一种微生物混合发酵制备黄姜皂苷的方法

摘要

本发明公开了一种微生物混合发酵制备黄姜皂苷的方法，属于生物技术领域，重点解决现有生产工艺中黄姜皂素收率低的问题。首先分别培养芽孢杆菌HG224、一种果胶杆菌或欧文氏菌、一种纤维单胞菌，然后按照1:0.4～1.2:0～1.2接种体积比例混合后制备微生物菌群；再按照黄姜干重与水的质量比为1:5～1:15配制成均匀黄姜浆液，在浆液中接种体积百分数为10％～40％上述微生物菌群，然后在温度为30℃～40℃，转速为100～220r/min的条件下培养4～6h。该微生物菌群混合发酵可使大量束缚的皂苷游离出来，大大提高了黄姜皂素收率，同时，为促进后续黄姜皂素的绿色生产奠定了坚实基础，工业化应用前景广阔。

权利要求

1.一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224，其特征在于，所述芽孢杆菌于2016年12月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCC M2016791。

2.一种黄姜发酵的微生物菌群，其特征在于，所述微生物菌群包括如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224和至少一种果胶杆菌(Pectobacterium sp.)。

3.如权利要求2所述的微生物菌群，其特征在于，所述果胶杆菌为软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)。

4.一种黄姜发酵的微生物菌群，其特征在于，所述微生物菌群包括如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224和至少一种欧文氏菌(Erwinia sp.)。

5.如权利要求4所述的微生物菌群，其特征在于，所述欧文氏菌为解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)。

6.如权利要求2至5任一项所述的微生物菌群，其特征在于，所述微生物菌群还包括至少一种纤维单胞菌(Cellulomonas sp.)。

7.如权利要求6所述的微生物菌群，其特征在于，所述纤维单胞菌为产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)。

8.如权利要求6所述的微生物菌群，其特征在于，所述微生物菌群包括所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224、果胶杆菌和纤维单胞菌时，所述微生物菌群中所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224、果胶杆菌和纤维单胞菌均处于对数生长期，所述处于对数生长期的芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224、果胶杆菌和纤维单胞菌的菌液体积比为1:0.4～1.2:0～

1.2；

所述微生物菌群包括所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224、欧文氏菌和纤维单胞菌时，所述微生物菌群中所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224、欧文氏菌和纤维单胞菌均处于对数生长期，所述处于对数生长期的芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224、欧文氏菌和纤维单胞菌的菌液体积比为1:0.4～1.2:0～1.2。

9.如权利要求2～8任意一项所述的微生物菌群的制备方法，其特征在于，所述微生物菌群包括所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224、果胶杆菌和纤维单胞菌时，该制备方法包括如下步骤：取所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224、果胶杆菌和纤维单胞菌的菌株的单菌落分别接种于所述LB培养基中，在温度为30～40℃，转速为100～220r/min条件下培养菌株至对数生长期，分别获得所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224、果胶杆菌和纤维单胞菌的处于对数生长期的菌液，将所述菌液按照体积比例1:0.4～1.2:0～1.2混合制成所述微生物菌群；

所述微生物菌群包括所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224、欧文氏菌和纤维单胞菌时，该制备方法包括如下步骤：取所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224、欧文氏菌和纤维单胞菌的菌株的单菌落分别接种于所述LB培养基中，在温度为30～40℃，转速为100～220r/min条件下培养菌株至对数生长期，分别获得所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)HG224、欧文氏菌和纤维单胞菌的处于对数生长期的菌液，将所述菌液按照体积比例1:0.4～1.2:0～1.2混合制成所述微生物菌群。

10.如权利要求2～8任意一项所述的微生物菌群的应用，其特征在于，应用于黄姜发酵。

11.如权利要求10所述的微生物菌群的应用，其特征在于，所述微生物菌群应用于黄姜发酵时包括如下步骤：按照黄姜干重与水的质量比为1:5～1:15配制成均匀浆液，在浆液中接种体积百分数为10％～40％的如权利要求2～8任意一项所述的微生物菌群，进行微生物菌群混合发酵培养，得到含有游离黄姜皂苷的发酵液。

