含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物及其应用

摘要

本发明公开了一种含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物，如通式I或Ⅱ所示：。本发明含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物，及其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物作为活性成份，与药学上可接受的载体或赋型剂混合制备成组合物，并制备成临床上可接受的剂型。本发明化合物能治疗和/或预防增生性疾病、治疗和/或预防前列腺癌、肺癌和宫颈癌。

权利要求

1.一种含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物，其特征在于，结构如下述通式I或Ⅱ所示：其中：

X＝S，Y＝CH或X＝CH，Y＝S；

Z为苯环、五元或六元芳杂环；

A、B、D、E、G分别为CH或N；

R1选自H、

R2选自H或-CH3；

Ar为苯基、萘基、5～10元杂芳基，所述杂芳基含有1～3个选自O、N和S的杂原子，且Ar任选1～4个相同或不同的R3取代；

R3选自氢、卤素、羟基、三氟甲基、三氟甲氧基、氨基、叠氮基、硝基、氰基、巯基、(C1～C4)烷基、(C3～C6)环烷基、(C2～C4)烯基、(C2～C4)炔基、(C1～C4)烷氧基、(C1～C4)烷硫基、烯丙基、(2-甲基)烯丙基、(C1～C4)烷氧基甲基或(C1～C4)烷基酰基；

R4、R5相同或不同，分别独立地选自(C1～C6)烷基或(C3～C6)环烷基；或者R4和R5与和它们所连接的氮原子一起形成5～10元饱和杂环基，所述饱和杂环基除了与R4和R5连接的氮原子外，任选含有1～3个选自O、N和S的杂原子。

2.根据权利要求1所述含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物，其特征在于：其中：

X＝S，Y＝CH或X＝CH，Y＝S；

Z为苯环、吡啶环；

A、B、D、E、G分别为CH或N；

R1选自H、

R2选自H或-CH3；

Ar为苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基或噻吩基，所述苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、噻吩基任选1～4个相同或不同的R3取代；

R3选自氢、卤素、羟基、三氟甲基、三氟甲氧基、氨基、叠氮基、硝基、氰基、巯基、(C1～C4)烷基、(C3～C6)环烷基、(C2～C4)烯基、(C2～C4)炔基、(C1～C4)烷氧基、(C1～C4)烷硫基、烯丙基、(2-甲基)烯丙基、(C1～C4)烷氧基甲基或(C1～C4)烷基酰基。

3.一种含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物，其特征在于：所述化合物为选自下列化合物中的一种：

4.一种药用组合物，包括治疗有效量的权利要求1～3任一项所述含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物及其药学上可接受的盐为活性成分以及药学上可接受的赋型剂。

5.一种如权利要求1所述含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物在制备治疗和/或预防前列腺癌和宫颈癌的药物中的应用。

说明书

含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及喹唑啉类化合物，具体地指一种含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物及其应用。

背景技术

[0002] 恶性肿瘤是一种严重危害人类生命健康的疾病，其发病率和死亡率均已超过心脑血管疾病，居于所有疾病的首位，癌症是威胁人类健康的第一大“杀手”。预计到2030年全球将有2140万新增病例，死亡人数达到1320 万人，其中70％发生在中低收入的发展中国家。随着社会经济的不断发展，城市污染越来越严重，人口老龄化发展，在中国，癌症死亡率逐年上升，已成为严重危害我国人口素质、阻碍社会发展的重大疾病。我国三次全国范围内的死因调查数据显示，近30年，中国癌症在死因中的构成比例由20 世纪70年代的10.13％上升至22.32％。

[0003] 癌症是由于控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病，细胞癌变的本质是细胞信号传导系统的失调，从而导致了癌细胞的快速生长与无限增殖。由磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)和其下游的蛋白激酶 B(PKB/Akt)、雷帕霉素靶体蛋白(mTOR)组成的PI3K-Akt-mTOR通路简称为 PI3K通路，在肿瘤的发生和发展中具有重要的作用，以PI3K/Akt信号通路中关键分子为靶点的小分子抑制剂已成为当前抗肿瘤药物研究的热点。

[0004] PI3K由脂类和丝/苏氨酸激酶组成的一个庞大家族，包括数个磷酯酰肌醇激酶和DNA依赖的蛋白激酶如ATM、ATR和DNA-PK等，它能使磷脂酰肌醇的第三位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的肌醇脂物质——磷脂酰肌醇-3-磷酸脂(PIP3)。第二信使PIP3可以使PI3K与下游的效应物(特别是Akt)配对结合，从而导致膜募集和磷酸化。研究表明:PI3K家族与细胞增殖、抗凋亡、细胞迁移、膜泡转运、细胞癌性转化等众多过程相关,这些生物效应主要是通过PI3K催化形成的“锚”分子3-磷酸肌醇脂(PIP，PIP2， PIP3)介导的。研究发现，在广泛人类肿瘤谱中PI3K通路普遍失调，该通路中某些基因突变所致的功能异常或缺失会引起正常细胞转化、促进肿瘤细胞增殖和存活并介导肿瘤细胞的侵袭和迁移，因此是小分子抑制剂的较佳作用靶位，为癌症的治疗提供了机会。

[0005] 近几年涉及PI3K的抑制作用的专利(WO2009055730/WO2009036082) 和相关报道(Journal ofMedicinal Chemistry,2008,51(18):5522-5532,Drugs ofthe Future,2007,32(6):537-547.)急剧增加，目前已经发现了该信号通路中多种激酶的小分子抑制剂，如天然产物渥曼青霉素(Wortmannin)及槲黄素类化合物LY294002是两种广泛应用的PI3K抑制剂，前者可与PI3K的多种亚型结合；Akt的抑制剂1L-6-hydroxymethyl-chiro-inositol 2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecylcarbonate，其选择性抑制Akt的IC50值大约是5μM，明显小于其抑制PI3K的IC50值90μM；p70S6K是PI3K-Akt信号通路的另一可行性靶点，免疫抑制剂Rapamycin(RPM)广泛应用于临床器官移植中，研究发现，RPM能够使p70S6K去磷酸化而抑制该激酶的活性，从而抑制肿瘤细胞的生长，目前已经在多种PTEN突变或PI3K-Akt通路活性上调的人类肿瘤细胞系中观察到RPM的选择性抗肿瘤活性。

