异普耳文酸衍生物及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种异普耳文酸衍生物，结构式为式Ⅰ本发明利用微生物培养，分离提纯，结构解析等技术，对海洋共附生真菌的次生代谢产物进行了详细分析，获得了本发明所述的异普耳文酸衍生物，通过体外抗菌试验证实，该化合物具有较好的抗菌活性，可以作为抗菌药物的活性成分，具有广泛的用途。

权利要求

1.一种具有式I结构的异普耳文酸衍生物或其药学上可成的盐，

2.一种药物组合物，包括如权利要求1所述的异普耳文酸衍生物或其药学上可成的盐以及药学上可接受的载体。

3.如权利要求1所述异普耳文酸衍生物的制备方法，包括如下步骤：

1)采用与稀土元素氯化镧共发酵的技术，发酵培养海洋海绵共附生微生物，所述微生物为土曲霉Aspergillus terreus；

2)将所述发酵液经有机溶剂萃取，得到初提物；

3)将初提取物经过中低压高效液相柱层析纯化，采用甲醇-水两相系统梯度洗脱，收集合并组分；

4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到结构式为式I的化合物。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述稀土元素氯化镧共发酵的技术为向GYT培养基中加入氯化镧，并使用人工海水进行配制。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于GYT培养基中氯化镧的质量百分比为

0.5‰。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于培养基的配制具体为：称取葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母提取物10g，0.35g硫酸镁，0.5g氯化镧，溶解于1000mL人工海水中，灭菌；配制固体培养基时在液体培养基中加入2％琼脂；其中将30.0g海盐溶解于1000ml自来水溶液中配置为人工海水。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤2)所述有机溶剂为乙酸乙酯。

8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)采用30％-100％的甲醇进行甲醇-水两相系统梯度洗脱。

9.如权利要求1所述异普耳文酸衍生物在制备抗菌药物中的应用。

说明书

异普耳文酸衍生物及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及异普耳文酸衍生物及其制备方法以及该衍生物的医药用途。

背景技术

[0002] 随着抗生素的滥用，超级细菌的出现，使得细菌感染是危害人类健康的主要疾病之一。研究和开发新的抗生素一直是医药领域的重要研究内容。近年来，天然产物逐渐成为人类研究有效活性成分的重要来源，在新药开发过程中，一方面具有良好活性的天然产物可以直接被用于临床；另一方面，以天然活性成分为先导化合物，通过有机合成、结构改造等方法寻找和开发新的高效低毒药物，是被实践证明最行之有效的开发新药的途径之一。

[0003] 作为海洋生态系统中的重要组成，海洋微生物同样为长期适应生存产生各种各样的酶和许多新颖的活性化合物。研究表明，海洋微生物具有丰富的生物多样性，种类多达1亿种以上，但目前所研究和鉴别过的海洋微生物还不到海洋微生物总量的1％，这意味着海洋微生物为海洋药物的研究提供了一个近似无穷的资源。微生物在海洋中的分布非常广泛，在极端的环境中都有微生物存在，其中一部分与海洋动植物处于共附生、共栖、寄生或附生的微生物称为共附生微生物。很多文献报道中指出，许多以前认为是由植物和无脊椎动物产生的活性物质实际上是由与其共附生的微生物产生的。因此，海洋共附生微生物正受到越来越多研究者的重视，迄今为止已从海洋共附生微生物中发现了种类繁多并且具有活性显著的生物学活性物质。

[0004] 然而，由于微生物沉默基因簇的存在，大部分单体化合物在普通的培养条件下并不能表达产生，通过传统模式寻求结构新颖的抗菌活性成分的成功率越来越低，因此，如何有效的诱导沉默基因进行表达，产生新颖的活性单体已经成为研究的热点。

发明内容

[0005] 本发明运用稀土元素共培养的方法对海洋来源的土曲霉进行了共培养，从中发现一种新颖的具有抗菌活性的异普耳文酸衍生物。

[0006] 本发明的目的是提供一种异普耳文酸衍生物及其制备方法。

[0007] 本发明所提供的异普耳文酸衍生物及其药学上可成的盐或酯，其结构式为式Ⅰ的化合物2-(chloro(4-hydroxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl)methylene)-4-hydroxy-4-(4-hydroxyphenyl)but-3-enoic acid：

