一种小核菌多糖高效提取纯化方法及其应用

摘要

本发明公开一种小核菌多糖高效提取纯化方法及其应用，包括：(1)以含菌丝体的硬葡聚糖粗品或者高浓度硬葡聚糖发酵液原料，稀释碱溶后进行微波强化溶解；(2)将步骤(1)中所得硬葡聚糖溶液进行分离，其方法是板框过滤或离心分离除去不溶性菌丝体，并采用水洗涤所得菌丝体，所得洗涤液合并入硬葡聚糖溶液；(3)中和除菌后的硬葡聚糖溶液；(4)采用超滤膜处理硬葡聚糖溶液，脱盐并浓缩，用水洗涤硬葡聚糖浓缩液并继续脱盐；(5)采用乙醇沉淀硬葡聚糖并洗涤，干燥后获得产品。通过本发明一系列的物理方法处理，建立了一条稳定高效的硬葡聚糖制备工艺，不需要进行化学反应，减少了成品中的杂质组分，所得目标产品硬葡聚糖产品纯度高达90％以上。

权利要求

1.一种高纯度高品质硬葡聚糖产品的制备方法，其特征是，包括以下步骤：(1)以含菌丝体的硬葡聚糖粗品或者高浓度硬葡聚糖发酵液原料，将其稀释碱溶后进行微波强化溶解；

所述稀释碱溶的具体步骤为：向含菌丝体的硬葡聚糖粗品或者高浓度硬葡聚糖发酵液中加入碱溶液，使得碱终浓度为0.05～0.35mol/L，硬葡聚糖浓度为0.8～1.2％w/v；

所述微波强化溶解的具体工艺参数为：微波频率为900～1500MHz，处理2～5次，间隔2～5min，每次5～20s；

(2)将步骤(1)中所得硬葡聚糖溶液进行固液分离，除去不溶性菌丝体，并采用水洗涤所得菌丝体，所得洗涤液合并入硬葡聚糖溶液；

(3)中和除菌后的硬葡聚糖溶液；

(4)采用超滤膜处理中和除菌后的硬葡聚糖溶液，脱盐并浓缩，用水洗涤硬葡聚糖浓缩液并继续脱盐；

(5)采用乙醇沉淀硬葡聚糖并洗涤，干燥后获得高纯硬葡聚糖产品，所述硬葡聚糖产品纯度在90％以上，其质量浓度为1％溶液的粘度大于等于1200mPa.s以上；

其中，所述乙醇的体积分数为60～85％v/v；处理结束后，采用5000～8000g离心5-

15min后，得沉淀再采用体积分数为90～95％v/v乙醇溶液洗涤两次，5000～8000g离心5-

10min后所得沉淀即为目标硬葡聚糖产物。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(1)中，高浓度硬葡聚糖发酵液中葡聚糖的质量分数为2.5％w/w及其以上。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(1)中，所述碱是NaOH或KOH。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(2)中，采用板框过滤或离心分离除去不溶性菌丝体。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是：板框过滤的滤布孔径是150～300目；离心分离条件是5000～8000g，离心15～30min。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(3)中，采用稀盐酸或稀硫酸中和硬葡聚糖溶液，[H+]浓度为0.25～1.0mol/L。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(4)中，超滤膜截留分子量范围是

50000～200000Da，并控制温度在45℃以下。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(4)中，采用目的硬葡聚糖溶液体积2～4倍体积的蒸馏水对浓缩液进行洗涤，并控制温度在45℃以下。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征是：步骤(4)中，硬葡聚糖溶液浓缩液中硬葡聚糖含量为1.0～1.5％w/v。

10.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(5)中，干燥温度为60～80℃，干燥时间为60～180min，即获得高纯度高品质硬葡聚糖产品。

11.采用权利要求1～10中任一项所述的方法制备得到的高纯度高品质硬葡聚糖产品，其特征是：所述硬葡聚糖产品纯度在90％以上，其质量浓度为1％溶液的粘度大于等于

1200mPa.s以上。

说明书

一种小核菌多糖高效提取纯化方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种微生物多糖小核菌多糖高效提取纯化方法与应用，属于微生物多糖制备技术领域。