[0006] 在PI3K家族中，I型PI3K能被细胞外信号所激活，因此是众多PI3K 亚型中迄今研究最为广泛的一类。目前，许多靶向I型PI3K的化合物已进入临床研究阶段，如：天然产物渥曼青霉素、PX-866、LY-294002、TGX-115、 TGX-155、PI-103、GDC-0941等，其中大部分是PI3K-mTOR双重抑制剂。

[0007] 文献报道的GDC-0941(如下结构式所示)属于噻吩并嘧啶类化合物，是由Genentech公司开发的口服PI3K抑制剂，目前已完成I期临床试验。 GDC-0941对p110α和δ的IC50值均达到3nM，为p110β、γ的10倍和25 倍，具有良好的选择性。临床前研究表明，GDC-
0941对多种人肿瘤细胞株 (包括胶质母细胞瘤、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞等)表现出显著的抑制增殖作用，其IC50值达0.009ug/mL。在裸鼠体内抗癌活性研究中，当口服剂量为75mg/kg，对肿瘤的增长抑制率达至80％以上。双芳基脲结构也广泛应用于抗癌小分子抑制剂的研究中，惠氏公司Venkatesan等人报道了一系列 1,3,5-三嗪类PI3K抑制剂，其中，PKI-587在体外和体内活性测试中均能很好地抑制癌细胞生长和增殖，并能促使其凋亡；物PKI-402是惠氏公司在 PKI-587和PKI-179的基础上改造得到的一个双芳基脲类似物，该化合物具有良好的理化性质和药代动力学性质，体外和体内生物标志物研究发现 PKI-402能阻断PI3K-Akt-mTOR通路并且能诱导癌细胞凋亡。

[0008]

发明内容

[0009] 本发明的目的就是提供一种含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物及其制备方法和应用。

[0010] 本发明提供如通式I所示含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物、其几何异构体及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，结构如下述通式I或Ⅱ所示：

[0011]

[0012] 其中：

[0013] X＝S，Y＝CH或X＝CH，Y＝S；

[0014] Z为苯环、五元或六元芳杂环；

[0015] A、B、D、E、G分别为CH或N；

[0016] R1选自H、

[0017] R2选自H或-CH3；

[0018] Ar为苯基、萘基、5～10元杂芳基、5～10元饱和或部分饱和的杂环基，所述杂芳基和杂环基含有1～3个选自O、N和S的杂原子，且Ar任选1～4 个相同或不同的R3取代；

[0019] R3选自氢、卤素、羟基、三氟甲基、三氟甲氧基、氨基、叠氮基、硝基、氰基、巯基、(C1～C4)烷基、(C3～C6)环烷基、(C2～C4)烯基、(C2～C4)炔基、 (C1～C4)烷氧基、(C1～C4)烷硫基、烯丙基、(2-甲基)烯丙基、(C1～C4)烷氧基甲基、(C1～C4)烷基酰基或(C1～C3)亚烷基二氧基的取代基；

[0020] R4、R5相同或不同，分别独立地选自(C1～C6)烷基或(C3～C6)环烷基；或者R4和R5与和它们所连接的氮原子一起形成5～10元饱和杂环基，所述饱和杂环基除了与R4和R5连接的氮原子外，任选含有1～3个选自O、N和S 的杂原子；

[0021] 本发明优选涉及如上述通式I或Ⅱ含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物、其几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，其中：

[0022] X＝S，Y＝CH或X＝CH，Y＝S；

[0023] Z为苯环或吡啶环；

[0024] A、B、D、E、G分别为CH或N；

[0025] R1选自H、

[0026] R2选自H或-CH3；

[0027] Ar为苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基或噻吩基，所述苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、噻吩基任选1～4个相同或不同的R3取代；

[0028] R3选自氢、卤素、羟基、三氟甲基、三氟甲氧基、氨基、叠氮基、硝基、氰基、巯基、(C1～C4)烷基、(C3～C6)环烷基、(C2～C4)烯基、(C2～C4)炔基、 (C1～C4)烷氧基、(C1～C4)烷硫基、烯丙基、(2-甲基)烯丙基、(C1～C4)烷氧基甲基、(C1～C4)烷基酰基或(C1～C3)亚烷基二氧基的取代基；

[0029] 本发明中，所述通式I或Ⅱ的含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物为选自下列化合物中的一种，但这些化合物并不意味着对本发明的任何限制：

[0030] 4-(4-乙基苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)吡啶酰胺、[0031] 4-(2,4-二氟苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)吡啶酰胺、[0032] 4-(3-氟苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)吡啶酰胺、[0033] N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)-4-苯基吡啶酰胺、

[0034] 4-(2,4-二甲基苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)吡啶酰胺、

[0035] 6-(4-甲氧基苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)嘧啶-4-甲酰胺、

[0036] N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)-6-(对甲苯基)嘧啶-4-甲酰胺、[0037] N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)-6-(4-(三氟甲基苯基)嘧啶-4-甲酰胺、

[0038] 5-(3-氟苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)吡啶酰胺、[0039] 5-(2,4-二氟苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)吡啶酰胺、[0040] N-(4-(-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)-4-苯基吡啶酰胺、

[0041] 4-(2,4-二氟苯基)-N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)吡啶酰胺、[0042] 4-(4-乙基苯基)-N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)吡啶酰胺、[0043] 4-(2,4-二甲基苯基)-N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)吡啶酰胺、

[0044] N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)-4-(对甲苯基)吡啶酰胺、[0045] 5-(3-氟苯基)-N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)吡啶酰胺、[0046] 5-(4-甲氧基苯基)-N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)吡啶酰胺、[0047] 6-(4-甲氧基苯基)-N-(4-(8-吗啉咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)嘧啶-4-甲酰胺、

[0048] 6-(4-溴苯基)-N-(4-(8-吗啉咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)嘧啶-4-甲酰胺、[0049] N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)-6-苯基嘧啶-4-甲酰胺、[0050] N-(5-(4-吗啉代噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)吡啶-2-基)-4-苯基吡啶酰胺、[0051] N-(5-(4-(3-甲基吗啉)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)吡啶-2-基)-4-苯基吡啶酰胺、[0052] N-(5-(6-((二甲基氨基)甲基)-4-(3-甲基吗啉)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)吡啶-2- 基)-4-(噻吩-2-基)吡啶酰胺、

