一种防治水稻稻瘟病的复合微生物菌剂及其制备方法

摘要

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种防治水稻稻瘟病的复合微生物菌剂及其制备方法。本发明所述复合微生物菌剂包含保藏编号为CCTCC No：M 2016277的放线菌CZ1367的孢子，以及保藏编号为CCTCC No：M 2016276的短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞。其中的放线菌和短小芽孢杆菌相配合协同防控稻瘟病菌，不仅弥补了彼此防效上的不足，而且避免使用化学农药，依然保证了对环境友好，无毒副作用，相比单一稻瘟病拮抗菌更加不易使病原菌产生抗药性。

权利要求

1.一种防治水稻稻瘟病的复合微生物菌剂，其特征在于，包含浓度为1～50亿/g的保藏编号为CCTCC No：M 2016277的放线菌CZ1367的孢子粉，以及浓度为50～200亿/g的保藏编号为CCTCC No：M 2016276的短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞；

其中，所述放线菌CZ1367的孢子粉由以下方法制备获得：

步骤1、将放线菌CZ1367接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH值7.4，于28℃下培养7天，获得试管种；

步骤2、先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g，葡萄糖4g，麦芽膏

10g，水1000ml，pH值7.2；在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2所述试管种，28℃下于转速为200r/min震荡培养3天，获得种子液；

步骤3、先配制固体发酵培养基，固体发酵培养基配方为麸皮1000g，121℃灭菌60分钟，冷却后烘干，以30％的接种量接入步骤2中得到的种子液，并补加无菌水，至含水量为50％，

28℃下固体发酵7天，获得所述孢子粉；

所述短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞由以下方法制备获得：

步骤1、将短小芽胞杆菌WX812接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：NaCl 

10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂20g，水1000ml，pH 7.2，于30℃下培养1天，获得试管种；

步骤2、先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母粉

5g，水1000ml，pH7.2；在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2所述试管种，30℃下于转速为200r/min震荡培养6-8h，获得种子液；

步骤3、先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉2％，蔗糖1％，可溶性淀粉0.5％，蛋白胨0.2％，NaCl 0.2％，CaCO3 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，KH2PO4 0.05％，pH7.0；121℃灭菌30分钟，冷却后接入2％的步骤2中得到的种子液，30℃下于转速为220rpm的发酵罐中培养3天得发酵液，用转速为4000rpm的离心机离心发酵液10分钟，取沉淀干燥，获得所述短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞。

2.权利要求1所述复合微生物菌剂在防治稻瘟病或制备防治稻瘟病农药制剂中的应用。

3.权利要求1所述复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括：

制备放线菌CZ1367的孢子和短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞，然后调整两者的浓度混合，获得所述复合微生物菌剂；

其中，所述制备放线菌CZ1367的孢子步骤具体如下：

步骤1、将放线菌CZ1367接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH值7.4，于28℃下培养7天，获得试管种；

步骤2、先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g，葡萄糖4g，麦芽膏

10g，水1000ml，pH值7.2；在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2所述试管种，28℃下于转速为200r/min震荡培养7天，获得种子液；

步骤3、先配制固体发酵培养基，固体发酵培养基配方为麸皮1000g，121℃灭菌60分钟，冷却后烘干，以30％的接种量接入步骤2中得到的种子液，并补加无菌水，至含水量为50％，

28℃下固体发酵7天，获得所述孢子粉；

所述制备短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞步骤具体如下：

步骤1、将短小芽胞杆菌WX812接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：NaCl 

10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂20g，水1000ml，pH 7.2，于30℃下培养1天，获得试管种；

步骤2、先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母粉

5g，水1000ml，pH7.2；在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2所述试管种，30℃下于转速为200r/min震荡培养6-8h，获得种子液；

步骤3、先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉2％，蔗糖1％，可溶性淀粉0.5％，蛋白胨0.2％，NaCl 0.2％，CaCO3 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，KH2PO4 0.05％，pH7.0；121℃灭菌30分钟，冷却后接入2％的步骤2中得到的种子液，30℃下于转速为220rpm的发酵罐中培养3天得发酵液，用转速为4000rpm的离心机离心发酵液10分钟，取沉淀干燥，获得所述短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞。