12.如权利要求11所述的微生物菌群的应用，其特征在于，所述发酵培养条件为：在温度为30～40℃、转速为100～220r/min条件下培养4～24h。

说明书

一种微生物混合发酵制备黄姜皂苷的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种微生物混合发酵制备黄姜皂苷的方法。

背景技术

[0002] 黄姜(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)学名盾叶薯蓣，又称火头根，多年生缠绕草本植物，为我国特有的野生植物资源，主要分布于湖南、陕西、四川、贵州及云南等省。黄姜的根状茎含薯蓣皂苷等甾体皂苷类成分、40％左右的淀粉、50％的纤维素以及一些水溶性苷类、生物碱类、黄酮苷类、强心苷类、单宁、色素等化学成分。黄姜的主要有效成分是薯蓣皂苷元，也称皂素(以下均称皂素)。皂素是黄姜皂苷的配基，在黄姜中主要以皂苷的形式存在。以黄姜皂素合成的甾体激素中间体及皮质激素、性激素、蛋白同化激素等产品为主的数百种国计民生特需的药物，被誉为“药用黄金”。甾体激素类药物已迅速发展为仅次于抗生素的第二大类药物。

[0003] 盾叶薯蓣植物中的淀粉、蛋白质、果胶等成分对甾体皂苷具有一定的包裹作用，而甾体皂苷又通过糖苷键与植物纤维相连。因而简单的酸水解方法收率低，很难将植物中的薯蓣皂素提取完全，仅能提取其中的1/4。

[0004] 专利CN1515585A公开了一种环保无污染生产薯蓣皂素的方法，但其中过筛分离40％的纤维素部分会带走一些与纤维素结合的皂苷，从而降低了皂素的得率。专利CN1970785A公开了一种薯蓣皂素清洁生产及综合利用的方法，将黄姜原料粉碎后直接进行溶剂提取，与黄姜木质纤维素结构共价偶联的结合态皂苷无法获得，皂素得率存在提升空间。专利CN1821380A公开了一种处理黄姜的高效复合微生物菌群，其使用的微生物菌群涵盖细菌、霉菌、酵母菌等多种复合微生物，但存在问题是真菌生长时间较长，且细菌与真菌在生长过程中存在拮抗作用，大多数微生物在对黄姜木质纤维素处理过程中，存在分阶段生长的情况，与自然发酵过程一样存在不可控性，且微生物对皂苷元母核可能会有降解与转化作用，从而降低皂素得率。

[0005] 综上所述，传统的酸水解法提取黄姜皂素由于皂苷的转化不是专一性的，是同时水解各种物质，包括木质纤维素，淀粉，蛋白等等，用酸量大，因此，效率低、能耗大，且需要高温处理；现有技术大多利用微生物自然发酵处理黄姜，而自然发酵的微生物不可控，因而可能会掺杂一些可以降解皂素母核的微生物，使得皂素产量大幅下降。

[0006] 因此，最大限度提高黄姜皂素收率，降低黄姜皂素生产成本则是现有生产工艺面临的突出问题，通过创新微生物方法促进黄姜皂苷的大量游离，尤其是黄姜中束缚皂苷的游离极为重要，所以，研发新的绿色生产工艺并进行产业化应用刻不容缓。

发明内容

[0007] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种芽孢杆菌、微生物菌群及其混合发酵制备黄姜皂苷的方法，其目的在于通过选择合适的微生物菌种，制备得到微生物菌群，使得在黄姜发酵时该微生物菌群能够先后分泌高活性木质纤维素降解酶、淀粉酶和糖基转移酶等，协同促进黄姜皂苷的游离，且提高皂苷在水相中的溶解度，从而提高最终皂素的得率，由此解决现有技术黄姜皂素收率低的突出问题，为下一阶段的微生物高效转化皂苷生产皂素奠定了坚实基础。

[0008] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种芽孢杆菌，分类命名为Bacillus sp.HG224，所述芽孢杆菌于2016年12月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCC M2016791。