[0008]

[0009] 本发明所述异普耳文酸衍生物可以任何药学意义上的阳离子成盐，这些盐可以由本发明所述异普耳文酸衍生物与无机碱或有机碱成盐制备，如碱金属盐(例如钠和钾盐)，碱土金属盐(例如钙和镁盐)和衍生自氨或具有1-16个碳原子的有机胺的铵盐，如乙胺，二乙胺，三乙胺，乙基二异丙基胺，单乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，二环己基胺，二甲氨基乙醇，普鲁卡因，二苄基胺，N-甲基吗啉，精氨酸，赖氨酸，1，2-乙二胺和N-甲基哌啶。

[0010] 本发明所述异普耳文酸衍生物也可以被溶剂化，例如被水合。溶剂化可以在制备工艺过程中进行，或者可以例如由于最初无水的式(I)化合物的吸湿性质而发生(水合)。“药学上可成的盐”还包括生理学上可接受的溶剂化物。

[0011] 药学上可成的酯可通过已知的方法利用可药用酸或醇制得。这些酯的非限制性例子包括脂肪酸/醇或芳香酸/醇的酯，可药用酯的代表性例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基和苄基酯等。

[0012] 本发明在其范围内包括该化合物的所有可能的几何异构体、例如Z和E异构体(顺式和反式异构体)以及该化合物的所有可能的旋光异构体、例如非对映体和对映体。此外，本发明在其范围内还包括单独的异构体及其任何混合物、例如外消旋混合物。单独的异构体可利用原料的相应的异构形式得到或在制得目标化合物之后按照常规分离方法将它们分离。对于旋光异构体、例如对映体从其混合物中的分离，可使用常规拆分方法、例如分步结晶。

[0013] 本发明另外涵盖本发明化合物的前药。术语“前药”涵盖自身可以是生物学上活性或非活性的化合物，但是在其在身体内的停留时间期间转化成本发明的化合物(例如通过代谢或水解)。

[0014] 本发明还提供了上述异普耳文酸衍生物制备方法，包括如下步骤：1)发酵培养微生物；2)将所述发酵液经有机溶剂萃取后，减压浓缩，得到初提物；3)将所述转化物残渣以反相中低压色谱纯化，所述柱纯化采用甲醇-水两相系统梯度洗脱，收集合并组分；4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到产物。

[0015] 其中，上述方法步骤1)微生物为真菌，土曲霉(Aspergillus terreus)。

[0016] 上述方法步骤2)中萃取溶剂为常规机型有机溶剂，优选乙酸乙酯。

[0017] 上述制备方法具体包括：

[0018] 1)发酵以及萃取

[0019] 将土曲霉接入GYT培养基发酵培养，取发酵液，用等体积的乙酸乙酯萃取，优选2次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物残渣；

[0020] 2)反相中低压色谱柱纯化

[0021] 将所得残渣溶于适量甲醇，使用反相硅胶(优选120埃，30–50目)的色谱柱，用甲醇-水系统梯度洗脱(30％-100％甲醇，V/V)，优选收集50％-60％甲醇的洗脱组分；

[0022] 3)反相高效液相色谱纯化

[0023] 合并步骤2)洗脱组分，用C18反相高效液相色谱分析、纯化。洗脱系统为甲醇–水等度洗脱，具体条件：流动相：甲醇：水(52:48，V/V)，流速为2.0mL/min，检测波长为220nm，得到结构式为式Ⅰ化合物。

[0024] 本发明的另一目的是提供本发明异普耳文酸衍生物式Ⅰ的化合物的用途。

[0025] 本发明通过实验证实，本发明的异普耳文酸衍生物具有良好的抗菌活性，可以作为抗菌药物的活性成分。

[0026] 这些抗菌药物的活性成分可以是选自结构式为式Ⅰ的化合物中的一种或几种。

[0027] 在以上述化合物为活性成分的药物中，需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，均可以按照药学领域的常规方法制备。