说明书

一种防治水稻稻瘟病的复合微生物菌剂及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体的说是涉及一种防治稻瘟病的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 水稻稻瘟病(Blast Fungus)是全世界稻区危害最严重的水稻病害之一，又名稻热病，俗称火烧瘟、吊头瘟、掐颈瘟等。该病一年四季均可对水稻造成危害，其危害遍及水稻的各个部位，有苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等。一般造成水稻减产10％～20％。以我国为例，20世纪90年代以来，该病的年发生面积均在380万公顷hm2以上，年损失稻谷达数亿公斤。

[0003] 目前,化学农药是防治稻瘟病的一种主要措施，但是大量和长期使用化学农药，既增加生产成本，也易导致病原菌产生抗药性而降低防治效果，同时造成环境污染和破坏生态平衡，给人类健康及环境安全带来严重隐患。而由于稻瘟病病原菌遗传复杂、致病多样和极易变异等特点，新培育的抗病品种需辛苦培育，且常在推广数年内失去抗性，降低了该方法控制稻瘟病的效果。为此，发展安全、无毒副作用、不污染环境、不易使病原菌产生抗药性的微生物农药至关重要。

[0004] 拮抗菌是一种能够在植物体内存活而不对寄主植物具有明显危害的微生物，且由于田间操作、气候变化等因素对其生长、繁殖和防治效果的影响较小，是一种天然的微生物活体农药。目前所分离得到的抗病性拮抗菌大多是易培养的细菌和真菌类群。

[0005] 中国专利CN104195064A公开了一种体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻拮抗放线菌，其从籼稻谷梅4号中筛选获得一株水稻拮抗放线菌，属于链霉菌属，其能够对至少5种不同生理小种的梨孢霉菌(稻瘟病的致病真菌)有拮抗作用；中国专利CN105567596A公开了一种放线菌及其应用，其公开了一种富阳链霉菌，通过平板对峙试验检测出该菌株对稻瘟病菌的抑制率为48.6％；文献《稻瘟病生防放线菌A11菌株的发酵条件研究》(张宇等，中国农学通报，第21卷第5期，2005年5月)也公开了放线菌A11对稻瘟病菌的拮抗能力，在特定条件下抑菌率平均达到57.4％。

[0006] 中国专利CN101962623A公开了一种可防止水稻稻瘟病和纹枯病的短小芽孢杆菌，在田间稻瘟病试验中，喷有该菌株次生代谢物的水稻，病感指数为16.7％，而对照的病感指数为67.8％。

[0007] 虽然以抗稻瘟病菌的拮抗菌活体作为农药制剂，不仅能以其更安全的生物代谢物避免化学农药产生的隐患，还可以利用拮抗菌与病原菌之间的拮抗对应关系，减少稻瘟病病菌多样、易变异带来的影响，但是筛选出来的拮抗菌本身能力高低不一，且单一使用仍有所欠缺，易产生抗药性，同时在防效上还需要进一步加强。

发明内容

[0008] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种防治水稻稻瘟病的复合微生物菌剂，使得所述复合微生物菌剂具有较高的防效，可应用于稻瘟病的防治中。

[0009] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0010] 一种防治稻瘟病的复合微生物菌剂，包含保藏编号为CCTCC No：M 2016277的放线菌CZ1367的孢子粉，以及保藏编号为CCTCC No：M 2016276的短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞。

[0011] 针对现有水稻稻瘟病拮抗菌在稻瘟病防治效果上不足的缺陷，本发明采用放线菌和短小芽孢杆菌两种微生物菌株组成复合微生物菌剂，两种菌株通过协同作用提高了对稻瘟病菌的抑制作用。

[0012] 所述放线菌CZ1367和短小芽胞杆菌WX812均于2016年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心。

[0013] 作为优选，所述放线菌CZ1367的孢子浓度为1～50亿/g，短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞浓度为50～200亿/g。

[0014] 作为优选，所述放线菌CZ1367的孢子由以下方法制备获得：

[0015] 步骤1、将放线菌CZ1367接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH值7.4，于28℃下培养7天，获得试管种；

[0016] 步骤2、先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g，葡萄糖4g，麦芽膏10g，琼脂20g，水1000ml，pH值7.2；在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2所述试管种，28℃下于转速为200r/min震荡培养7天，获得种子液；

[0017] 步骤3、先配制固体发酵培养基，固体发酵培养基配方为麸皮1000g，121℃灭菌60分钟，冷却后烘干，以30％的接种量接入步骤2中得到的种子液，并补加无菌水，至含水量为50％，28℃下固体发酵7天，获得所述孢子粉。

