汗腺细胞的培养基及其制备方法

摘要

本发明涉及一种汗腺细胞的培养基及其制备方法。该培养基包括基础培养液和添加物所述基础培养液为SGDM培养液；以在所述基础培养液中的添加量计，所述添加物包括如下组分：神经生长因子、转化生长因子‑β、表皮生长因子、硫酸肝素糖蛋白和骨形态发生蛋白4。该培养基能够提高ips细胞诱导为汗腺细胞的概率，并且能稳定传代，提高细胞的增殖速度，为皮肤组织工程提供种子细胞来源。同时整个过程没有用到血清，有效的避免了动物源性病原体带来的风险，提高了临床应用的安全性。

权利要求

1.一种汗腺细胞的培养基，其特征在于，由基础培养液和添加物组成；所述基础培养液为SGDM培养液；以在所述基础培养液中的添加量计，所述添加物由如下组分组成：

2.权利要求1所述的汗腺细胞的培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述神经生长因子、转化生长因子-β、表皮生长因子、硫酸肝素糖蛋白和骨形态发生蛋白4添加至所述基础培养液中，即可。

3.权利要求1所述的汗腺细胞的培养基在汗腺细胞培养中的应用。

4.一种将诱导性多能干细胞诱导为汗腺细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用mTeSR1培养基对诱导性多能干细胞进行培养，当汇合度为75～85％时，消化为单细胞；

取适量所述单细胞，以EB拟胚体形成培养基进行培养，形成拟胚体；

将所述拟胚体接种至权利要求1所述培养基中培养，即得汗腺细胞。

5.根据权利要求4所述的将诱导性多能干细胞诱导为汗腺细胞的方法，其特征在于，所述拟胚体的培养条件为：采用CO2浓度为5～7％，温度为37℃的培养箱培养24～50h。

6.根据权利要求4所述的将诱导性多能干细胞诱导为汗腺细胞的方法，其特征在于，所述消化的方法为采用Accutase细胞消化液进行消化。

说明书

汗腺细胞的培养基及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞培养基，特别是涉及一种汗腺细胞的培养基及其制备方法。

背景技术

[0002] 皮肤组织工程是近几年的研究热点。但是皮肤的相关细胞都属于终末分化细胞，很难在体外进行大规模的培养扩增，同时种子细胞的来源问题也阻碍了皮肤组织工程的发展。

[0003] 由于自体的种子细胞来源有限，异体的种子细胞存在排斥反应，干细胞又存在伦理问题，因此从尿液中收集尿液细胞，将尿液细胞诱导成为诱导性多能干细胞(ips细胞)，ips细胞再诱导成为角质形成细胞、成纤维细胞、汗腺细胞、毛乳头细胞等，即可解决皮肤组织工程的种子来源问题，且从尿液中获得细胞，方便快捷，不用通过创伤获取，来源广泛。

[0004] 目前的汗腺细胞专用培养基的分化概率较低，难以满足实际需求，且含有血清，会带来动物源性病原体风险，影响临床应用的安全性。

发明内容

[0005] 基于此，有必要提供一种不含血清，安全性高，且汗腺细胞诱导的概率高的诱导性多能干细胞诱导为汗腺细胞的培养基。

[0006] 一种汗腺细胞的培养基，包括基础培养液和添加物；所述基础培养液为SGDM培养液；以在所述基础培养液中的添加量计，所述添加物包括如下组分：

[0007]

[0008] 在其中一个实施例中，以在所述基础培养液中的添加量计，所述添加物包括如下组分：

[0009]

[0010] 在其中一个实施例中，以在所述基础培养液中的添加量计，所述添加物包括如下组分：

[0011]

[0012] 本发明还提供所述的汗腺细胞的培养基的制备方法，包括如下步骤：

[0013] 将所述神经生长因子、转化生长因子-β、表皮生长因子、硫酸肝素糖蛋白和骨形态发生蛋白4添加至所述基础培养液中，即可。

[0014] 本发明还提供所述的汗腺细胞的培养基在汗腺细胞培养中的应用。

[0015] 本发明还提供一种将诱导性多能干细胞诱导为汗腺细胞的方法，包括如下步骤：

[0016] 采用mTeSR1培养基对诱导性多能干细胞进行培养，当汇合度为75～85％时，消化为单细胞；

[0017] 取适量所述单细胞，以EB拟胚体形成培养基进行培养，形成拟胚体；

[0018] 将所述拟胚体接种至所述培养基中培养，即得汗腺细胞。

[0019] 在其中一个实施例中，所述拟胚体的培养条件为：采用CO2浓度为5～7％，温度为37℃的培养箱培养24～50h。

[0020] 在其中一个实施例中，所述消化的方法为采用Accutase细胞消化液进行消化。

[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0022] 本发明的汗腺细胞的培养基，在SGDM培养液的基础上，添加特定的添加物，其中，EGF参与汗腺芽和芽周围细胞外基质发育过程，NGF对外胚层的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用，TGF-β和bmp4均可激活bmp信号促进腺体细胞的生长，另外硫酸肝素糖蛋白(heparan sulfate proteoglycans，HSPG)是基底膜(basement membrane，BM)中普遍存在的重要成分，在细胞的形态、细胞的极性、细胞代谢、质膜上蛋白质的分布、细胞存活、细胞的增殖分化、细胞迁移等过程中有着非常密切的关系。