[0028] 本发明利用微生物与稀土元素共发酵，纯化技术，对海洋海绵共附生的真菌(Aspergillus terreus)的次生代谢产物进行了系统分离，获得了一类新的异普耳文酸衍生物，通过体外抗菌试验证实，这些化合物具有较好的抗菌活性，可以作为抗菌药物的活性成分，具有广泛的用途。

附图说明

[0029] 图1为本发明所述异普耳文酸衍生物HPLC纯化色谱图。

[0030] 图2为本发明所述异普耳文酸衍生物HPLC指纹图谱。

[0031] 图3为不同培养基的发酵产物的HPLC图谱比较。

具体实施方式

[0032] 实施例1、结构式为式Ⅰ化合物的制备

[0033] 本发明采用微生物发酵，提取，纯化等步骤来制备本发明化合物。其中所采用的菌株为土曲霉。此菌株于海洋海绵中分离得到，为海洋海绵的共附生微生物，放置于20％甘油水溶液中，于零下80℃冰箱内保存。所选用的培养基为GYT培养基。

[0034] GYT培养基的配制：葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母提取物10g，0.35g硫酸镁，溶解于1000mL人工海水中，121℃下灭菌30分钟。

[0035] 含有0.5‰氯化镧的GYT培养基的配制：称取葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母提取物10g，0.35g硫酸镁，0.5g氯化镧，溶解于1000mL人工海水中，121℃下灭菌30分钟。

[0036] 含有1‰氯化镧的GYT培养基的配制：称取葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母提取物10g，0.35g硫酸镁，1g氯化镧，溶解于1000mL人工海水中，121℃下灭菌30分钟。

[0037] 含有2‰氯化镧的GYT培养基的配制：称取葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母提取物10g，0.35g硫酸镁，2g氯化镧，溶解于1000mL人工海水中，121℃下灭菌30分钟。

[0038] 配制固体培养基时在液体培养基中加入2％琼脂。其中将30.0g海盐溶解于1000ml自来水溶液中配置为人工海水。

[0039] 细菌培养基的制备(LB培养基)：每1000mL液体培养基加入5.0g酵母提取物，10.0g蛋白胨，10.0g NaCl，加水溶解，调pH值至7.0。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入1.5％琼脂。

[0040] 具体化合物的过程如下：

[0041] 1)发酵以及萃取

[0042] 分别选择普通GYT培养基及含有0.5‰、1‰、2‰氯化镧的GYT培养基，每种培养基试验组将土曲霉接入2个250mL培养基的三角瓶中，作为种子液，于摇床上160rpm、28℃下振荡培养3天后，用无菌移液管吸取25mL的种子液，加入到20个1000mL摇瓶(装有500mL GYT培养基)中。振荡培养28天后，用等体积的乙酸乙酯萃取2次，萃取液减压浓缩至干，分别得到不同培养基的转化物残渣各约6.0g。

[0043] 用LB培养基复苏金黄色葡萄球菌。连续转接2次后获得新鲜菌液培养物，用接种环沾取新鲜菌液培养物采用平板划线法在营养琼脂培养基上连续划线，获取单菌落。接种环挑取单菌落，接种于2ml LB培养基37℃过夜培养(24h)，用血球计数板分别配置浓度为1×106CFU/ml的菌液，备用。

[0044] 抑菌环试验：超级工作台中，吸取100μl备用菌液，用玻棒在营养琼脂培养基平板表面均匀涂布。置室温干燥后，用直径为6mm的灭菌打孔器在在培养基表面打孔，往小孔内注入不同培养基的转化物样品，置37℃温箱，孵育24h后，读取结果，抑菌圈边缘以肉眼见不到菌落明显生长为限，测量其抑菌圈的直径。结果如表1所示，

[0045] 表1

[0046]

[0047] 结果表明0.5‰氯化镧的GYT培养基的发酵产物具有更好的抑菌效果，因此选择该产物进行进一步研究。

[0048] 2)反相中低压色谱柱纯化

[0049] 将0.5‰氯化镧的GYT培养基发酵萃取产物溶于适量甲醇，加至装有120g反相硅胶(120埃，30–50目)的色谱柱，用甲醇-水系统梯度洗脱(30％-100％甲醇)，收集洗脱组分。