[0018] 作为优选，所述短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞由以下方法制备获得：

[0019] 步骤1、将短小芽胞杆菌WX812接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂20g，水1000ml，pH 7.2，于30℃下培养1天，获得试管种；

[0020] 步骤2、先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为NaCl10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，水1000ml，pH7.2；在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2所述试管种，30℃下于转速为200r/min震荡培养6-8h，获得种子液；

[0021] 步骤3、先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉2％，蔗糖1％，可溶性淀粉0.5％，蛋白胨0.2％，NaCl 0.2％，CaCO3 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，KH2PO4 0.05％，pH7.0；121℃灭菌30分钟，冷却后接入2％的步骤2中得到的种子液，30℃下于转速为220rpm的发酵罐中培养3天得发酵液，用转速为4000rpm的离心机离心发酵液10分钟，取沉淀干燥，获得所述短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞。

[0022] 本发明所述复合微生物菌剂对稻瘟病菌多个生理小种，如62、RB3、131、稻农具有较高的抑制率，具有协同增效作用，同时在盆栽试验和大田试验中具有比对照农药稻瘟灵更佳的防效和增产率。基于此，本发明提供了所述复合微生物菌剂在防治稻瘟病以及在制备防治稻瘟病农药制剂中的应用。

[0023] 同时，本发明提供了所述复合微生物菌剂的制备方法，制备放线菌CZ1367的孢子和短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞，然后调整两者的浓度混合，获得所述复合微生物菌剂。

[0024] 作为优选，所述制备放线菌CZ1367的孢子步骤具体如下：

[0025] 步骤1、将放线菌CZ1367接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH值7.4，于28℃下培养7天，获得试管种；

[0026] 步骤2、先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g，葡萄糖4g，麦芽膏10g，琼脂20g，水1000ml，pH值7.2；在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2所述试管种，28℃下于转速为200r/min震荡培养7天，获得种子液；

[0027] 步骤3、先配制固体发酵培养基，固体发酵培养基配方为麸皮1000g，121℃灭菌60分钟，冷却后烘干，以30％的接种量接入步骤2中得到的种子液，并补加无菌水，至含水量为50％，28℃下固体发酵7天，获得所述孢子粉。

[0028] 作为优选，所述制备短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞步骤具体如下：

[0029] 步骤1、将短小芽胞杆菌WX812接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂20g，水1000ml，pH 7.2，于30℃下培养1天，获得试管种；

[0030] 步骤2、先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，水1000ml，pH7.2；在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2所述试管种，30℃下于转速为200r/min震荡培养6-8h，获得种子液；

[0031] 步骤3、先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉2％，蔗糖1％，可溶性淀粉0.5％，蛋白胨0.2％，NaCl 0.2％，CaCO3 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，KH2PO4 0.05％，pH7.0；121℃灭菌30分钟，冷却后接入2％的步骤2中得到的种子液，30℃下于转速为220rpm的发酵罐中培养3天得发酵液，用转速为4000rpm的离心机离心发酵液10分钟，取沉淀干燥，获得所述短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞。

[0032] 由以上技术方案可知，本发明提供了一种具有较高防效的复合微生物菌剂，其中的放线菌和短小芽孢杆菌相配合协同防控稻瘟病菌，不仅弥补了彼此防效上的不足，而且避免使用化学农药，依然保证了对环境友好，无毒副作用，相比单一稻瘟病拮抗菌更加不易使病原菌产生抗药性。

[0033] 生物材料保藏信息说明

[0034] CZ1367，分类命名：放线菌CZ1367，Actinomyces sp.CZ1367，于2016年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC No：M 2016277；

[0035] WX812，分类命名，短小芽孢杆菌WX812，Bacillus pumilus WX812，于2016年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC No：M 2016276。

具体实施方式

[0036] 本发明实施例公开了一种防治水稻稻瘟病的复合微生物菌剂及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述产品及其制备方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品、方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0037] 以下就本发明所提供的一种防治水稻稻瘟病的复合微生物菌剂及其制备方法和应用做进一步说明。

[0038] 实施例1：制备放线菌CZ1367的孢子

[0039] 将放线菌CZ1367接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH值7.4，于28℃下培养7天，获得试管种；

[0040] 先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g，葡萄糖4g，麦芽膏10g，琼脂20g，水1000ml，pH值7.2；在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，121℃灭菌30分钟，冷2
却后接入1cm所述试管种，28℃下于转速为200r/min震荡培养7天，获得种子液；