[0009] 按照本发明的另一个方面，提供了一种黄姜发酵的微生物菌群，所述微生物菌群包括芽孢杆菌HG224和至少一种果胶杆菌，所述果胶杆菌能够用欧文氏菌代替。

[0010] 优选地，所述果胶杆菌为胡萝卜果胶杆菌，其拉丁文名学名为Pectobacterium carotovorum。

[0011] 优选地，所述欧文氏菌为解淀粉欧文氏菌，其拉丁文学名为Erwinia amylovora。

[0012] 优选地，所述微生物菌群还包括至少一种纤维单胞菌。

[0013] 优选地，所述纤维单胞菌为产黄纤维单胞菌，其拉丁文学名为Cellulomonas flavigena。

[0014] 优选地，所述微生物菌群中所述芽孢杆菌HG224、果胶杆菌和纤维单胞菌均处于对数生长期，所述处于对数生长期的芽孢杆菌HG224、果胶杆菌和纤维单胞菌的菌液体积比为1:0.4～1.2:0～1.2，所述果胶杆菌能够用欧文氏菌代替。

[0015] 优选地，所述微生物菌群用于分泌木质纤维素降解酶、淀粉酶和糖基转移酶。

[0016] 优选地，所述木质纤维素降解酶为纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶或木质素降解酶。

[0017] 优选地，所述微生物菌群在黄姜发酵时用于分泌200～820U/ml的淀粉酶、120～450U/ml的β-葡萄糖苷酶、120～410U/ml的木聚糖酶、130～370U/ml的甘露聚糖酶和110～
390U/ml的果胶酶、158～430U/ml的糖基转移酶以及205～890U/ml的纤维素酶。

[0018] 按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的微生物菌群的制备方法，包括如下步骤：取所述芽孢杆菌HG224、果胶杆菌和纤维单胞菌的菌株的单菌落分别接种于所述LB培养基中，在温度为30～40℃，转速为100～220r/min条件下培养菌株至对数生长期，分别获得所述芽孢杆菌HG224、果胶杆菌和纤维单胞菌的处于对数生长期的菌液，将所述菌液按照体积比例1:0.4～1.2:0～1.2混合制成所述微生物菌群，所述果胶杆菌能够用欧文氏菌代替。

[0019] 按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的微生物菌群的应用，应用于黄姜发酵。

[0020] 优选地，所述的微生物菌群应用于黄姜发酵时包括如下步骤：按照黄姜干重与水的质量比为1:5～1:15配制成均匀浆液，在浆液中接种体积百分数为10％～40％的所述的微生物菌群，进行微生物菌群混合发酵培养，得到含有黄姜皂苷的发酵液。

[0021] 优选地，所述发酵培养条件为：在温度为30～40℃、转速为100～220r/min条件下培养4～24h。

[0022] 优选地，所述发酵培养时间为4～6h。

[0023] 总体而言，通过本发明的上述技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。

[0024] 1、本发明提供了一种芽孢杆菌HG224，并提供了一种包含该芽孢杆菌的用于黄姜发酵的微生物菌群，采用该微生物菌群发酵处理黄姜原料时，其能够分泌木质纤维素降解酶系、淀粉酶和糖基转移酶且酶活活力很高，使木质纤维素结构松散，并使束缚的皂苷释放出来，使存在于黄姜组织细胞中被木质纤维素、果胶、淀粉等包裹的皂苷充分游离，通过发酵时间控制，使得淀粉转化为低聚糖或寡糖，解除淀粉的包裹作用而不影响葡萄糖含量。

[0025] 2、微生物转化皂苷时由于大量皂苷的水不溶的状态，导致转化效率较低，采用本发明所述的微生物菌群发酵黄姜后，由于大量束缚的水溶性皂苷的释放并存在于水相中，为后续转化皂苷的微生物进行高效转化生产皂素奠定了坚实基础。

[0026] 3、本发明提供的微生物菌群的制备方法及其在黄姜发酵中的应用，促进大量束缚的皂苷游离，使得后续皂素生产得率高，工艺绿色环保、无污染、成本低，产业化应用前景广阔。

