一种由大豆叶片再生愈伤组织的方法

摘要

本发明公开了一种由大豆叶片再生愈伤组织的方法，包括：1)大豆叶片的获取及消毒；其中，所述大豆叶片为第一对三出复叶；2)从所述大豆叶片进行原生质体的分离及收集；3)从所述原生质体再生愈伤组织。本发明简单高效，能够短时间产生大量的原生质体且活性高。同时原生质体再生愈伤组织再生率高。本发明将为大豆愈伤组织的进一步利用提供技术支持。

权利要求

1.一种由大豆叶片再生愈伤组织的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)大豆叶片的获取及消毒；其中，所述大豆叶片为第一对三出复叶；

2)从所述大豆叶片进行原生质体的分离及收集；

3)从所述原生质体再生愈伤组织；

其中，步骤3)中，将步骤2)获得的所述原生质体用未凝固的含有低熔点琼脂糖的KP8培养基重悬，并以液滴形式滴在培养皿中，待培养基凝固后，加入KP8液体培养基，于26±2℃及避光条件下培养；

在培养的第7、14、21及28天，将KP8液体培养基替换为KP8:K8混合比例分别为2:1、1:1、

0:1、0:1的液体培养基；

在培养的第35天，将液体培养基替换为生长培养基，所述生长培养基为添加有0.5mg/L的2,4-D、0.5mg/L的苄氨基腺嘌呤、0.5mg/L的Kn及500mg/L CH的MSB液体培养基；

将在所述生长培养基中培养7天后的愈伤组织转移至含有0.6％琼脂的MSB培养基表面，使愈伤组织继续生长，每2周利用含0.6％琼脂的MSB培养基进行一次继代培养。

2.如权利要求1所述的大豆叶片再生愈伤组织的方法，其特征在于，步骤2)中，使用含有纤维素酶、果胶酶和离析酶的酶解液对分割后的大豆叶片进行避光处理，处理温度为28±1℃，以产生原生质体。

3.如权利要求2所述的大豆叶片再生愈伤组织的方法，其特征在于，所述酶解液为添加有质量体积比为2.0％的纤维素酶、质量体积比为0.2％果胶酶、质量体积比为1.0％离析酶的CPW-9M溶液。

4.如权利要求2所述的大豆叶片再生愈伤组织的方法，其特征在于，将用酶解液处理后获得的溶液与等体积KP8培养基混合，用细胞筛过滤，将过滤液离心，沉淀用KP8培养基洗涤，再次离心，获得原生质体。

5.如权利要求1所述的大豆叶片再生愈伤组织的方法，其特征在于，步骤1)中，所述消毒为，将所述大豆叶片使用流水冲洗3～4遍，然后用20％的NaClO在180r/min振荡，23±1℃条件下消毒20min，之后用无菌水清洗3-5次。

6.如权利要求1-5中任一项所述的大豆叶片再生愈伤组织的方法，其特征在于，使用的大豆品种为天隆1号。

说明书

一种由大豆叶片再生愈伤组织的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种由大豆叶片再生愈伤组织的方法。

背景技术

[0002] 愈伤组织在植物组织培养中具有重要作用，利用愈伤组织不仅能够快速再生获得大量具有特定性状的完整植株，更能够对特定性状的植物资源进行长期保存。常规的愈伤组织获取方法，通常为获取植物外植体，比如下胚轴、子叶等，经消毒后诱导产生愈伤组织。

[0003] 利用植物叶片通过原生质体再生获得愈伤组织是愈伤组织获取的一种有效的方式。但是，由于植物基因型对于原生质体的分离及再生具有很大的影响，同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不一样，造成不同品种在相同条件下的再生能力也会不同。

[0004] 因此，本领域的技术人员致力于开发一种大豆原生质体分离在再生的方法。另外，由于当前主栽大豆品种原生质体分离及再生方法尚未见报道，因此，需要开发适用于主栽大豆品种的原生质体分离及再生的方法。