[0041] 先配制固体发酵培养基，固体发酵培养基配方为麸皮1000g，121℃灭菌60分钟，冷却后烘干，以30％的接种量接入步骤2中得到的种子液，并补加无菌水，至含水量为50％，28℃下固体发酵7天，获得所述孢子粉。

[0042] 实施例2：制备短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞

[0043] 将短小芽胞杆菌WX812接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂20g，水1000ml，pH 7.2，于30℃下培养1天，获得试管种；

[0044] 先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，水1000ml，pH7.2；在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2所述试管种，30℃下于转速为200r/min震荡培养6-8h，获得种子液；

[0045] 先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉2％，蔗糖1％，可溶性淀粉0.5％，蛋白胨0.2％，NaCl 0.2％，CaCO3 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，KH2PO4 0.05％，pH7.0；121℃灭菌30分钟，冷却后接入2％的步骤2中得到的种子液，30℃下于转速为220rpm的发酵罐中培养3天得发酵液，用转速为4000rpm的离心机离心发酵液10分钟，取沉淀干燥，获得所述短小芽胞杆菌WX812的菌体和芽胞。

[0046] 实施例3：平板拮抗抑菌试验

[0047] 处理1：CZ1367+WX812

[0048] 采用平板对峙法，在直径为90mm的PDA培养基平板上，距离培养皿中心25mm的位置上接种活化好的放线菌和短小芽孢杆菌，再在培养皿中心位置接种稻瘟病菌。封口膜封好培养皿，在霉菌培养箱中28℃条件下倒置培养7天以上，每个处理重复3次，以不接拮抗菌为CK对照，7d后观察实验结果。测量真菌菌落直径并计算真菌菌丝生长抑制率。

[0049] 处理2：CZ1367

[0050] 采用平板对峙法，在直径为90mm的PDA培养基平板上，距离培养皿中心25mm的位置上接种活化好的放线菌CZ1367，再在培养皿中心位置接种稻瘟病病原菌。封口膜封好培养皿，在霉菌培养箱中28℃条件下培养，每个处理重复3次，以不接拮抗菌为CK对照，7d后观察实验结果。测量真菌菌落直径并计算真菌菌丝生长抑制率。

[0051] 处理3：WX812

[0052] 采用平板对峙法，在直径为90mm的PDA培养基平板上，在培养皿中心位置接种稻瘟病病原菌，在霉菌培养箱中28℃条件下培养2-3天，待菌落直径长至10mm左右，在距离培养皿中心30mm的位置上接种活化好的细菌WX812，封口膜封好培养皿，28℃继续培养，每个处理重复3次，以不接拮抗菌为CK对照，3-5d后观察实验结果。测量真菌菌落直径并计算真菌菌丝生长抑制率。

[0053] 处理4：放线菌CZ1368(Actinomyces sp.CZ1368)，与CZ1367在相同环境中筛选获得，除了试验菌不同外，试验方法与处理2相同。

[0054] 处理5：短小芽孢杆菌WX815(Bacillus pumilus WX815)，与WX812在相同环境中筛选获得，除了试验菌不同外，试验方法与处理3相同。

[0055] 处理6：CZ1368+WX815，除了试验菌不同外，试验方法与处理1相同。

[0056] 抑制率按照下式计算：

[0057] 菌丝生长抑制率％＝(CK菌落平均直径-处理菌落平均直径)/CK菌落平均直径×100％

[0058] 结果见表1。

[0059] 表1不同处理对稻瘟病不同生理小种的抑菌率

[0060]

[0061] 由表1可知，筛选自同一环境的相同拮抗菌对稻瘟病菌的抑菌率表现出不同效果，本发明所采用的两种拮抗菌组合使用后在抑菌率上相对于单一菌株出现显著的提升，而作为对照的CZ1368和WX815组合后，抑菌率相对于单一菌株并未出现显著的提高，表明本发明两种菌株之间出现协同增效的作用。