背景技术

[0002] 小核菌多糖(Scleroglucan)又称硬葡聚糖或小核菌胶，是一种由丝状真菌小核菌合成分泌的一种水溶性非离子胞外多糖，水溶液具有良好的流变特性和稳定性。硬葡聚糖分子是由含有β-D-(1,6)-葡萄糖残基侧链的线性β-D-(1,3)-葡萄糖残基链组成，分子量约5～6×106Da，分子以棒状三螺旋形式存在，具有半刚性。硬葡聚糖水溶液具有耐高温(可达
120℃)、耐高盐(最高可达20,0000mg/L)、耐酸碱(pH2～12范围内稳定)、抗高剪切、持水性好并且环境友好等诸多突出特性。因此硬葡聚糖在食品、医药、化妆品、石油等工业领域具有良好的应用价值。目前在国际市场中，硬葡聚糖作为保湿、抗炎、增稠成分普遍应用在化妆品中，常被国际知名化妆品品牌所采用。硬葡聚糖还能够提高原油采收率，在当前普遍进入三次采油的趋势下，其具有广阔的应用前景。研究报道表明硬葡聚糖在所试的140多种聚合物中耐温性能最好，同时具有良好的耐盐性和抗剪切性，可用作增稠剂、悬浮剂、稳定剂等，在油田钻采助剂领域具有广阔的应用前景。

[0003] 由于硬葡聚糖分子在水溶液中形成稳定的三螺旋结构，且生产菌为丝状真菌，因此在硬葡聚糖大量产生后，在发酵液中形成非常稳定的微凝胶或超分子结构，该结构严重影响了硬葡聚糖发酵产量的进一步提高和后提取纯化。基于以上难题，目前在硬葡聚糖发酵生产过程中，多采用直接乙醇沉淀提取产生含有菌丝体的硬葡聚糖粗品或采用高温高剪切破坏微凝胶等高耗能技术进行除菌提纯的硬葡聚糖精品。此外，专利CN102154408A也报道了在硬葡聚糖发酵生产早期浓度较低时即进行在线膜分离提取的技术路线，但工艺过程复杂，生产成本居高不下。还有一些采用生物酶解预处理方法提纯硬葡聚糖，生物酶类物质成本高，并且需要控制酶反应温度，反应时间较长，特别是处理小核菌多糖高粘溶液，反应混合时间更长，而且引入了酶类杂质，成本较高，这些条件并不利于工业生产。现有技术中的提纯方法都影响了硬葡聚糖产业和市场应用的发展。

发明内容

[0004] 本发明根据以上技术缺陷结合硬葡聚糖分子的理化性质，通过大量研究实验开发出高效硬葡聚糖提取纯化的工业制备技术，以简单低成本的技术工艺进行硬葡聚糖除菌获得高纯度高品质的硬葡聚糖产品。

[0005] 本发明采用的技术方案如下：

[0006] 本发明的第一个目的是提供了一种高纯度高品质硬葡聚糖产品的制备方法，包括以下步骤：

[0007] (1)以含菌丝体的硬葡聚糖粗品或者高浓度硬葡聚糖发酵液原料，将其稀释碱溶后进行微波强化溶解；

[0008] (2)将步骤(1)中所得硬葡聚糖溶液进行固液分离，除去不溶性菌丝体，并采用水洗涤所得菌丝体，所得洗涤液合并入硬葡聚糖溶液；

[0009] (3)中和除菌后的硬葡聚糖溶液；

[0010] (4)采用超滤膜处理中和除菌后的硬葡聚糖溶液，脱盐并浓缩，用水洗涤硬葡聚糖浓缩液并继续脱盐；

[0011] (5)采用乙醇沉淀硬葡聚糖并洗涤，干燥后获得高纯硬葡聚糖产品。

[0012] 本发明中，所述高纯度是指所述产品中的硬葡聚糖的纯度大于等于90％，或者大于等于92％、93％、95％，优选的为等于92.8％、93.5％、95.5％等。

[0013] 本发明中，所述高品质是指所述产品的粘度高，其1％(w/v)溶液的粘度在1200mPa.s以上(美国Brookfield DV2T：3#转子，60r/min，25℃测定)。

[0014] 步骤(1)中，含菌丝体的硬葡聚糖粗品的纯度为40～70％，含菌丝体的硬葡聚糖粗品可以由现有技术中的多种方法制备得到，属于常规技术手段；含菌丝体的硬葡聚糖粗品或者高浓度硬葡聚糖发酵液可以由现有技术中的多种方法制备得到，属于常规技术手段。

