进行分析，得出结论。

[0020] 进一步地，上述含铁氧化物纳米颗粒基质的制备包括以下步骤：

[0021] 进一步地，上述含铁氧化物纳米颗粒基质的直径小于1μm，颗粒粒度均一，含铁氧化物纳米颗粒基质具有粗糙表面。

[0022] 进一步地，上述含铁氧化物纳米颗粒基质为FexOy或其混合物,其中x为小于等于10，y为大于等于0小于等于10。

[0023] 进一步地，含铁氧化物纳米颗粒基质的尺寸范围为200nm～300nm。

[0024] 进一步地，含铁氧化物纳米颗粒基质的粗糙表面由50nm以下的纳米小球组成。

[0025] 进一步地，含铁氧化物纳米颗粒基质的粗糙表面由直径为5nm～8nm的纳米小球组成。

[0026] 进一步地，对尿液的稀释倍数小于10000倍以得到尿液样品。

[0027] 进一步地，尿液来源包括健康人群和患病人群，健康人群和患病人群包括儿童和成年人。

[0028] 进一步地，检测分子量范围为小于等于10000Da，包括糖类分子、氨基酸等。

[0029] 本发明的优点在于：

[0030] 有效的降低了背景噪声，选择性的离子化尿液中的小分子。

[0031] 基质成本低，可以大批量制作：基质易于合成，可以大批量制作。

[0032] 基质重现性好，有较好的抗干扰能力，有极好的灵敏度。在高盐浓度和大分子干扰下依旧能够很好的离子化小分子。

[0033] 极简的预处理，仅需要通过简单的样品稀释。

[0034] 用量极少：选择合适的稀释比例情况下，只需要极少的样本用于检测，极大促进了生物样品库微型化的进展。

[0035] 整个过程快速高效：整个检测过程，只需要几分钟就可以得到最后的检测结果。

[0036] 以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

[0037] 图1为本发明较优实施例中制备得到的含铁氧化物纳米颗粒的TEM表征图片；

[0038] 图2为赖氨酸标准品的质谱检测结果(赖氨酸峰值：m/z 169[M+Na]+和m/z185[M+K]+)；

[0039] 图3为尿液中部分分子的质谱检测结果(以葡萄糖峰值为例：m/z 203[M+Na]+和m/z 219[M+K]+)。

具体实施方式

[0040] 下面结合附图及实施例对本发明进行进一步描述。

[0041] 含铁氧化物纳米颗粒基质的制备包括以下步骤：

[0042] 步骤1：三氯化铁和柠檬酸三钠溶解在乙二醇溶液中；

[0043] 步骤2：在上述的混合溶液中加入乙酸钠，并在室温下超声半小时直到溶液变成均相体系；

[0044] 步骤3：反应将在铁氟龙高压反应釜中进行，在150～195摄氏度下反应10小时以上，形成含铁氧化物纳米颗粒；

[0045] 步骤4：将步骤3中得到的含铁氧化物纳米颗粒用乙醇和去离子水反复冲洗，最后在62～65摄氏度下干燥以备使用；

[0046] 步骤5：将含铁氧化物纳米颗粒重悬在去离子水中，作为基质使用。

[0047] 基质的表征：

[0048] 表征所用仪器有：透射电镜(TEM)成像在JEOL JEM-2100F仪器上进行；扫描电镜(SEM)在Hitachi S-4800仪器上进行；动态光散射(DLS)测量在Malvern Zetasizer Nano ZS仪器上进行；接触角测试在EasyDrop设备上进行。

[0049] 表征结果为：

[0050] 通过SEM图像可以看出含铁氧化物纳米颗粒基质具有均一的尺寸分布，平均粒径为240nm。DLS的测量结果为280nm，进一步正式了SEM的观测结果。根据DLS的测量，颗粒的多分散系数为0.122，证明颗粒具有较好的溶解性和稳定性。接触角测试结果为20.9°，证明该材料具有亲水性表面，这将极大有利于生物体系如尿液的检测。最后通过TEM图像(如图1所示)可以看出，含粒子由尺寸在5～8nm的极小的纳米颗粒组成，其稳定的结构和独特的表面特性都有利于在生物样品中的分子检测。

[0051] 下面通过几个典型的应用实施实例来进一步阐明基质辅助激光解析电离质谱在尿液检测体系当中的应用。

[0052] 实施例1：赖氨酸标准品的检测

[0053] (1)仪器与试剂的准备：激光解析电离质谱仪，只有信噪比大于10的质谱信号用于TM分析。采用AB SCIEX TOF/TOF  5800质谱仪，Nd:YAG激光器，波长为355nm。采用脉冲电场延时提取及反射的工作方式，正离子模式进行检测。采用DataExplorer观察、处理、分析数据，只有信噪比大于10的质谱信号用于分析。

[0054] (2)制备含铁氧化物纳米颗粒。

[0055] (3)依次用甲酸、无水乙醇、去离子水超声清洗MALDI靶板共1.5小时。

[0056] (4)含铁氧化物纳米颗粒在去离子水中超声震荡分散，当赖氨酸样品干燥后，在样品表面滴加基质混悬液，赖氨酸样品与基质形成二次重结晶，在干燥的MALDI靶板上点样品。

[0057] (5)干燥后，用激光解析离子化质谱对赖氨酸分子进行定量分析。

[0058] 结果如图2所示。

[0059] 实施例2：谷氨酸标准品的检测

[0060] (1)仪器与试剂的准备：激光解析电离质谱仪，只有信噪比大于10的质谱信号用于分析。采用AB SCIEX TOF/TOFTM 5800质谱仪，Nd:YAG激光器，波长为355nm。采用脉冲电场延时提取及反射的工作方式，正离子模式进行检测。采用DataExplorer观察、处理、分析数据，只有信噪比大于10的质谱信号用于分析。

[0061] (2)制备含铁氧化物纳米颗粒。

[0062] (3)依次用甲酸、无水乙醇、去离子水超声清洗MALDI靶板共1.5小时。

[0063] (4)含铁氧化物纳米颗粒在去离子水中超声震荡分散，当谷氨酸样品干燥后，在样品表面滴加基质混悬液，谷氨酸样品与基质形成二次重结晶，在干燥的MALDI靶板上点样品。

[0064] (5)干燥后，用激光解析离子化质谱对谷氨酸分子进行定量分析。

[0065] 实施例3：尿液中小分子的定性检测

[0066] (1)仪器与试剂的准备：激光解析电离质谱仪，只有信噪比大于10的质谱信号用于分析。采用AB SCIEX TOF/TOFTM 5800质谱仪，Nd:YAG激光器，波长为355nm。采用脉冲电场延时提取及反射的工作方式，正离子模式进行检测。采用DataExplorer观察、处理、分析数据，只有信噪比大于10的质谱信号用于分析。去离子水仪器Millipore Milli-Q system。

[0067] (2)制备含铁氧化物纳米颗粒基质。

[0068] (3)依次用无水乙醇、去离子水超声清洗MALDI靶板共1小时。

[0069] (4)对尿液按比例(0～1000倍)进行稀释，分别取不同稀释比例后的尿液溶液0.5μL，用于检测。

[0070] (5)将含铁氧化物纳米颗粒基质在去离子水中超声振荡分散后与尿液样品混合，干燥，含铁氧化物纳米颗粒基质与尿液样品形成二次重结晶，在干燥的MALDI靶板上点样，对尿液体系中的小分子进行定量分析。

[0071] (6)对质谱检测结果进行分析，得出结论。

[0072] 结果如图3所示。

[0073] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。