[0053] N-(5-(8-(3-甲基吗啉基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)吡啶-2-基)-4-(噻吩-2-基)吡啶酰胺、

[0054] N-(5-(8-(3-甲基吗啉基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)吡啶-2-基)-4-苯基吡啶酰胺、

[0055] N-(5-(6-(2-羟基丙-2-基)-4-吗啉代噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)吡啶-2-基)-4-苯基吡啶酰胺、

[0056] N-(5-(4-吗啉代-6-(1,1,1-三氟-2-羟基丙-2-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)吡啶-2- 基)-4-苯基吡啶酰胺、

[0057] N-(5-(4,6-二吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)吡啶-2-基)-4-苯基吡啶酰胺。

[0058] 下面的合成路线描述了本发明通式I或Ⅱ含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物的制备，所有的原料都是通过合成路线中描述的方式、通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备的或者可商购。本发明的全部最终衍生物都是通过合成路线中描述的方法或通过与其类似的方法制备的，这些方法是有机化学领域普通技术人员熟知的。合成路线中应用的全部可变因数如下文的定义。

[0059]

[0060]

[0061] 路线1目标化合物I或Ⅱ的合成路线

[0062] 本发明通过路线1首先合成中间体12或13，再与不同取代基(如，吡啶酸类或嘧啶酸类)的侧链反应，得到目标化合物。

[0063] 按照本发明所属领域的一些通常方法，本发明中上述含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物可以与酸生成药学上可接受的盐。可药用加成盐包括无机酸和有机酸加成盐，与下列酸加成的盐是特别优选的：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。

[0064] 此外，本发明还包括本发明衍生物的前药。本发明衍生物的前药是上述含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物，它们自身可能具有较弱的活性甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。

[0065] 本发明中“卤素”是指氟、氯、溴或碘代；“烷基”是指直链或支链的烷基；“亚烷基”是指直链或支链的亚烷基；“环烷基”是指取代或未取代的环烷基；“饱和或部分饱和的杂环基”是指含有一个或多个选自N、 O、S的杂原子的单环或多环的环状体系，如吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、哌啶基、吡唑烷基、咪唑烷基和噻唑啉基等。

[0066] 本发明可以含有上述含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物，及药学上可接受的载体或赋型剂混合制备成组合物，并制备成临床上可接受的剂型，上述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。本发明的衍生物可以与其他活性成份组合使用，只要它们不产生其他不利的作用，例如过敏反应。

[0067] 本发明上述含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物用于患者的临床剂量可以根据：活性成分在体内的治疗功效和生物利用度、它们的代谢和排泄速率和患者的年龄、性别、疾病期来进行适当调整，不过成人的每日剂量一般应当为10～500mg，优选为50～300mg。因此，当本发明的药物组合物被制成单位剂型时，考虑到上述有效剂量，每单位制剂应当含有10～500mg上式Ⅰ的含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物，优选为50～300mg。按照医生或药师的指导，这些制剂可以以一定间隔分若干次给药(优选为一至六次)。

[0068] 本发明还提供了一种药用组合物，包括治疗有效量的上述通式I或Ⅱ含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物、其几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药作为活性成分以及药学上可接受的赋型剂。本发明的药用组合物可配制成若干种剂型，其中含有药物领域中一些常用的赋形剂。如上所述的若干种剂型可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物。

[0069] 用于本发明药物组合物的载体是药物领域中可得到的常见类型，包括：粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂、防腐剂、加溶剂和基质等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。

[0070] 本发明还发现上述含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物在制备治疗和/或预防增生性疾病药物中的应用。本发明的活性化合物或其可药用盐及其溶剂化物可作为唯一的抗增生性药物单独使用，或者可以与现已上市的抗增生性药物联合使用，用于治疗和/或预防增生性疾病，如牛皮癣、良性前列腺肥大、动脉粥样硬化和再狭窄。

[0071] 本发明还发现上述含酰腙结构的喹唑啉类化合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。本发明化合物体外具有抑制肿瘤细胞生长活性，因此，它可以用作制备治疗和/或预防癌症的药物，如乳腺、肺、肝脏、肾脏、结肠、直肠、胃、前列腺、膀胱、子宫、胰腺、骨髓、睾丸、卵巢、淋巴、软组织、头颈、甲状腺、食道的癌和白血病、成神经细胞瘤等。

[0072] 本发明还发现上述含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物，在制备治疗和/或预防肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌的药物中的应用。

[0073] 通过体外抑制肺癌细胞H460、人前列腺癌细胞PC-3和肝癌细胞株 SGC-7901活性试验、人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG，本发明化合物对肺癌细胞、前列腺癌细胞以及肝癌细胞具有显著抑制作用，特别用于制备治疗和/或预防前列腺癌、肺癌和肝癌的药物。

[0074] 通过对mTOR酶活性测试发现，本发明化合物具有显著的抑制mTOR 激酶活性，对mTOR高表达的肺癌细胞、人前列腺癌细胞、胶质母细胞等有较强的抑制作用，特别用于制备治疗和/或预防肺癌的药物。

[0075] 本发明的活性化合物或其可药用盐及其溶剂化物可作为唯一的抗肿瘤药物单独使用，或者可以与现已上市的抗肿瘤药物(如铂类药物顺铂、喜树碱类药物伊立替康、长春花碱类药物诺维本、脱氧胞昔类药物吉西他滨、足叶乙甙、紫杉醇等)联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时、顺序或隔开给药来实现。

[0076] 本发明设计合成了一系列新的杂环并嘧啶(吡嗪)类衍生物，经体外对 mTOR抑制剂高表达细胞株进行抗肿瘤活性筛选，结果表明具有较强的抗肿瘤活性和选择性。

具体实施方式

[0077] 为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但它们不对本发明构成限定。

[0078] 实施例旨在阐述而不是限制本发明的范围。衍生物的核磁共振氢谱用 BrukerARX-400测定，质谱用Agilent 1100 LC/MSD测定；所用试剂均为分析纯或化学纯。