[0062] 实施例4：拮抗菌无菌发酵液对稻瘟病病原菌的抑菌试验

[0063] 处理1：放线菌CZ1367

[0064] 将放线菌CZ1367接入ISP2培养液中28℃，180rpm，培养7d，发酵液10000rpm离心10min，收集上清液过0.22μm滤膜，取100μL滤液涂布在ISP2培养皿上，28℃培养2d。经再培养检测，无菌落出现的滤液即为无菌发酵液。将无菌发酵液稀释成1％、2％、5％、10％不同梯度。分别取1mL与冷却至50℃的ISP2培养液9mL混合均匀倒平板，在平板中央接种稻瘟病病原菌，封口膜封好培养皿，在霉菌培养箱中28℃条件下培养，每个处理重复3次，对照取
1mL ISP2培养液代替无菌发酵液，7d后观察实验结果。测量真菌菌落直径并计算真菌菌丝生长抑制率。

[0065] 处理2：细菌WX812

[0066] 将细菌WX812接入Landy培养液中30℃，180rpm，培养3d，发酵液10000rpm离心10min，收集上清液过0.22μm滤膜，取100μL滤液涂布在LB培养皿上，30℃培养过夜。经再培养检测，无菌落出现的滤液即为无菌发酵液。将无菌发酵液稀释成1％、2％、5％、10％不同梯度。剩余步骤与处理1相同。

[0067] 处理3：《不同培养条件对球孢链霉菌JK-1生长及其产生抗菌物质的影响》，(李其利等，南方农业学报[J]，2012，43(11)：1682-1687)链霉菌JK-1浓度10％的发酵滤液。

[0068] 抑制率按照下式计算：菌丝生长抑制率％＝(CK菌落平均直径-处理菌落平均直径)/CK菌落平均直径×100％。

[0069] 结果见表2。

[0070] 表2不同浓度的无菌发酵液对稻瘟病的抑菌率

[0071]

[0072] 由表2可知，本发明所采用CZ1367相对于JK-1有较高的抑菌率，同时WK812的防效也高于现有的链霉菌JK-1。

[0073] 实施例5：水培试验

[0074] 1.种子处理：

[0075] 水稻种子进行表面消毒处理：用75％的酒精处理15s后无菌水水洗三次，5％的次氯酸钠溶液处理15min后无菌水水洗三次，30℃保湿催芽。

[0076] 2.水稻幼苗的准备：

[0077] 将发芽的水稻小有苗播入水培盒中，加入水培液(mol·L-1):K2SO4 500、KH2PO4 250、MgSO4 325、NaCl 5.0×10-4、H3BO3 8.0×10-6、MnSO4 1.0×10-6、ZnSO4 0.4×10-6、CuSO4 
0.4×10-6、Na2MoO4 10-7、Fe-EDTA 4.0×10-6、CaSO4 1.0×10-3、NH4NO3 1.0×10，28℃，每天光照14h，人工气候培养箱培养。

[0078] 2.复合微生物菌剂的施用和病原菌的接种

[0079] 带水稻长至4叶期，喷施微生物菌剂108个/ml，以叶片挂满水滴，不滴落为标准，28℃，99％湿度培养，3天后喷施稻瘟病孢子悬浮液105个/ml于叶片，30℃，99％湿度培养。对照组水稻只喷施稻瘟病孢子。7天后统计水稻叶片发病情况。

[0080] 3.统计结果

[0081] 叶瘟病情指数＝∑(病级叶数×代表数值)/总叶数×发病最重级代表数值[0082] 叶瘟防效＝(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数

[0083] 4.试验结果

[0084] 表3防治稻瘟病的水培试验结果

[0085]处理 病情指数 防效(％)
CZ1367+WX812 18.56 70.85
CZ1367 32.05 49.66
WX812 35.23 44.67
空白对照 63.67 —

[0086] 由表3可知，在水培试验中，本发明两种微生物菌组合后的病情指数与单一菌株相比得到显著下降，防效也得到显著提高，与实施例3证明的具有协同作用的结果相一致。

[0087] 实施例6：盆栽试验

[0088] 1.种子处理：

[0089] 水稻种子进行表面消毒处理：用75％的酒精处理15s后无菌水水洗三次，5％的次氯酸钠溶液处理15min后无菌水水洗三次。表面消毒的水稻种子浸泡于实施例2复合微生物菌剂2小时后，保湿催芽后播种育秧苗。