发明内容

[0005] 本发明提供了一种由大豆叶片再生愈伤组织的方法，提高其原生质体产量，并有效地由原生质体再生愈伤组织的方法。

[0006] 在本发明的较佳实施方式中，由大豆叶片再生愈伤组织的方法包括：

[0007] 1)大豆叶片的获取及消毒；其中，所述大豆叶片为第一对三出复叶；

[0008] 2)从所述大豆叶片进行原生质体的分离及收集；

[0009] 3)从所述原生质体再生愈伤组织。

[0010] 进一步地，步骤2)中，使用含有纤维素酶、果胶酶和离析酶的酶解液对分割后的大豆叶片进行避光处理，处理温度为28±1℃，以产生原生质体。

[0011] 优选地，大豆叶片分割成0.5-1mm宽的小条，避光处理4-6小时，期间轻轻晃动数次。

[0012] 进一步地，酶解液为添加有质量体积比为2.0％的纤维素酶、0.2％果胶酶、1.0％离析酶的CPW-9M溶液。

[0013] 优选地，每1g大豆叶片添加15ml酶解液。

[0014] 进一步地，将用酶解液处理后获得的溶液与等体积KP8培养基混合，用细胞筛过滤，将过滤液离心，沉淀用KP8培养基洗涤，再次离心，获得原生质体。

[0015] 优选地，用200目的细胞筛过滤，200×g离心10min使其成为球形，并沉淀下来。之后尽量吸去上清，沉淀用KP8培养基重悬并漂洗一次，200×g离心10min，收集沉淀，并用KP8培养基重悬，获得原生质体。

[0016] 进一步地，步骤3)中，将步骤2)获得的原生质体用未凝固的含有低熔点琼脂糖的KP8培养基重悬，并以液滴形式滴在培养皿中，待培养基凝固后，加入KP8液体培养基，于26±2℃及避光条件下培养。

[0017] 优选地，低熔点琼脂糖的重量体积比为1.2％，先用含有低熔点琼脂糖的KP8培养基将原生质体浓度调整至2×105个/mL，25μL/滴滴在培养皿中进行培养。

[0018] 进一步地，在培养的第7、14、21及28天，将KP8液体培养基替换为KP8:K8混合比例分别为2:1、1:1、0:1、0:1的液体培养基。

[0019] 进一步地，在培养的第35天，将液体培养基替换为生长培养基，生长培养基为添加有0.5mg/L的2,4-D、0.5mg/L的苄氨基腺嘌呤、0.5mg/L的Kn及500mg/L CH的MSB液体培养基。

[0020] 进一步地，将在上述生长培养基中培养后7天后的愈伤组织转移至含有0.6％琼脂的MSB培养基表面，使愈伤组织继续生长，每2周利用含0.6％琼脂的MSB培养基进行一次继代培养。

[0021] 优选地，在步骤1)之前，选取饱满表明光滑且无斑痕的成熟大豆籽粒播种于小花盆中(灭菌后的蛭石/珍珠岩＝3：1)，加入适当的Hoagland营养液，直至幼苗的第一对三出复叶完全展开。

[0022] 进一步地，步骤1)中，所述消毒为，将所述大豆叶片使用流水冲洗3～4遍，然后用20％的NaClO在180r/min振荡，23±1℃条件下消毒20min，之后用无菌水清洗3-5次。

[0023] 进一步地，上述方法使用的大豆品种为天隆1号。

[0024] 本发明简单高效，能够短时间产生大量的原生质体且活性高。同时原生质体再生愈伤组织再生率高。本发明将为大豆愈伤组织的进一步利用提供技术支持。

[0025] 以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

[0026] 图1是本发明的一个较佳实施例的大豆叶片产生原生质体示意图。

[0027] 图2是本发明的一个较佳实施例的台盼蓝染色法检测原生质体活性示意图。

[0028] 图3是本发明的一个较佳实施例的原生质体再生愈伤组织示意图。

具体实施方式

[0029] 具体实施方式中使用的材料，若无特殊说明，均可直接购买获得。CPW溶液配方为：

[0030]KH2PO4 27.2mg/L
KNO3 101.0mg/L
CaCl2·2H2O 1480.0mg/L
MgSO4·7H2O 246.0mg/L
CuSO4·5H2O 0.025Mg/L

[0031] pH 5.8；

[0032] CPW-9M为含有9％甘露醇的CPW溶液；

[0033] KP8培养基配方为：

[0034]

[0035]

[0036] K8培养基配方为：

[0037]

[0038]

[0039] MSB液体培养基配方为：MSB 4.44g/L，蔗糖20g/L，pH 5.8。

[0040] 本发明的一个具体实施方式中，由大豆叶片再生愈伤组织的方法，包括：1)大豆叶片的获取及消毒；其中，所述大豆叶片为第一对三出复叶；2)从所述大豆叶片进行原生质体的分离及收集；3)从所述原生质体再生愈伤组织。

[0041] 步骤1)中，将大豆籽粒播种培养，直至幼苗的第一对三出复叶完全展开。剪取该三出复叶进行消毒；幼嫩叶片细胞活性最强，第一对三出复叶是细胞活性最强的叶片，因此选择该叶片进行后续操作。