[0079] 通式I或Ⅱ含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物：

[0080]

[0081] 本发明实施例1～28的结构式如下表1所示。

[0082] 表1实施例1～28的结构式

[0083]

[0084]

[0085]

[0086]

[0087] 步骤A 噻吩并[2,3-d]嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮(1)的制备

[0088] 在氮气保护下，将2-氨基噻吩-3-甲酸甲酯(10g)与尿素(30g)混合均匀，机械搅拌下升温至180℃，反应2h。反应完毕，冷却至100℃以下，将反应物倒入装有500mL的1mol/L的氢氧化钠溶液烧杯中，充分搅拌，过滤；用浓盐酸调滤液pH至6，析出泥状固体；抽滤，滤液冷藏12h后析出固体，抽滤得淡黄色产物，即噻吩并[2,3-d]嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮，收率： 56.1％。

[0089] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.94(s,1H,CONH),11.18(s,1H,CONH), 7.11(d,J＝16.0,5.6Hz,2H,2Ar-H)；ESI-MS[M-H]+m/z:167.2。

[0090] 步骤B 2,4-二氯噻吩并[2,3-d]嘧啶(2)的制备

[0091] 向1g干燥的噻吩并[2,3-d]嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮加入10g三氯氧磷，加入1滴DMF催化，升温至115℃，反应5h，反应完毕，将反应物缓慢加入碎冰中，同时剧烈搅拌，得棕黄色固体，抽滤，滤渣溶于50mL二氯甲烷，向溶液中加入1g活性炭和2g硅胶，升温至45℃回流脱色1h，趁热抽滤，蒸除溶剂，得淡黄色固体，即2,4-二氯噻吩并[2,3-d]嘧啶，收率：56.0％。

[0092] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.16(d,J＝3.4Hz,1H,Ar-H),7.62(d,J＝ 3.4Hz,1H,Ar-H).ESI-MS[M+H]+m/z:205.1。

[0093] 步骤C 4-(2-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)吗啉(3)的制备

[0094] 将1g的2,4-二氯噻吩并[2,3-d]嘧啶溶于20mL甲醇中，冰浴下滴加1mL 吗啉，逐渐升至室温，反应0.5h，析出固体，抽滤，得白色固体，即4-(2- 氯噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)吗啉，收率：86.1％。

[0095] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.70(s,1H,Ar-H),7.69–7.65(m,1H, Ar-H),3.96–3.86(m,4H,OCH2),3.75(d,J＝4.4Hz,4H,NCH2).ESI-MS [M+H]+m/z:256.1。

[0096] 步骤D 4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯胺(12)的制备

[0097] 将对溴苯胺(2g，0.01mol)、双(频哪醇合)二硼(3.8g，0.015mol)、醋酸钾(2.9g，0.03mol)、催化剂双三苯基磷二氯化钯(0.18g，0.00025mol) 溶于装有二氧六环50mL的三颈烧瓶中，持续通入氮气10min，升温至80℃，反应3h，溶液变黑，向反应体系中加入20mL水，反应2min，依次加入碳酸钠(2.1g，0.02mol)、催化剂双三苯基磷二氯化钯(0.18g，
0.00025mol) 和4-(2-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)吗啉(1.2g，0.006mol)。升温至100℃，反应8h。反应完毕，反应液减压蒸馏，除去部分溶剂，向剩余反应液中加入100mL水，析出黑色固体，抽滤，滤渣溶于二氯甲烷：甲醇＝5：1的溶液100mL中，向溶液中加入2g活性炭和5g硅胶，加热回流脱色1h，趁热抽滤，滤液蒸干得淡黄色固体，即4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯胺。

[0098] 步骤E 4-(4-乙基苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基) 吡啶酰胺

[0099] 将吡啶酸类侧链化合物溶于8mL二氯甲烷中，加入1滴干燥的DMF，逐滴滴加草酰氯(1.5倍当量)，将4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯胺的二氯甲烷和1mL的DIPEA混合溶液滴加至侧链的二氯甲烷溶液中，加毕反应10min，TLC检测反应完全后停止反应。

[0100] 反应液用饱和碳酸钠溶液洗涤2次，取有机层，蒸除溶剂，加入异丙醇搅拌30min，抽滤，滤渣溶于15mL二氯甲烷中，加入少量硅胶，搅拌 10min，抽滤，取滤液，蒸除溶剂，加入10mL异丙醇洗涤，抽滤得纯净固体产物。

[0101] 实施例1

[0102] 4-(4-乙基苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)吡啶酰胺[0103] 先按照步骤A～D合成中间体12，最后中间体12通过步骤E与吡啶酸类侧链化合物反应，得到4-(4-乙基苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)吡啶酰胺。

[0104] m.p.282-284℃；ESI-MS[M+H]+m/z:522.1；1H NMR(400MHz,DMSO) δ10.88(s,1H),8.78(d,J＝4.7Hz,1H),8.40(d,J＝7.2Hz,3H),8.08(d,J＝ 8.4Hz,2H),8.00(s,1H),7.83(d,J＝7.6Hz,2H),7.64(dd,J＝18.7,6.0Hz, 2H),7.41(d,J＝7.5Hz,2H),3.96(s,4H),
3.79(s,4H),2.68(d,J＝7.4Hz,2H), 1.23(d,J＝7.7Hz,3H).

[0105] 按照实施例1的方法，先按照步骤A～D合成中间体12，最后中间体12 通过步骤E与不同取代基(如，吡啶酸类或嘧啶酸类)的侧链反应，分别制得实施例2～10化合物。

[0106] 实施例2

[0107] 4-(2,4-二氟苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)吡啶酰胺[0108] m.p.255-256℃；ESI-MS[M+H]+m/z:530.1；1H NMR(400MHz,DMSO) δ10.90(s,1H),8.86(s,1H),8.40(d,J＝7.7Hz,2H),8.31(s,1H),8.07(d,J＝ 7.1Hz,2H),7.89(s,2H),
7.64(d,J＝13.0Hz,2H),7.51(s,1H),7.31(s,1H), 3.97(s,4H),3.79(s,4H).