[0090] 2.病原菌的接种和复合微生物菌剂的施用

[0091] 处理1：用塑料小桶装水稻田间土壤(土壤先灭菌，加点蛭石，蛭石：土壤＝1：3，疏通土壤)，每桶移栽3穴，每穴3棵秧苗。水稻植株长至分蘖期时接种病原菌。以稻瘟病菌生理小种RB3为病原菌)，苗期接种：将病菌诱导产孢后，在2-3叶期的水稻苗上喷施稻瘟病孢子5
悬浮液10个/ml接种，以叶片挂满水滴，不滴落为标准，25℃，95％以上湿度处理一天，然后
28℃培养。待清水对照组水稻出现病情时，开始喷施复合微生物菌剂处理。

[0092] 3.统计结果

[0093] 叶瘟病情指数＝∑(病级叶数×代表数值)/总叶数×发病最重级代表数值[0094] 叶瘟防效＝(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数

[0095] 4.试验结果

[0096] 接种稻瘟病菌孢子后，至对照组开始发病时第一次喷施复合微生物菌剂，此后每隔7-10天喷施一次复合微生物菌剂。至水稻抽穗期，调查防效。以40％稻瘟灵EC(日本农药株式会社)为对照药剂。复合微生物菌剂在温室试验中对水稻稻瘟病防效达77.00％,与对照稻瘟灵的防效相当，结果见表4。

[0097] 表4防治稻瘟病的盆栽试验结果

[0098]

[0099] 实施例7：大田小区试验

[0100] 田间试验选择在稻瘟病连年发生较重的湖南省浏阳市大围山和湖南省桂东县水稻田中。共设3个处理：A：复合微生物菌剂108个/ml孢子液500ml/亩，兑水30L喷雾；B：40％稻瘟灵EC100g/亩，兑水30L喷雾；C：清水对照。每处理4次重复，每小区面积30m2，各处理随机区组排列。小区之间以保护行隔离，试验田按常规进行肥水管理。播种前浸种处理，防治叶瘟在发病初期进行，第一次施药后7天，再施药1次；穗颈瘟于水稻破口期和齐穗期各施药1次。采用背负式喷雾器喷雾。

[0101] 病情调查参照农药田间药效试验准则(一)(GB/T17980.19-2000)，施药前调查发病基数，对叶瘟的防效调查于第2次施药后8～10d进行，对穗颈瘟的防效调查则于穗颈瘟病情发展稳定后调查1次。每小区对角线五点取样，每点调查5丛，共25丛，调查叶片(穗)的发病程度，计算病情指数和防效。调查分级标准与全国稻瘟病药效试验所用标准相同。收获时测产。

[0102] 分级标准：

[0103] 叶瘟(以叶片为单位)

[0104] 0级：无病；

[0105] 1级：叶片病斑少于5个，长度<1cm侧

[0106] 3级：叶片病斑6-10个，部分病斑长度>1cm；

[0107] 5级：叶片病斑11-25个，部分病斑连成片，占叶面积10％-25％；

[0108] 7级：叶片病斑26个以上，病斑连成片，占叶面积26％-50％；

[0109] 9级：病斑连成片，占叶面积50％以上或全叶枯死。

[0110] 穗瘟(以穗为单位)

[0111] 0级：无病；

[0112] 1级：每穗损失5％以下(个别枝梗发病)；

[0113] 3级：每穗损失6％-20％(1/3左右枝梗发病)；

[0114] 5级：每穗损失21％-50％(穗颈或主轴发病，谷粒半瘪)；

[0115] 7级：每穗损失51％-70％(穗颈发病，大部瘪谷)；

[0116] 9级：每穗损失71％-100％(穗颈发病，造成白穗)。

[0117] 药效计算方法：

[0118]

[0119]

[0120] CK0—喷药前不施药对照区的病指；

[0121] CK1—喷药后不施药对照区的病指；

[0122] pt0—喷药前处理区的病指；

[0123] pt1—喷药后处理区的病指。

[0124] 试验结果表明，复合微生物菌剂对水稻稻瘟病有较好的效果，在湖南省浏阳市大围山和湖南省桂东县的叶瘟防效分别为77.29％和68.91％，穗瘟防效分别为79.94％、79.16％，增产率分别为18.58％、10.32％，与对照40％稻瘟灵乳油的化学农药防效相比，本发明微生物菌剂防效和增产水平优于化学农药的防效水平，结果见表5和表6。

[0125] 表5防治稻瘟病的大田小区试验结果(浏阳市)

[0126]

[0127] 表6防治稻瘟病的大田小区试验结果(桂东县)

[0128]

[0129] 注：表5和表6中数字都是四次重复平均值。

[0130] 以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。