[0027] 4、本发明的微生物菌群应用于黄姜发酵促进黄姜皂苷释放和溶解时，由于其中不同菌种的协同作用，与不添加微生物或仅添加单一微生物相比，皂苷得率大大提高。

附图说明

[0028] 图1是Bacillus sp.HG224发酵黄姜时β-葡萄糖苷酶的酶活动态监测曲线；

[0029] 图2是Bacillus sp.HG224发酵黄姜时淀粉酶的酶活动态监测曲线；

[0030] 图3是Bacillus sp.HG224发酵黄姜时木聚糖酶的酶活动态监测曲线；

[0031] 图4是Bacillus sp.HG224发酵黄姜时甘露聚糖酶的酶活动态监测曲线；

[0032] 图5是Bacillus sp.HG224发酵黄姜时果胶酶的酶活动态监测曲线；

[0033] 图6是Bacillus sp.HG224发酵黄姜时糖基转移酶的酶活动态监测曲线；

[0034] 图7是芽孢杆菌Bacillus sp.HG224依据16S rDNA序列采用N-j法构建的系统进化树。

具体实施方式

[0035] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

[0036] 本发明提供的一种芽孢杆菌，其分类命名为Bacillus sp.HG224，其于2016年12月30日保藏于中国武汉，中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCC M2016791，其拉丁文学名为Bacillus sp.。

[0037] 图7为芽孢杆菌HG224依据16S rDNA序列采用N-j法构建的系统进化树。菌株芽孢杆菌HG224依据其16S rDNA序列采用Neighbour-joining法构建的系统进化树，跟菌株枯草芽孢杆菌M6K在系统进化树上聚为同一簇群，因而将其归为芽孢杆菌属菌株。

[0038] 本发明提供的用于黄姜发酵的微生物菌群，包括芽孢杆菌HG224和至少一种果胶杆菌，其中果胶杆菌能够用欧文氏菌代替。该微生物菌群还可以包括至少一种纤维单胞菌。

[0039] 其中果胶杆菌优选为胡萝卜果胶杆菌Pectobacterium carotovorum，欧文氏菌优选为解淀粉欧文氏菌Erwinia amylovora，纤维单胞菌优选为产黄纤维单胞菌Cellulomonas flavigena，这三种菌均没有特定的菌株限定。

[0040] 芽孢杆菌HG224、果胶杆菌和纤维单胞菌均处于对数生长期，该微生物菌群应用与黄姜发酵时按照菌液体积比为1:0.4～1.2:0～1.2进行接种，其中果胶杆菌能够用欧文氏菌代替。

[0041] 该微生物菌群发酵黄姜时用于分泌木质纤维素降解酶、淀粉酶和糖基转移酶，其中木质纤维素降解酶为纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶或木质素降解酶。

[0042] 该微生物菌群在黄姜发酵时能够分泌200～820U/ml的淀粉酶、120～450U/ml的β-葡萄糖苷酶、120～410U/ml的木聚糖酶、130～370U/ml的甘露聚糖酶和110～390U/ml的果胶酶、158～430U/ml的糖基转移酶以及205～890U/ml的纤维素酶。

[0043] 该微生物菌群的制备方法，包括如下步骤：取所述芽孢杆菌HG224、果胶杆菌和纤维单胞菌的菌株的单菌落分别接种于所述LB培养基中，在温度为30～40℃，转速为100～220r/min条件下，分别获得所述芽孢杆菌HG224、果胶杆菌和纤维单胞菌的处于对数生长期的菌液，将所述菌液按照体积比例1:0.4～1.2:0～1.2混合制成所述微生物菌群，所述果胶杆菌能够用欧文氏菌代替。