[0109] 实施例3

[0110] 4-(3-氟苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)吡啶酰胺

[0111] m.p.281-283℃；ESI-MS[M+H]+m/z:512.1；1H NMR(400MHz,DMSO) δ10.90(s,1H),8.83(d,J＝4.5Hz,1H),8.47–8.36(m,2H),8.08(d,J＝8.6 Hz,3H),7.85–7.71(m,2H),
7.71–7.54(m,3H),7.48(d,J＝6.0Hz,1H),7.37 (s,1H),6.60(d,J＝8.3Hz,1H),3.97(s,
4H),3.78(s,4H).

[0112] 实施例4

[0113] N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)-4-苯基吡啶酰胺

[0114] m.p.223-225℃；ESI-MS[M+H]+m/z:494.1；1H NMR(400MHz,DMSO) δ10.87(s,1H),8.79(d,J＝12.7Hz,2H),8.41(d,J＝9.2Hz,2H),8.08(d,J＝ 7.7Hz,2H),7.77(d,J＝
7.0Hz,2H),7.64(d,J＝13.0Hz,2H),7.35(dd,J＝ 20.2,7.3Hz,3H),6.60(d,J＝8.2Hz,
1H),3.97(s,4H),3.79(s,4H).

[0115] 实施例5

[0116] 4-(2,4-二甲基苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)吡啶酰胺 + 1m.p.277-279℃；ESI-MS[M+H]m/z:522.2；H NMR(400MHz,DMSO)δ 10.87(s,1H),8.78(d,J＝4.7Hz,1H),8.66(s,1H),8.06(d,J＝8.3Hz,3H), 7.75–7.63(m,2H),7.20(dd,J＝20.4,
9.6Hz,5H),3.97(s,4H),3.79(s,4H), 2.25(d,J＝7.9Hz,6H).

[0117] 实施例6

[0118] 6-(4-甲氧基苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)嘧啶-4-甲酰胺

[0119] m.p.251-252℃；ESI-MS[M+H]+m/z:525.2；1H NMR(400MHz,CDCl3) δ10.50(s,1H),10.06(s,1H),9.26(s,1H),8.48(s,2H),8.22(d,J＝8.7Hz,3H), 7.90(d,J＝8.5Hz,1H),
7.69(d,J＝8.2Hz,1H),7.07(s,3H),3.91(s,8H).

[0120] 实施例7

[0121] N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)-6-(对甲苯基)嘧啶-4-甲酰胺[0122] m.p.244-245℃；ESI-MS[M+H]+m/z:509.2；1H NMR(400MHz,DMSO) δ9.38(s,1H),9.33(s,1H),8.53(s,1H),8.37(d,J＝8.4Hz,2H),8.19(d,J＝ 8.1Hz,3H),8.03(d,J＝
7.9Hz,2H),7.37(d,J＝7.0Hz,3H),3.93(s,4H),3.75 (s,4H),2.36(s,3H).

[0123] 实施例8

[0124] N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)-6-(4-(三氟甲基苯基)嘧啶-4-甲酰胺

[0125] m.p.266-267℃；ESI-MS[M+H]+m/z:563.1；1H NMR(400MHz,DMSO) δ9.50(s,1H),9.13(s,1H),8.68(s,1H),8.50(d,J＝8.1Hz,2H),8.37(t,J＝ 7.9Hz,2H),8.04(d,J＝
8.5Hz,1H),7.92(d,J＝7.5Hz,1H),7.85(d,J＝8.3 Hz,1H),7.72(s,1H),7.62(s,1H),7.59(s,1H),3.93(s,4H),3.75(s,4H).

[0126] 实施例9

[0127] 5-(3-氟苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)吡啶酰胺

[0128] m.p.262-263℃；ESI-MS[M+H]+m/z:512；1H NMR(400MHz,DMSO) δ10.75(s,1H),8.79(d,J＝5.0Hz,1H),8.55(s,1H),8.40(s,1H),8.00(s,2H), 7.98(s,2H),7.92(s,1H),
7.88(d,J＝7.3Hz,2H),7.56(d,J＝3.1Hz,2H), 7.53(s,1H),4.27(s,4H),3.80–3.74(m,
4H).

[0129] 实施例10

[0130] 5-(2,4-二氟苯基)-N-(4-(4-吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)苯基)吡啶酰胺[0131] m.p.287-289℃；ESI-MS[M+H]+m/z:530.1；1H NMR(400MHz,DMSO) δ10.77(s,1H),8.80(d,J＝4.6Hz,1H),8.55(s,1H),8.40(s,1H),8.00(s,2H), 7.98(s,2H),7.92(s,2H),
7.62(s,2H),7.56(s,1H),4.27(s,4H),3.77(s,4H).

[0132] 步骤F 3,5-二溴-2-氨基吡嗪(9)的制备

[0133] 向装有2-氨基吡嗪(14.27g，0.15mol)的三颈瓶中加入二氯甲烷 (200mL)和吡啶(25.3mL，0.315mol)的混合溶液；在避光、40℃条件下回流，缓慢滴加溴素(16.2mL，0.315mol)的二氯甲烷(100mL)溶液，反应过程中溶液由橙黄变为橘黄最终变为橘红色，约
1h滴加完毕；在40℃下继续回流30min；冷却至室温，向反应体系中加入蒸馏水(50mL)，剧烈搅拌10min，静置分层；收集下层液体，将收集到的液体用蒸馏水(100mL) 洗涤2次；将有机相移至装有硅胶(10g)和活性炭(1g)的烧瓶中，煮沸回流30min；抽滤，收集滤液并减压蒸馏，将蒸馏后得到的固体移至装有正己烷(45mL)的烧瓶中，在80℃下回流2h；趁热过滤，将所得固体产物干燥后称量，得灰黄色固体18.15g，即3,5-二溴-2-氨基吡嗪，收率为47.8％。

[0134] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ:8.14(s,1H),7.01(s,2H).