[0042] 步骤2)中，将消毒后的三出复叶进行分割，分割成小条或小块状，添加含有纤维素酶、果胶酶、离析酶的酶解液，在28±1℃下避光处理以产生原生质体。将上述酶解液与培养基混合，过筛，留下含原生质体的溶液，离心获得原生质体，再用培养基洗涤一遍，再次离心并重悬在培养基中。进行计数及台盼蓝染色，查看原生质体产量及成活率；

[0043] 步骤3)中，用含有低熔点琼脂糖的培养基稀释原生质体，使其浓度为2×105个/mL，然后以液滴形式滴在培养皿中，添加适量培养液后于26±2℃的避光条件下进行初期培养。之后三周每周替换液体培养基，替换为KP8含量下降的培养基。带愈伤组织增大并转变为黄绿色后，将液体培养基替换为添加有0.5mg/L的2,4-D、0.5mg/L的苄氨基腺嘌呤(BA)、0.5mg/L的Kn及500mg/L CH的MSB液体培养基。长成的愈伤组织可以在含有琼脂的MSB培养基表面生长剂传代，以进行扩大培养。

[0044] 实施例

[0045] 1.大豆幼嫩叶片的获取及消毒

[0046] 选取饱满表明光滑且无斑痕的成熟的天隆1号大豆籽粒播种于小花盆中(灭菌后的蛭石/珍珠岩＝3：1)，加入适当的Hoagland营养液。直至幼苗的第一对三出复叶完全展开。剪取完全展开的幼嫩叶片，使用流水冲洗3～4遍，然后用20％的NaClO消毒20min(180r/min振荡，23±1℃)，之后用无菌水清洗3～5次直至黄色消失，即将NaClO清洗干净。

[0047] 2.原生质体的制备及分离

[0048] 将消毒后的叶片分割成0.5-1mm宽的小条。每1g组织利用15ml酶解液在两个60×15mm的塑料培养皿中在28±1℃下避光处理4～6hr，期间轻轻晃动数次，能够观察到原生质体释放出来，并沉于底部，如图1所示。

[0049] 其中，酶解液为CPW-9M(pH 5.8)加入2.0％w/v纤维素酶(Cellulase Onozuka R10),0.2％w/v果胶酶(Pectolyase Y23)，1.0％w/v离析酶(macerozyme R10)，55℃水浴10min，冷却至室温后1500rpm离心15分钟，取上清液，用0.22um微孔滤膜过滤，4℃避光保存。

[0050] 将酶解溶液与等体积的KP8培养基混合，用200目的细胞筛过滤溶液后，200×g离心10min使其成为球形，并沉淀下来。之后尽量吸去上清，原生质体用KP8培养基重悬并漂洗一次，200×g离心10min，收集沉淀，并用KP8培养基重悬于离心管中。

[0051] 利用血球计数板和光学显微镜对原生质的产量进行统计，发现原生质体的产量为1.5×107个/mL(起始叶片组织为1g时)，同时利用台盼蓝染色法对原生质体活性进行检测，视野中未被染色的为具有活性的原生质体细胞，染成蓝色的为失去活力的细胞，如图2所示。统计发现原生质体的成活率为89.8％。

[0052] 3.愈伤组织再生

[0053] 利用KP8培养基配制1.2％的低熔点琼脂糖溶液，并在琼脂糖冷却但未凝固时，将制备的原生质体浓度调整至2×105个/mL，并以25μL液滴的形式置于60mm的培养皿中培养(10滴/皿)，待液滴凝固后，在培养皿中加入5.0mL的KP8培养基。将培养皿置于26±2℃的避光条件下培养7天，之后将培养皿置于光照条件下培养。

[0054] 在培养的第7、14、21及28天，替换液体培养基为KP8:K8混合比例分别为2:1，1:1，0:1，0:1的液体培养基。这样的更换频率以及培养基配置，是为了使组织细胞适应培养基的渗透压。每隔7天更换一次培养基，培养基的渗透压逐步降低，直至达到正常组织生长渗透压。在培养过程中能够发现液滴之中出现原生质体分离再生的愈伤组织，呈现白色小点状，并逐渐增大并转变为黄绿色。

[0055] 等待愈伤组织增大并转变为黄绿色时，将液体培养基替换为生长培养基，一般是在第35天左右进行。生长培养基为添加有0.5mg/L的2,4-D、0.5mg/L的苄氨基腺嘌呤(BA)、0.5mg/L的激动素(KN)及500mg/L水解酪蛋白(CH)的MSB液体培养基。

[0056] 之后第7天(即再生愈伤组织适应生长培养基后)将琼脂糖块或小液滴转移至含0.6％琼脂的MSB培养基表面，使已再生的愈伤组织继续生长。并且每2周利用含0.6％琼脂的MSB培养基进行一次继代培养。从原生质体再生的愈伤组织如图3所示。

[0057] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。