[0044] 微生物菌群应用于黄姜发酵时包括如下步骤：按照黄姜干重与水的质量比为1:5～1:15配制成均匀浆液，在浆液中接种体积百分数为10％～40％的上述的微生物菌群，在温度为30～40℃、转速为100～220r/min条件下培养4～24h，优选4～6h，进行微生物菌群混合发酵培养，得到含有黄姜皂苷的发酵液。将发酵液经固液分离菌体后，得到含黄姜皂苷的清液，取样分析其中的皂苷含量(加酸水解，将水解物水洗脱酸，后进行溶剂提取检测提取液中的皂素含量来表征皂苷含量)，然后通过多级膜过滤进一步得到含大量黄姜皂苷的浓缩液，或者将上述清液直接进行微生物转化生产黄姜皂素。

[0045] 本发明的微生物菌群应用于黄姜发酵时，各种酶在黄姜发酵促溶皂苷过程中起到的作用分析如下：

[0046] 纤维素酶：纤维素酶能有效降解黄姜材料中的纤维素结构，而纤维素是葡萄糖残基以β-1,4-糖苷键高度聚合形成的多糖类物质，不同糖链之间又通过氢键、范德华力等等紧密连接，导致了对皂苷的束缚作用，因而纤维素酶能有效的促进皂苷的释放。

[0047] 淀粉酶：淀粉酶主要将淀粉降解为低聚的葡聚糖或寡糖，因而可以有效的解除淀粉对黄姜皂苷的包裹，同时由于发酵时间的控制微生物又未能及时将淀粉降解为葡萄糖后被自己所利用，黄姜糖液的葡萄糖浓度保持相对恒定，从而有效保障了接下来对糖液的综合利用。

[0048] 木聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶：由于黄姜木质纤维素结构的复杂性，微生物在发酵过程中接触到的底物处于不断变化的过程中，微生物在发酵过程中分泌的木聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶属于协同作用酶，如果缺少这些酶，微生物将不能接触到相关底物，其他降解酶将不会被微生物所分泌，因而极大影响了微生物发酵促进黄姜皂苷游离的效果。

[0049] 糖基转移酶：微生物在发酵过程中，随着大量黄姜皂苷的游离，促使微生物分泌糖基转移酶将单糖重新连接到水不溶的皂苷上，有效提高皂苷在水相中的溶解度。

[0050] 单一菌株芽孢杆菌HG224的纤维素酶的酶活很低，由于半纤维素、木质素的包裹，导致微生物未能接触到纤维素结构，从而几乎不分泌纤维素酶；单一菌株分泌的木聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶酶活水平很低，影响整体降解效率，发酵促进黄姜皂苷游离的效果很有限。

[0051] 而两种微生物(芽孢杆菌HG224和一种果胶杆菌，或芽孢杆菌HG224和一种欧文氏菌)的混合使得该菌群微生物之间能够分工合作，既避免了不同种微生物对有限底物的竞争作用，也提高了不同底物的降解效率，同时分泌高酶活性的以上各种酶，各种酶之间的协同作用更明显，快速释放被束缚的黄姜皂苷。

[0052] 三种微生物(芽孢杆菌HG224、一种欧文氏菌或果胶杆菌、一种纤维单胞菌)的混合由于酶系的丰富程度极大提高，各种酶之间的协同作用更明显，可以获得更高的皂苷含量。但是该菌群在促进皂苷游离的同时也会产生继续水解皂苷导致皂苷水溶性下降的副作用，使得游离皂苷再次沉淀并与固形物混杂在一起，使得工艺过程复杂化，并消耗更多的有机溶剂，因此三种微生物的混合菌群需要精准的发酵调控才可以达到应有的性能，最大程度地促进皂苷的游离。

[0053] 以下为实施例：

[0054] 实施例1和2为不添加任何微生物的情况下的空白对比试验，实施例3为单一菌种发酵黄姜的对比试验，实施例4～5为本发明的两种微生物菌群(芽孢杆菌HG224和一种果胶杆菌，或芽孢杆菌HG224和一种欧文氏菌)的制备以及应用于黄姜发酵的实施例，实施例6～8采用三种微生物(芽孢杆菌HG224、一种果胶杆菌或欧文氏菌、一种纤维单胞菌)的制备以及应用于发酵黄姜的实施例。除实施例1和2以外，每个实施例均监测了黄姜发酵过程中各微生物酶活变化曲线，分析测试了黄姜发酵清液中包含的皂苷含量占总皂苷含量的百分比，其中总皂苷含量是通过将等量黄姜材料直接酸解获得的皂素含量换算得到。