[0135] 步骤G 3-吗啉-5-溴-2-氨基吡嗪(10)的制备

[0136] 将吗啉(50mL)加入装有12.50g的3,5-二溴-2-氨基吡嗪的三颈烧瓶中，保持80℃下回流反应1h，TLC检测反应完成。将回流后的体系冷却至室温，加至装有冰水(300mL)的烧杯中不断搅拌，析出固体；抽滤、干燥后得到带有金属光泽的黄色固体12.30g，即3-吗啉-5-溴-2-氨基吡嗪，收率为96.1％。

[0137] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ:7.70(s,1H),6.28(s,2H),3.85-3.62(m, 4H),3.04(d,J＝4.0Hz,4H)。

[0138] 步骤H 4-(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)吗啉(11)的制备

[0139] 将4.4g氯乙醛与15mL异丙醇混合，取10mL混合溶液加入装有1.7g中间体10的圆底烧瓶中，升温至45℃开始反应1h；将剩余氯乙醛和异丙醇的混合溶液加至烧瓶中，升温至65℃反应，TLC检测反应完，停止反应。冷却至室温，加入装有300mL冰水的烧杯中，析出棕黄色固体，抽滤、干燥，得棕黄色固体产物，即4-(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)吗啉。

[0140] 步骤I 4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯胺(13)的制备

[0141] 参照步骤D方法，由4-(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)吗啉与对溴苯胺反应，制得4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯胺。

[0142] 步骤J N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)-4-苯基吡啶酰胺

[0143] 将吡啶酸类侧链化合物溶于8mL二氯甲烷中，加入1滴干燥的DMF，逐滴滴加草酰氯(1.5倍当量)，将4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯胺和1mL的DIPEA混合溶液滴加至侧链的二氯甲烷溶液中，加毕反应 10min，TLC检测反应完全后停止反应。

[0144] 反应液用饱和碳酸钠溶液洗涤2次，取有机层，蒸除溶剂，加入异丙醇搅拌30min，抽滤，滤渣溶于15mL二氯甲烷中，加入少量硅胶，搅拌 10min，抽滤，取滤液，蒸除溶剂，加入10mL异丙醇洗涤，抽滤得纯净固体产物，即N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)-4-苯基吡啶酰胺。

[0145] 实施例11

[0146] N-(4-(-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)-4-苯基吡啶酰胺

[0147] 先按照步骤F合成中间体9，中间体9与吗啉通过步骤G合成中间体 10，中间体10与氯乙醛反应通过步骤H合成中间体11，再由中间体11与对溴苯胺反应通过步骤I合成中间体13，最后中间体13通过步骤J与吡啶酸类侧链化合物反应，得到N-(4-(-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)-4- 苯基吡啶酰胺。

[0148] m.p.261-262℃；ESI-MS[M+H]+m/z:477.2；1H NMR(400MHz,DMSO) δ9.55(s,1H),7.59(d,J＝5.0Hz,1H),7.34(s,1H),7.20(s,1H),6.79(d,J＝ 7.8Hz,5H),6.74–6.65(m,
3H),6.34(dd,J＝8.4,4.3Hz,4H),3.07(s,4H), 2.61–2.51(m,4H).

[0149] 按照实施例11的方法，先按照步骤F合成中间体9，中间体9与R2取代的吗啉通过步骤G合成中间体10，中间体10与氯乙醛反应通过步骤H 合成中间体11，再由中间体11与对溴苯胺或5-溴吡啶-2胺反应通过步骤I 合成中间体13，最后中间体13通过步骤J不同取代基(如，吡啶酸类或嘧啶酸类)的侧链反应，分别制得实施例12～20化合物。

[0150] 实施例12

[0151] 4-(2,4-二氟苯基)-N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)吡啶酰胺[0152] m.p.266-267℃；ESI-MS[M+H]+m/z:513.2；1H NMR(400MHz,DMSO) δ10.76(s,1H),8.79(d,J＝5.1Hz,1H),8.52(s,1H),8.26(s,1H),7.96(d,J＝ 7.3Hz,4H),7.89(s,1H),
7.85–7.74(m,2H),7.52(s,1H),7.43(d,J＝9.6Hz, 1H),7.26(t,J＝8.3Hz,1H),4.23(s,
4H),3.74(d,J＝4.3Hz,4H).

[0153] 实施例13

[0154] 4-(4-乙基苯基)-N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)吡啶酰胺[0155] m.p.261-262℃；ESI-MS[M+H]+m/z:505.2；1H NMR(400MHz,DMSO) δ10.88(s,1H),8.78(d,J＝4.7Hz,1H),8.40(d,J＝7.2Hz,3H),8.08(d,J＝ 8.4Hz,2H),8.03(s,1H),7.74(d,J＝7.6Hz,2H),7.54(dd,J＝18.7,6.0Hz, 2H),7.50(d,J＝7.5Hz,1H,7.45(d,J＝
7.5Hz,2H),3.91(s,4H),3.77(s,4H), 2.68(d,J＝7.4Hz,2H),1.23(d,J＝7.7Hz,3H).[0156] 实施例14

[0157] 4-(2,4-二甲基苯基)-N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)吡啶酰胺[0158] m.p.234-235℃；ESI-MS[M+H]+m/z:505.2；1H NMR(400MHz,DMSO) δ10.83(s,1H),8.77(d,J＝5.0Hz,1H),8.62(s,1H),8.00(dd,J＝17.9,9.6Hz, 6H),7.69–7.63(m,2H),
7.25–7.11(m,3H),4.20(s,4H),3.77(s,4H),2.28(d, J＝29.3Hz,6H).

[0159] 实施例15

[0160] N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)-4-(对甲苯基)吡啶酰胺

[0161] m.p.271-273℃；ESI-MS[M+H]+m/z:491.2；1H NMR(400MHz,DMSO) δ9.87(s,1H),7.90(d,J＝5.2Hz,1H),7.56(s,1H),7.44(s,1H),7.22–7.15 (m,3H),6.95(d,J＝8.5Hz,
3H),6.73(s,1H),6.54(s,4H),3.45(s,4H),3.15– 2.68(m,4H),0.68–0.16(m,3H).[0162] 实施例16

[0163] 5-(3-氟苯基)-N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)吡啶酰胺

[0164] m.p.261-264℃；ESI-MS[M+H]+m/z:495.2；1H NMR(400MHz,CDCl3) δ10.18(s,1H),8.85(s,2H),8.40(d,J＝8.1Hz,2H),8.29(d,J＝8.1Hz,1H), 8.09(s,3H),7.88(s,1H),
7.75(s,1H),7.52(d,J＝5.1Hz,1H),7.45(s,1H), 7.36(d,J＝9.2Hz,1H),7.20(d,J＝
9.0Hz,1H),4.17(s,4H),4.03(s,4H).