[0015] 优选的，所述高浓度硬葡聚糖发酵液中葡聚糖的质量分数为2.5％(w/v)及其以上，优选为2.5～5％(w/v)，当质量分数大于等于2.5％(w/v)时，发酵液中含有显著微凝胶颗粒。

[0016] 硬葡聚糖的分子结构有一定的刚性，在水溶液中有很强的聚集倾向，易发生超分子结构，产生微凝胶，严重影响了硬葡聚糖发酵产量的进一步提高和后提取纯化。

[0017] 所述稀释碱溶的具体步骤为：向含菌丝体的硬葡聚糖粗品或者高浓度硬葡聚糖发酵液中加入碱溶液，使得碱终浓度为0.05～0.35mol/L，硬葡聚糖浓度为0.8～1.2％(w/v)。优选的碱是NaOH或KOH。

[0018] 加入碱对含菌丝体的硬葡聚糖粗品或者高浓度硬葡聚糖发酵液进行物理稀释和溶解，使得硬葡聚糖的粘度降低，降低原理是在一定pH范围下，破坏了硬葡聚糖大分子之间的氢键，而选择碱终浓度的原则是：在降低粘度的同时还需保证所得产品具有较高品质。经过试验验证，本发明选择碱终浓度为0.05～0.35mol/L，硬葡聚糖浓度为0.8～1.2％(w/v)，确保了产品的高纯度和高品质。

[0019] 在提高产品纯度和收率上，本发明采用了微波强化溶解，一方面，微波辐射能穿透稀释碱溶后的硬葡聚糖溶液，达到物料内部，物料吸收微波能，内部温度迅速上升，增大被分离物质在介质中的溶解度，使硬葡聚糖分子形成的三螺旋结构完全破坏而溶于水，从而使菌体可易于分离。另一方面，微波能够透射到生物组织内部使偶极分子和蛋白质的极性侧链以极高的频率振荡，引起分子的电磁振荡等作用，加之稀释碱溶的作用下，能够降解破坏溶液中的杂蛋白，使其降解为小分子多肽，以更有利于后续醇沉的操作，在醇沉过程中，小分子多肽不会被絮凝沉淀。另外，稀释碱溶后的硬葡聚糖溶液中含有菌丝体，菌丝体吸收微波能，细胞内部温度迅速上升，使细胞内部压力超过细胞壁膨胀承受能力，细胞破裂，使菌丝体内的硬葡聚糖溶出，既杀灭了菌体提高产品品质又增加了硬葡聚糖的收率。综上，稀释碱溶以及微波强化溶解两个操作具有协同作用，是本发明的关键技术之一。从综合效果考虑，本发明选取了合适的微波强化溶解工艺参数：微波频率为900～1500MHz，处理2～5次，间隔2～5min，每次5～20s。采用间歇式的微波强化溶解工艺参数，能够提高溶解的效率，降低能耗。采用该工艺参数，具有较为出乎意料的技术效果，纯度和收率都比较高，在本发明的一个具体实施例中，可高达95.5％。

[0020] 优选的，所述微波频率为1250～1500MHz，处理2～3次，间隔4～5min，每次10～20s。

[0021] 步骤(2)中，采用板框过滤或离心分离除去不溶性菌丝体。

[0022] 优选的，板框过滤的滤布孔径是150～300目。

[0023] 优选的，离心分离条件是5000～8000g，离心15～30min。

[0024] 步骤(3)中，优选的，采用稀盐酸或稀硫酸中和硬葡聚糖溶液，为不破坏硬葡聚糖+分子的结构，进一步优选的，[H]浓度为0.25～1.0mol/L。

[0025] 步骤(4)中，采用超滤膜处理中和除菌后的硬葡聚糖溶液，优选的，超滤膜截留分子量范围是50000～200000Da，并控制温度在45℃以下；优选的，采用目的硬葡聚糖溶液体积2～4倍体积的蒸馏水对浓缩液进行洗涤，并控制温度在45℃以下；优选的，硬葡聚糖溶液浓缩液中硬葡聚糖含量为1.0～1.5％(w/v)，此浓度更有利于醇沉除杂。

[0026] 步骤(5)中，优选的，所述乙醇的体积分数为60～85％(v/v)，处理时间为30～60min。经过试验验证，当乙醇体积分数为60～85％(v/v)，使得硬葡聚糖产品的纯度较高。