[0055] 实施例1

[0056] 不添加任何微生物的情况下，具体操作步骤如下：

[0057] 取黄姜鲜姜500g，洗净去须后加水粉碎匀浆，按照黄姜干重与水的质量比为1:5配制成均匀浆液，在37℃，转速为200r/min条件下处理4h后得到的黄姜浆液，其液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量来计算)占总皂苷含量的29％(总皂苷含量通过将等量黄姜材料直接酸解获得的皂素含量换算)。

[0058] 实施例2

[0059] 不添加任何微生物的情况下，具体操作步骤如下：

[0060] 取黄姜鲜姜500g，洗净去须后加水粉碎匀浆，按照黄姜干重与水的质量比为1:15配制成均匀浆液，在37℃，转速为200r/min条件下处理4h后得到的黄姜浆液，其液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量来计算)占总皂苷含量的42％。

[0061] 实施例3

[0062] 一种黄姜发酵的微生物菌株，按照如下制备方法制备：

[0063] 取Bacillus sp.HG224菌株的单菌落接种于LB培养基中，在37℃150r/min条件下培养，培养至菌株处于对数生长期后收获得到扩大菌液。

[0064] 将该微生物菌株应用于黄姜发酵时，具体操作步骤如下：

[0065] (1)黄姜预处理：

[0066] 取黄姜鲜姜500g，洗净去须后加水粉碎匀浆，按照黄姜干重与水的质量比为1:10配制成均匀浆液；

[0067] (2)黄姜发酵

[0068] 在浆液中接种20％(v/v)的微生物菌群，在29℃转速为200r/min条件下培养0.5h，36℃转速为200r/min条件下培养3.5h，得到黄姜发酵液。

[0069] 图1～图6为采用Bacillus sp.HG224应用于黄姜发酵时各微生物酶活动态监测曲线。从图中可以看出：

[0070] 1、单菌的纤维素酶的酶活很低，由于半纤维素、木质素的包裹，导致微生物未能接触到纤维素结构，从而几乎不分泌纤维素酶。

[0071] 2、β-葡萄糖苷酶的酶活较高，如图1所示，为150～230U。

[0072] 3、淀粉酶的酶活较高，如图2所示，400～550U，淀粉酶主要将淀粉降解为低聚的葡聚糖或寡糖，因而可以有效的解除淀粉对黄姜皂苷的包裹，同时由于发酵时间的控制微生物又未能及时将淀粉降解为葡萄糖后被自己所利用，黄姜糖液的葡萄糖浓度保持相对恒定，从而有效保障了接下来对糖液的综合利用。

[0073] 4、木聚糖酶的酶活(图3)，10～30U；甘露聚糖酶的酶活(图4)，60～80U；果胶酶的酶活(图5)，12～32U。

[0074] 由于黄姜木质纤维素结构的复杂性，微生物在发酵过程中接触到的底物处于不断变化的过程中，微生物在发酵过程中分泌的这些酶属于协同作用酶，虽然酶活处于较低水平，但是这些酶是必不可少的，如果缺少这些酶，微生物将不能接触到相关底物，其他降解酶将不会被微生物所分泌，因而极大影响了微生物发酵促进黄姜皂苷游离的效果，但同时可以看到这些酶的酶活水平较低，影响整体降解效率，单一菌株具备一定的降解能力，但效果有限。

[0075] 5、糖基转移酶的酶活为50～380U(图6)。微生物在发酵过程中，随着大量黄姜皂苷的游离，促使微生物分泌糖基转移酶将单糖重新连接到水不溶的皂苷上，有效提高皂苷在水相中的溶解度。