[0165] 实施例17

[0166] 5-(4-甲氧基苯基)-N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)吡啶酰胺[0167] m.p.255-257℃；ESI-MS[M+H]+m/z:507.2；1H NMR(400MHz,DMSO) δ11.05(s,1H),8.74(d,J＝5.1Hz,1H),8.57(s,1H),8.47(s,1H),8.03(d,J＝ 8.6Hz,2H),8.02(s,2H),
7.87(d,J＝9.8Hz,2H),7.86(d,J＝8.6Hz,2H),7.51 (s,1H),7.14(d,J＝8.6Hz,2H),4.32(s,4H),4.19(s,2H),3.85(d,J＝3.9Hz, 3H).

[0168] 实施例18

[0169] 6-(4-甲氧基苯基)-N-(4-(8-吗啉咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)嘧啶-4-甲酰胺

[0170] m.p.269-271℃；ESI-MS[M+H]+m/z:508.2；1H NMR(400MHz,DMSO) δ10.96(s,1H),9.38(s,1H),8.57(d,J＝22.1Hz,2H),8.46(s,1H),8.32(d,J＝ 8.0Hz,2H),8.03(dd,J＝
14.7,8.4Hz,4H),7.96(s,1H),7.59(s,1H),7.14(d,J ＝8.1Hz,2H),4.29(s,4H),3.87(s,
3H),3.80(s,4H).

[0171] 实施例19

[0172] 6-(4-溴苯基)-N-(4-(8-吗啉咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)嘧啶-4-甲酰胺[0173] m.p.221-223℃；ESI-MS[M+H]+m/z:557.1；1H NMR(400MHz,DMSO) δ10.91(s,1H),9.49(s,1H),8.65(s,1H),8.59(d,J＝11.9Hz,2H),8.38(d,J＝ 8.3Hz,2H),8.00–7.94(m,
3H),7.85(d,J＝8.3Hz,2H),7.59(d,J＝2.7Hz, 2H),4.30(s,4H),3.79(d,J＝4.0Hz,4H)[0174] 实施例20

[0175] N-(4-(8-吗啉代咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯基)-6-苯基嘧啶-4-甲酰胺

[0176] m.p.272-275℃；ESI-MS[M+H]+m/z:478.1；1H NMR(400MHz,DMSO) δ10.79(s,1H),8.75(d,J＝5.1Hz,1H),8.58(s,1H),8.39(s,1H),8.04(d,J＝ 8.7Hz,2H),8.01(s,1H),
7.98(d,J＝6.3Hz,2H),7.95(s,1H),7.89(d,J＝8.5 Hz,2H),7.58(s,1H),7.13(d,J＝
8.5Hz,2H),4.29(s,4H),3.80(d,J＝4.3Hz, 4H).

[0177] 实施例21

[0178] N-(5-(4-吗啉代噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)吡啶-2-基)-4-苯基吡啶酰胺

[0179] ESI-MS[M+H]+m/z:494.2

[0180] 实施例22

[0181] N-(5-(4-(3-甲基吗啉)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)吡啶-2-基)-4-苯基吡啶酰胺[0182] ESI-MS[M+H]+m/z:509.2

[0183] 实施例23

[0184] N-(5-(6-((二甲基氨基)甲基)-4-(3-甲基吗啉)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)吡啶-2- 基)-4-(噻吩-2-基)吡啶酰胺

[0185] ESI-MS[M+H]+m/z:572.2

[0186] 实施例24

[0187] N-(5-(8-(3-甲基吗啉基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)吡啶-2-基)-4-(噻吩-2-基)吡啶酰胺

[0188] ESI-MS[M+H]+m/z:498.2

[0189] 实施例25

[0190] N-(5-(8-(3-甲基吗啉基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)吡啶-2-基)-4-苯基吡啶酰胺

[0191] ESI-MS[M+H]+m/z:492.2

[0192] 实施例26

[0193] N-(5-(6-(2-羟基丙-2-基)-4-吗啉代噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)吡啶-2-基)-4-苯基吡啶酰胺

[0194] ESI-MS[M+H]+m/z:553.2

[0195] 实施例27

[0196] N-(5-(4-吗啉代-6-(1,1,1-三氟-2-羟基丙-2-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)吡啶 -2-基)-4-苯基吡啶酰胺

[0197] ESI-MS[M+H]+m/z:607.2

[0198] 实施例28

[0199] N-(5-(4,6-二吗啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)吡啶-2-基)-4-苯基吡啶酰胺[0200] ESI-MS[M+H]+m/z:580.2

[0201] 体外细胞毒活性

[0202] 对按照本发明通式I或Ⅱ的含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物进行了体外抑制肺癌细胞H460、结肠癌细胞HT-29、人乳腺癌细胞 MDA-MB-231、人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG、人肺癌细胞H1975和肝癌细胞株SMMC-7721活性筛选，对照品GDC-0941按照文献(J.Med.Chem., 2008,51(18),pp 5522–5532)所述方法制备得到。

[0203] 1)细胞复苏并传代2～3次稳定后，用胰蛋白酶溶液(0.25％)使其从培养瓶底部消化下来。将细胞消化液倒入离心管中后，之后加入培养液以终止消化。将离心管在800r/min下离心10min，弃去上清液后加入5mL培养液，吹打混匀细胞，吸取10μL细胞混悬液加入细胞计数板中计数，调整细胞浓度为104个/孔。96孔板中除A1孔为空白孔不加细胞外，其余皆加入100μL 细胞混悬液。将96孔板放入培养箱中培养24h。

[0204] 2)用50μL二甲基亚砜溶解受试样品，然后加入适量培养液，使样品溶解成2mg/mL药液，然后在24孔板中将样品稀释为20、4、0.8、0.16、 0.032μg/mL。

[0205] 每个浓度加入3孔，其中周围两行两列细胞长势受环境影响较大，只和为空白细胞孔使用。将96孔板放入培养箱中培养72h。

[0206] 3)将96孔板中带药培养液弃去，用磷酸缓冲溶液(PBS)将细胞冲洗两遍，在每孔中加入MTT(四氮唑)(0.5mg/mL)100μL放入培养箱中4h后，弃去MTT溶液，加入二甲基亚砜100μL。在磁力振荡器上振荡使存活细胞与 MTT反应产物充分溶解，放入酶标仪中测定结果。通过Bliss法可求出药物 IC50值。