[0050] 分别对20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％甲醇的洗脱组分进行抗菌活性测试，其中50％-60％的洗脱组分具有较好的抗菌活性，因此，优选收集50％-60％的洗脱组分。

[0051] 3)反相高效液相色谱纯化

[0052] 将步骤2)收集的洗脱组分用反相高效液相色谱分析、纯化。优选分析条件为：色谱柱Hedera C18A-5μm，4.6mm I.D×250mm(江苏汉邦科技)，洗脱系统为甲醇–水等度洗脱，具体条件：流动相：甲醇：水(52:48，V/V)，流速为2.0mL/min。检测波长为220nm，柱温25℃，进样量20μL。收集保留时间108min的组分，得到结构式为式Ⅰ的化合物。

[0053] 化合物Ⅰ，2-(chloro(4-hydroxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl)methylene)-4-hydroxy-4-(4-hydroxyphenyl)but-3-enoic acid，黄色无定形粉末：(+)-ESIMS m/z 
445/447[M+H]+；(+)-HRESIMS m/z 445.0659(calcd for C22H2279BrO5,445.0651).[0054] 其1H-NMR及13C-NMR数据如表2所示。

[0055] 表2.化合物Ⅰ的氢谱和碳谱数据(CD3OD)

[0056]

[0057]

[0058] 以上结果表明，所得化合物结构正确。

[0059] 化合物Ⅰ的高效液相指纹图谱如图2所示，液相条件：色谱柱Hedera C18A-5μm，4.6mm I.D×250mm(江苏汉邦科技)，具体条件：流动相：40％-100％的甲醇-水系统(V/V)，
40％甲醇(0分钟开始)-100％甲醇(70分钟终止)，梯度洗脱，流速为2.0mL/min。检测波长为
220nm，柱温25℃，进样量20μL。

[0060] 采用上述液相条件考察不同培养基的发酵转化物(步骤1)的产物)中的化合物Ⅰ的含量，结果如图3所示，其中(1为0.5‰氯化镧的GYT培养基，2为1‰氯化镧的GYT培养基，3为2‰氯化镧的GYT培养基，4为普通GYT培养基。结果表明，0.5‰氯化镧的GYT培养基的发酵产物中化合物Ⅰ的含量最高，其它培养基的产物中化合物Ⅰ的含量很低。

[0061] 实施例2本发明化合物Ⅰ的抗菌活性

[0062] 1)实验材料

[0063] 仪器与试剂：CO2培养箱；酶标仪(Bio-TEK ELx800)；LB培养基(上海生物工程有限公司)。

[0064] 测试所用致病细菌株：Enterobacter cloacae(阴沟肠杆菌)，Escherichia coli(大肠杆菌)，Klebsiella aerogenes(克雷伯氏菌)，Pseudomonas aeroginosa(绿脓杆菌)，Salmonella typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌)，Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)，购于中国医学科学院微生物研究所。

[0065] 测试样品：土曲霉次生代谢产物Ⅰ，纯度在90％以上；同时，选取硫酸链霉素为阳性对照药物，各化合物均以DMSO溶解后稀释。

[0066] 2)实验方法

[0067] 配置LB培养液，121℃下灭菌25分钟备用，将配置稀释好的菌液加入96孔板中，每孔加入180μl，将化合物1和2配置为一定浓度的DMSO溶液，以倍数关系逐级稀释加入含有菌液的微孔中，使其最终浓度依次为64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25，0.125，0.0625μg/ml，于37℃培养箱中培养24小时，用酶标仪于600nm处读取吸光度，其中采用硫酸链霉素为阳性对照，180μl空白培养基与20μl的DMSO混合溶液为空白对照。实验重复3次。计算各受试样品对人类致病菌的最小抑制浓度(MIC值)。

[0068] 3)实验结果，结果如表3所示。

[0069] 表3.测试样品体外细胞毒活性筛选结果

[0070]

[0071] 结果表明，本发明的化合物Ⅰ具有良好的光谱抗菌活性，可以作为抗菌药物的活性成分。