[0076] 本实施例得到的黄姜发酵液液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量来计算)只占总皂苷含量的62％，单一微生物在黄姜发酵、促进其中皂苷游离、提高皂苷在水相中的溶解度的能力很有限。

[0077] 实施例4

[0078] 一种用于黄姜发酵的微生物菌群，按照如下制备方法制备：

[0079] 取Bacillus sp.HG224和Pectobacterium carotovorum菌株的单菌落分别接种于LB培养基中，在30℃，100r/min条件下培养，分别培养至各菌株处于对数生长期后收获得到扩大菌液，按照菌液体积比混合制成微生物菌群混合液，比例如下：Bacillus sp.50％和Pectobacterium carotovorum 50％。

[0080] 将微生物菌群混合液应用于黄姜发酵时，具体操作步骤如下：

[0081] (1)黄姜预处理：

[0082] 取黄姜鲜姜1000g，洗净去须后加水粉碎匀浆，按照黄姜干重与水的质量比为1:5配制成均匀浆液；

[0083] (2)黄姜发酵

[0084] 在浆液中接种10％(v/v)的上述微生物菌群混合液，在30℃转速为100r/min条件下培养4h进行发酵培养，得到黄姜发酵液，液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量来计算)占总皂苷含量的70％。

[0085] 混合微生物菌群中的不同微生物能同时利用不同的底物，从而快速释放被包裹及共价结合的黄姜皂苷。

[0086] 实施例5

[0087] 一种用于黄姜发酵的微生物菌群，按照如下制备方法制备：

[0088] 取Bacillus sp.HG224和Erwinia amylovora菌株的单菌落分别接种于LB培养基中，在30℃，100r/min条件下培养，分别培养至各菌株处于对数生长期后收获得到扩大菌液，按照菌液体积比混合制成微生物菌群混合液，体积比例如下：Bacillus sp.70％和Erwinia amylovora 30％。

[0089] 将微生物菌群混合液应用于黄姜发酵时，具体操作步骤如下：

[0090] (1)黄姜预处理：

[0091] 取黄姜鲜姜1000g，洗净去须后加水粉碎匀浆，按照黄姜干重与水的质量比为1:5配制成均匀浆液；

[0092] (2)黄姜发酵

[0093] 在浆液中接种10％(v/v)的上述微生物菌群混合液，在30℃转速为100r/min条件下培养4h进行发酵培养，得到黄姜发酵液，液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量来计算)占总皂苷含量的74％。

[0094] 混合微生物菌群中的不同微生物能同时利用不同的底物，从而快速释放被包裹及共价结合的黄姜皂苷。

[0095] 实施例6

[0096] 一种用于黄姜发酵的微生物菌群，按照如下制备方法制备：

[0097] 取Bacillus sp.HG224、Erwinia amylovora和Cellulomonas flavigena菌株的单菌落分别接种于LB培养基中，在37℃，200r/min条件下培养，分别培养至各菌株处于对数生长期后收获得到扩大菌液，按照菌液体积比混合制成微生物菌群混合液，体积比例如下：Bacillus sp.35％、Erwinia amylovora 40％和Cellulomonas flavigena 25％。

[0098] 将微生物菌群应用于黄姜发酵时，具体操作步骤如下：

[0099] (1)黄姜预处理：

[0100] 取黄姜鲜姜800g，洗净去须后加水粉碎匀浆，按照黄姜干重与水的质量比为1:12配制成均匀浆液；

[0101] (2)黄姜发酵

[0102] 在浆液中接种30％(v/v)的微生物菌群混合液，在37℃转速为210r/min条件下培养5h进行发酵培养，得到黄姜发酵液，液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量来计算)占总皂苷含量的83％；

[0103] 实施例7

[0104] 一种用于黄姜发酵的微生物菌群，按照如下制备方法制备：

[0105] 取Bacillus sp.HG224、Erwinia amylovora和Cellulomonas flavigena菌株的单菌落分别接种于LB培养基中，在30℃，100r/min条件下培养，分别培养至各菌株处于对数生长期后收获得到扩大菌液，按照菌液体积比混合制成微生物菌群混合液，体积比例如下：Bacillus sp.40％、Erwinia amylovora 25％和Cellulomonas flavigena 35％。