[0207] 化合物的抑制肺癌细胞H460、结肠癌细胞HT-29、人乳腺癌细胞 MDA-MB-231、人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG、人肺癌细胞H1975和肝癌细胞株SMMC-7721活性结果见表2。

[0208] PI3Kα酶活性实验

[0209] 1、溶液配制

[0210] 1)待测化合物加1mL DMSO，配成10mM储存溶液。阳性化合物GDC-0941 储存液浓度为10mM(溶于DMSO)，阳性化合物顺铂的储存液浓度为 2mM(溶于DMSO)。

[0211] 2)用DMSO稀释化合物储存液，配成2mM溶液(100X)。

[0212] 3)取2μL2mM溶液，加入18μL反应液稀释化合物至200μM(10X)溶液。

[0213] 4)在工作板中加入2μL上述溶液及18μL反应液，配成10X溶液。

[0214] 5)取以上板中溶液1μL到检测板。

[0215] 6)检测板的全抑制对照和零抑制对照孔中加入1μL激酶反应液，使得 DMSO的浓度为10％。

[0216] 2、实验步骤

[0217] 1)孔板的布局根据实验需要把384孔板布置好，其中：

[0218] a)HPE(全抑制对照)：不加激酶和化合物，加ATP，底物和1％DMSO。

[0219] b)ZPE(零抑制对照)：不加化合物，加激酶，ATP，底物和1％DMSO。

[0220] c)阳性对照化合物孔：加激酶，ATP，底物和不同浓度阳性化合物。

[0221] d)待测化合物孔：加激酶，ATP，底物和待测化合物。

[0222] 2)所用试剂配制

[0223] 4XATP：用反应液将ATP稀释至4X。

[0224] 4X底物溶液：用反应液将底物稀释至4X。

[0225] 2.5X激酶溶液：用反应液将激酶稀释至2.5X。

[0226] 3)激酶反应

[0227] a)按照布置每孔加入1μL10X化合物(待测化合物或各种激酶的阳性对照物)溶液，全抑制对照及零抑制对照孔加入1μL反应液。

[0228] b)按照布置每孔加入4μL2.5X激酶溶液。全抑制对照孔加入4μL反应液。

[0229] c)将检测板1000rpm离心以混匀。

[0230] d)将4XATP溶液与4X底物溶液等体积混合，得到2XATP-底物溶液。

[0231] e)按照布置每孔加入5μL上述2XATP-底物溶液。

[0232] f)将检测板1000rpm离心以混匀。

[0233] g)将检测板置于30℃反应1小时。

[0234] h)每孔加入10μLKinase glo plus或ADP-Glo反应试剂，27℃放置20分钟。

[0235] i)每孔加入20μLKinase Detection试剂，27℃放置30分钟。

[0236] j)Envision读取荧光数值。

[0237] 注意:Kinase glo plus，ADP-Glo及Kinase Detection试剂使用之前需预置室温半小时。

[0238] 4)原始数据分析

[0239] Prism5.0分析原始数据。

[0240] 按照Bliss法计算化合物的IC50

[0241] 实验结果如表2所示。表1中IC50>＝80％，以“+++”表示， 80％>IC50>＝60％，以“++”表示，60％>IC50>＝40％，以“+”表示，IC50<＝40％，以“-”表示，“NA”表示无活性，“ND”表示未测试。

[0242] 表2目标化合物体外抗肿瘤活性和酶活性

[0243]

[0244] 从上述试验结果可以清楚地看出，本发明所要保护的通式I或Ⅱ的含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物，具有良好的体外抗肿瘤活性。

[0245] 本发明中通式I或Ⅱ的含联芳基酰胺结构的杂环并嘧啶或吡嗪类化合物可单独施用，但通常是和药用载体混合物给予，所述药用载体的选择要根据所需用药途径和标准药物实践，下面分别用该类化合物的各种药物剂型，例如片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂和软膏剂的制备方法，说明其在制药领域中的新应用。

[0246] 应用例1：片剂

[0247] 以实施例2化合物6g，按照药剂学一般压片法加辅料12g混匀后，压制成100片，每片重180mg。

[0248] 应用例2：胶囊剂

[0249] 以实施例8化合物10g，按照药剂学胶囊剂的要求将辅料20g混匀后，装入空心胶囊，每个胶囊重150mg。

[0250] 应用例3：注射剂

[0251] 以实施例9化合物10g，按照药剂学常规方法，进行活性炭吸附，经 0.65μm微孔滤膜过滤后，填入氮气罐制成水针制剂，每只装2mL，共灌装 100瓶。

[0252] 应用例4：气雾剂

[0253] 以实施例12化合物20g，用适量丙二醇溶解后，加入蒸馏水及其他辐料后，制成100mL的澄清溶液即得。

[0254] 应用例5：栓剂

[0255] 以实施例15化合物5g，将之研细加入甘油适量，研匀后加入已熔化的甘油明胶，研磨均匀，倾入已涂润滑剂的模型中，制得栓剂25颗

[0256] 应用例6：膜剂

[0257] 以实施例17化合物5g，将聚乙烯醇、药用甘油、水等搅拌膨胀后加热溶解，80目筛网过滤，再将实施例12化合物加入到滤液中搅拌溶解，涂膜机制膜50片。

[0258] 应用例7：滴丸剂

[0259] 以实施例18化合物15g，与明胶等基质50g加热熔化混匀后，滴入低温液体石蜡中，共制得滴丸1000丸。

[0260] 应用例8：外用搽剂

[0261] 以实施例20化合物20g，按照常规药剂学方法与乳化剂等辅料5g混合研磨，再加蒸馏水至400mL制得。

[0262] 应用例9：软膏剂

[0263] 以实施例24化合物5g，研细后与凡士林等油性基质250g研匀制得。

[0264] 尽管已经通过特定实施方案描述了本发明，但修改和等价变化对于精通此领域的技术人员而言是显见的，且它们都包含在本发明范围之内。