[0027] 处理结束后，采用5000～8000g离心5-15min后，得沉淀再采用体积分数为90～95％(v/v)乙醇溶液洗涤两次，5000～8000g离心5-10min后所得沉淀即为目标硬葡聚糖产物。

[0028] 得到目标硬葡聚糖产物后，进行恒温干燥，优选的，干燥温度为60～80℃，干燥时间为60～180min，即获得高纯度高品质硬葡聚糖产品。

[0029] 本发明的第二个目的是提供一种采用上述方法制备得到的高纯度高品质硬葡聚糖产品，其中，所述硬葡聚糖产品纯度在90％以上，其质量浓度为1％(w/v)溶液的粘度为1200mPa.s及其以上(美国Brookfield DV2T：3#转子，60r/min，25℃测定)。

[0030] 质量浓度为1％(w/v)溶液是指将硬葡聚糖产品配制成硬葡聚糖的水溶液，其中硬葡聚糖的含量为1％。

[0031] 初始发酵液中含有1％(w/v)的硬葡聚糖或采用粗品制备得到的1％(w/v)的硬聚糖水溶液时，其粘度只有300～400mPa.s，现有技术中的硬葡聚糖产品的粘度为800～1000mPa.s(美国Brookfield DV2T：3#转子，60r/min，25℃测定)，而采用本发明的方法制备得到的硬葡聚糖产品的粘度高达1200mPa.s及其以上，与现有技术中的粘度相比两者具有显著差异。

[0032] 上述技术方案具有如下有益效果：

[0033] (1)本发明提供了一套低成本高效提取纯化硬葡聚糖的工业制备技术，所得硬葡聚糖产品纯度高，品质好，其显著优于现有市场产品；

[0034] (2)通过本发明一系列的物理方法处理(碱溶无化学反应属于物理溶解过程)，建立了一条稳定高效的硬葡聚糖制备工艺，不需要进行化学反应，减少了成品中的杂质组分，所得目标产品硬葡聚糖产品纯度高达90％以上，能够实现大规模的工业生产；

[0035] (3)目标产品高纯硬葡聚糖产品的收率高达到85％以上；

[0036] (4)本发明的技术步骤为不引入任何化学或有害其他杂质，确保的所得产品的生物安全；

[0037] (5)相比于酶法提纯硬葡聚糖，本发明高纯硬葡聚糖产品的生产周期较短，不需要长时间控制反应温度，降低成本，适合大规模推广使用。

具体实施方式

[0038] 应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0039] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

[0040] 本发明中，产品收率(％)＝本发明硬葡聚糖产品的质量/原料中硬葡聚糖的质量×100％。

[0041] 实施例1

[0042] 一种高效的高纯度硬葡聚糖产品提取纯化的具体工艺步骤内容如下：

[0043] (1)原料：硬葡聚糖粗品，纯度为50～60％；

[0044] (2)碱溶：硬葡聚糖终浓度0.8％(w/v)，NaOH的终浓度为0.1mol/L；

[0045] (3)微波强制溶解，微波频率在900MHz，处理2次，间隔3min，每次15s；

[0046] (4)固液分离；将步骤(3)中完全溶解的硬葡聚糖溶液进行板框过滤，滤布孔径200目，并用1～2倍体积的蒸馏水洗涤滤饼，所得洗液合并入滤液；

[0047] (5)中和：采用[H+]为0.5mol/L的盐酸中和(4)中所得硬葡聚糖溶液；

[0048] (6)超滤脱盐浓缩：将步骤(5)中获得的硬葡聚糖中和溶液进行超滤脱盐并浓缩，超滤膜膜截留分子量范围是100000Da，并控制温度在45℃以下，采用硬葡聚糖溶液体积2倍体积的蒸馏水对超滤浓缩的硬葡聚糖溶液进行洗涤，并控制温度在45℃以下，硬葡聚糖浓缩液中硬葡聚糖的含量是1.2％(w/v)；

[0049] (7)乙醇沉淀，向步骤(6)中所得硬葡聚糖浓缩液中加入一定体积的乙醇，沉淀硬葡聚糖，乙醇体积分数为65％(v/v)，8000g离心15min后，得沉淀再采用体积分数为90％(v/v)乙醇溶液洗涤两次，8000g离心10min后所得沉淀即为硬葡聚糖产物；