[0106] 将微生物菌群应用于黄姜发酵时，具体操作步骤如下：

[0107] (1)黄姜预处理：

[0108] 取黄姜鲜姜1500g，洗净去须后加水粉碎匀浆，按照黄姜干重与水的质量比为1:5配制成均匀浆液；

[0109] (2)黄姜发酵

[0110] 在浆液中接种10％(v/v)的微生物菌群混合液，在30℃转速为100r/min条件下培养4h进行发酵培养，得到黄姜发酵液，液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量来计算)占总皂苷含量的73％；

[0111] 实施例8

[0112] 一种用于黄姜发酵的微生物菌群，按照如下制备方法制备：

[0113] 取Bacillus sp.HG224、Erwinia amylovora和Cellulomonas flavigena菌株的单菌落分别接种于LB培养基中，在40℃，220r/min条件下培养，分别培养至各菌株处于对数生长期后收获得到扩大菌液，按照菌液体积比混合制成微生物菌群混合液，体积比例如下：Bacillus sp.30％、Erwinia amylovora 35％和Cellulomonas flavigena 35％。

[0114] 将微生物菌群应用于黄姜发酵时，具体操作步骤如下：

[0115] (1)黄姜预处理：

[0116] 取黄姜鲜姜1800g，洗净去须后加水粉碎匀浆，按照黄姜干重与水的质量比为1:15配制成均匀浆液；

[0117] (2)黄姜发酵

[0118] 在浆液中接种40％(v/v)的微生物菌群混合液，在40℃转速为220r/min条件下培养6h进行发酵培养，得到黄姜发酵液，液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量来计算)占总皂苷含量的85％。

[0119] 实施例9

[0120] 一种用于黄姜发酵的微生物菌群，按照如下制备方法制备：

[0121] 取Bacillus sp.HG224、Erwinia amylovora和Cellulomonas flavigena菌株的单菌落分别接种于LB培养基中，在30℃，100r/min条件下培养，分别培养至各菌株处于对数生长期后收获，再经过两次放大得到扩大菌液，按照菌液体积比混合制成微生物菌群混合液，体积比例如下：Bacillus sp.40％、Erwinia amylovora 25％和Cellulomonas flavigena 35％。

[0122] 将微生物菌群应用于黄姜发酵时，具体操作步骤如下：

[0123] (1)黄姜预处理：

[0124] 取黄姜鲜姜若干(干重1750kg)，洗净去须后加水粉碎匀浆，按照黄姜干重与水的质量比为1:5配制成均匀浆液；

[0125] (2)黄姜发酵

[0126] 在浆液中接种10％(v/v)的微生物菌群混合液，在30℃转速为100r/min条件下培养4h进行发酵培养，得到黄姜发酵液，液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量来计算)占总皂苷含量的76％；

[0127] 实施例10

[0128] 一种用于黄姜发酵的微生物菌群，按照如下制备方法制备：

[0129] 取Bacillus sp.HG224、Erwinia amylovora和Cellulomonas flavigena菌株的单菌落分别接种于LB培养基中，在40℃，220r/min条件下培养，分别培养至各菌株处于对数生长期后，再经过两次放大得到扩大菌液，按照菌液体积比混合制成微生物菌群混合液，体积比例如下：Bacillus sp.30％、Erwinia amylovora 35％和Cellulomonas flavigena 35％。

[0130] 将微生物菌群应用于黄姜发酵时，具体操作步骤如下：

[0131] (1)黄姜预处理：

[0132] 取黄姜鲜姜若干(干重2250kg)，洗净去须后加水粉碎匀浆，按照黄姜干重与水的质量比为1:15配制成均匀浆液；

[0133] (2)黄姜发酵

[0134] 在浆液中接种40％(v/v)的微生物菌群混合液，在40℃转速为220r/min条件下培养6h进行发酵培养，得到黄姜发酵液，液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量来计算)占总皂苷含量的86％。

[0135] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。