[0023] 由此，本发明的汗腺细胞的培养基能够将ips细胞诱导为汗腺细胞，并达到复合增效的作用，提高ips细胞诱导为汗腺细胞的概率，并且能稳定传代，提高细胞的增殖速度，为皮肤组织工程提供种子细胞来源。同时整个过程没有用到血清，有效的避免了动物源性病原体带来的风险，提高了临床应用的安全性。

附图说明

[0024] 图1为本发明实施例的实验组和对比组出现细胞形变所需天数的对比图；

[0025] 图2为显微镜下观察实验组和对比组的K14、K18、CEA和K8的表达情况，其中，(a1)、(b1)、(c1)、(d1)依次为实验组中K14、K8、K18和CEA的表达；(a2)、(b2)、(c2)、(d2)依次为对照组中K14、K8、K18和CEA的表达；

[0026] 图3为实施例1实验组和对比组中的汗腺细胞增殖速度比较；

[0027] 图4为实施例2实验组和对比组中的汗腺细胞增殖速度比较；

[0028] 图5为实施例3实验组和对比组中的汗腺细胞增殖速度比较。

具体实施方式

[0029] 以下结合具体实施例对本发明的汗腺细胞的培养基及其制备方法作进一步详细的说明。

[0030] 本发明实施例中采用的SGDM培养液、mTeSR1培养基、EB拟胚体形成培养基、Accutase细胞消化液均为市售产品。

[0031] 实施例1

[0032] 一、实验组和对照组别设置：

[0033] 1.实验组培养基：

[0034] 实验组培养基包括基础培养液和添加物，所述基础培养液为SGDM培养液，体积为500mL；以在所述基础培养液中的添加量计，所述添加物包括如下组分：

[0035]成分名称 工作浓度
NGF 10ng/mL
TGF-β 10ng/mL
EGF 10ng/mL
硫酸肝素糖蛋白 10ng/mL
骨形态发生蛋白4 10μg/L

[0036] 配制方法：按照上述比例在500mL基础培养液中加入NGF5μg、TGF-β5μg、EGF 5μg、硫酸肝素糖蛋白5μg、骨形态发生蛋白45μg，即可。

[0037] 2.对照组培养基

[0038] 对照组采用现有的SGDM培养液500mL，并在其中加入10mLFBS。

[0039] 二、体外诱导ips向汗腺细胞分化

[0040] (1)复苏细胞：选择P30的ips细胞进行复苏，然后用mTeSR1培养基进行培养，当达到80％汇合度时，用Accutase消化液消化为单细胞，计数。

[0041] (2)简单拟胚体的形成：每个AggreWellTM800培养板孔中加入1×106个上述单细胞，然后加入EB增菌液形成培养基，按产品使用操作手册，将AggreWellTM800培养板低速700r/min离心5min，放入5％CO2，37℃培养箱中培养，培养48h后形成简单拟胚体。

[0042] (3)诱导分化：将形成简单拟胚体转移至低吸附24孔板中，24孔板分为两组，实验组和对照组，每组12孔，实验组用实验组培养基培养，对照组用对照组培养基培养，隔天换液，记录第几天细胞出现变形(结果如图1所示)。挑出变形细胞团，用免疫荧光方法鉴定汗腺细胞相关基因的表达，确定是汗腺细胞后传代连续培养，每次传代都进行细胞计数，比较两组的细胞增殖速度。

[0043] 三、免疫荧光方法鉴定诱导后细胞表达汗腺相关因子K14、K18、CEA和K8[0044] 1.诱导15天后，实验组、对照组分别将培养基弃去培养基，用PBS清洗一次。用4％的多聚甲醛PBS在室温固定20分钟，PBS在室温漂洗三次，每次5分钟。

[0045] 2.在室温用含10％羊血清的PBS封闭1个小时。PBS冲洗三次，每次5分钟。

[0046] 3.用特异性一抗在4℃孵育过夜。PBS在室温漂洗三次，每次5分钟。用二抗室温避光孵育1个小时。

[0047] 4.PBS漂洗三次，每次5分钟，洗去多余的二抗，加入DAPI染细胞核。

[0048] 5.在荧光显微镜下观察，用合适波段激发，K14、K18、CEA和K8的表达情况如图2所示，对发出荧光的细胞进行计数，结果如图3所示。

[0049] 实施例2

[0050] 本实施例一种诱导性多能干细胞诱导成汗腺细胞的方法，其方法同实施例1中的步骤二，区别在于：实验组培养基包括基础培养液和添加物，所述基础培养液为SGDM培养液，体积为500mL；以在所述基础培养液中的添加量计，所述添加物包括如下组分：

[0051]成分名称 工作浓度
NGF 5ng/mL
TGF-β 5ng/mL
EGF 5ng/mL
硫酸肝素糖蛋白 5ng/mL
骨形态发生蛋白4 5μg/L

[0052] 培养所得汗腺细胞的鉴定方法同实施例1中的步骤三，荧光显微镜下观察K14、K18、CEA和K8的表达情况类似图2，对发出荧光的细胞进行计数，结果如图4所示。

[0053] 实施例3

[0054] 本实施例一种诱导性多能干细胞诱导成汗腺细胞的方法，其方法同实施例1中的步骤二，区别在于：实验组培养基包括基础培养液和添加物，所述基础培养液为SGDM培养液，体积为500mL；以在所述基础培养液中的添加量计，所述添加物包括如下组分：

[0055]

[0056]

[0057] 培养所得汗腺细胞的鉴定方法同实施例1中的步骤三，荧光显微镜下观察K14、K18、CEA和K8的表达情况类似图2，对发出荧光的细胞进行计数，结果如图5所示。

[0058] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0059] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。