[0050] (8)干燥，将步骤(7)中所得沉淀进行恒温干燥，温度为70℃，干燥时间90min，即获得了目的高纯度硬葡聚糖产品。

[0051] 经检测，该硬葡聚糖产品的纯度为93.5％，产品收率为88％，1％(w/v)溶液粘度为1380mPa.s(美国Brookfield DV2T：3#转子，60r/min，25℃测定)。

[0052] 实施例2

[0053] 一种高效的高纯度硬葡聚糖产品提取纯化的具体工艺步骤内容如下：

[0054] (1)原料：高含量硬葡聚糖发酵液，硬葡聚糖含量2.5％(w/v)；

[0055] (2)碱溶：硬葡聚糖终浓度1.0％(w/v)，KOH的终浓度为0.25mol/L；

[0056] (3)微波强制溶解，微波频率在1250MHz，处理3次，间隔4min，每次20s；

[0057] (4)固液分离；将步骤(3)中完全溶解的硬葡聚糖溶液进行板框过滤，滤布孔径180目，并用1～2倍体积的蒸馏水洗涤滤饼，所得洗液合并入滤液；

[0058] (5)中和：采用[H+]为0.8mol/L的硫酸中和(4)中所得硬葡聚糖溶液；

[0059] (6)超滤脱盐浓缩：将步骤(5)中获得的硬葡聚糖中和溶液进行超滤脱盐并浓缩，超滤膜膜截留分子量范围是200000Da，并控制温度在45℃以下，采用硬葡聚糖溶液体积2倍体积的蒸馏水对超滤浓缩的硬葡聚糖溶液进行洗涤，并控制温度在45℃以下，硬葡聚糖浓缩液中硬葡聚糖的含量是1.35％(w/v)；

[0060] (7)乙醇沉淀，向步骤(6)中所得硬葡聚糖浓缩液中加入一定体积的乙醇，沉淀硬葡聚糖，乙醇体积分数为70％(v/v)，6000g离心15min后，得沉淀再采用体积分数为90％(v/v)乙醇溶液洗涤两次，6000g离心10min后所得沉淀即为硬葡聚糖产物；

[0061] (8)干燥，将步骤(7)中所得沉淀进行恒温干燥，温度为75℃，干燥时间90min，即获得了目的高纯度硬葡聚糖产品。

[0062] 经检测，该硬葡聚糖产品的纯度为92.8％，产品收率为86.7％，1％(w/v)溶液粘度为1260mPa.s(美国Brookfield DV2T：3#转子，60r/min，25℃测定)。

[0063] 实施例3

[0064] 一种高效的高纯度硬葡聚糖产品提取纯化的具体工艺步骤内容如下：

[0065] (1)原料：高含量硬葡聚糖发酵液，硬葡聚糖含量3.2％(w/v)；

[0066] (2)碱溶：硬葡聚糖终浓度1.2％(w/v)，NaOH的终浓度为0.35mol/L；

[0067] (3)微波强制溶解，微波频率在1500MHz，处理3次，间隔5min，每次10s；

[0068] (4)固液分离；将步骤(3)中完全溶解的硬葡聚糖溶液进行离心分离，条件为6000g，离心20min，并用1～2倍体积的蒸馏水洗涤沉淀，所得上清液合并入滤液；

[0069] (5)中和：采用[H+]为1.0mol/L的盐酸中和(4)中所得硬葡聚糖溶液；

[0070] (6)超滤脱盐浓缩：将步骤(5)中获得的硬葡聚糖中和溶液进行超滤脱盐并浓缩，超滤膜膜截留分子量范围是80000Da，并控制温度在45℃以下，采用硬葡聚糖溶液体积2倍体积的蒸馏水对超滤浓缩的硬葡聚糖溶液进行洗涤，并控制温度在45℃以下，硬葡聚糖浓缩液中硬葡聚糖的含量是1.5％(w/v)；

[0071] (7)乙醇沉淀，向步骤(6)中所得硬葡聚糖浓缩液中加入一定体积的乙醇，沉淀硬葡聚糖，乙醇体积分数为68％(v/v)，7000g离心15min后，得沉淀再采用体积分数为90％(v/v)乙醇溶液洗涤两次，7000g离心10min后所得沉淀即为硬葡聚糖产物；

[0072] (8)干燥，将步骤(7)中所得沉淀进行恒温干燥，温度为80℃，干燥时间90min，即获得了目的高纯度硬葡聚糖产品。

[0073] 经检测，该硬葡聚糖产品的纯度为95.5％，产品收率为86％，1％(w/v)溶液粘度为1420mPa.s(美国Brookfield DV2T：3#转子，60r/min，25℃测定)。

[0074] 对比例1

[0075] 一种高效的高纯度硬葡聚糖产品提取纯化的具体工艺步骤内容如下：

[0076] (1)原料：高含量硬葡聚糖发酵液，硬葡聚糖含量3.2％(w/v)；

[0077] (2)碱溶：硬葡聚糖终浓度1.2％(w/v)，NaOH的终浓度为0.35mol/L；

[0078] (3)固液分离；将步骤(2)中的硬葡聚糖溶液进行离心分离，条件为6000g，离心20min，并用1～2倍体积的蒸馏水洗涤沉淀，所得上清液合并入滤液；

[0079] (4)中和：采用[H+]为1.0mol/L的盐酸中和(3)中所得硬葡聚糖溶液；

[0080] (5)超滤脱盐浓缩：将步骤(4)中获得的硬葡聚糖中和溶液进行超滤脱盐并浓缩，超滤膜膜截留分子量范围是80000Da，并控制温度在45℃以下，采用硬葡聚糖溶液体积2倍体积的蒸馏水对超滤浓缩的硬葡聚糖溶液进行洗涤，并控制温度在45℃以下，硬葡聚糖浓缩液中硬葡聚糖的含量是1.5％(w/v)；

[0081] (6)乙醇沉淀，向步骤(5)中所得硬葡聚糖浓缩液中加入一定体积的乙醇，沉淀硬葡聚糖，乙醇体积分数为68％(v/v)，7000g离心15min后，得沉淀再采用体积分数为90％(v/v)乙醇溶液洗涤两次，7000g离心10min后所得沉淀即为硬葡聚糖产物；

[0082] (7)干燥，将步骤(6)中所得沉淀进行恒温干燥，温度为80℃，干燥时间90min，即获得了目的高纯度硬葡聚糖产品。

[0083] 经检测，该硬葡聚糖产品的纯度为83％，产品收率为65％，1％(w/v)溶液粘度为890mPa.s(美国Brookfield DV2T：3#转子，60r/min，25℃测定)。

[0084] 对比例2

[0085] 一种高效的高纯度硬葡聚糖产品提取纯化的具体工艺步骤内容如下：

[0086] (1)原料：高含量硬葡聚糖发酵液，硬葡聚糖含量3.2％(w/v)；

[0087] (2)碱溶：硬葡聚糖终浓度1.2％(w/v)，NaOH的终浓度为0.35mol/L；

[0088] (3)将步骤(2)中的溶液加热到90℃，保温60min；

[0089] (4)固液分离；将步骤(3)中的硬葡聚糖溶液进行离心分离，条件为6000g，离心20min，并用1～2倍体积的蒸馏水洗涤沉淀，所得上清液合并入滤液；

[0090] (5)中和：采用[H+]为1.0mol/L的盐酸中和(4)中所得硬葡聚糖溶液；

[0091] (6)超滤脱盐浓缩：将步骤(5)中获得的硬葡聚糖中和溶液进行超滤脱盐并浓缩，超滤膜膜截留分子量范围是80000Da，并控制温度在45℃以下，采用硬葡聚糖溶液体积2倍体积的蒸馏水对超滤浓缩的硬葡聚糖溶液进行洗涤，并控制温度在45℃以下，硬葡聚糖浓缩液中硬葡聚糖的含量是1.5％(w/v)；

[0092] (7)乙醇沉淀，向步骤(6)中所得硬葡聚糖浓缩液中加入一定体积的乙醇，沉淀硬葡聚糖，乙醇体积分数为68％(v/v)，7000g离心15min后，得沉淀再采用体积分数为90％(v/v)乙醇溶液洗涤两次，7000g离心10min后所得沉淀即为硬葡聚糖产物；

[0093] (8)干燥，将步骤(7)中所得沉淀进行恒温干燥，温度为80℃，干燥时间90min，即获得了目的高纯度硬葡聚糖产品。

[0094] 经检测，该硬葡聚糖产品的纯度为85％，产品收率为68％，1％(w/v)溶液粘度为910mPa.s(美国Brookfield DV2T：3#转子，60r/min，25℃测定)。

[0095] 结论：从以上实施例和对比例可以看出，稀释碱溶和微波强化溶解联合使用对提高硬葡聚糖产品的品质和收率具有重要的影响。

[0096] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。