本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法。采用Crispr/Cas9基因编辑技术将报告基因mRFP敲入到TUBB3等位基因中，使TUBB3编码序列与mRFP编码序列通过2A肽链连接，并进而制得含有TUBB3‑2A‑mRFP序列的人iPSCs记为hiPSCs‑TUBB3‑mRFP；最终制得的hiPSCs‑TUBB3‑mRFP高效分化为神经元。本发明所述方法，通过定向诱导分化程序，把hiPSCs‑TUBB3‑mRFP高效分化为神经元，从而为流式细胞仪高通量、特异性分选神经元提供了实验基础，并进一步为筛选神经系统药物、检测化合物/环境毒素的神经遗传毒性提供技术平台。
1.一种制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，其特征在于，采用Crispr/Cas9基因编辑技术将报告基因mRFP敲入到TUBB3等位基因中，使TUBB3编码序列与mRFP编码序列通过
2A肽链连接，获得TUBB3-2A-mRFP序列，并进而制得含有TUBB3-2A-mRFP序列的人iPSCs记为hiPSCs-TUBB3-mRFP；并通过定向诱导分化程序，将制得的hiPSCs-TUBB3-mRFP高效分化为神经元，即得。
2.根据权利要求1所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）构建靶向载体pSC-TUBB3-5HA-mRFP-3HA以hiPSCs的基因组DNA为模板，设计Primer TUBB3-1-short和Primer TUBB3-2为引物，通过PCR反应得到DNA片段TUBB3-5HA；
Primer TUBB3-1-short：ggatgtggtgcggaaggagtg；
Primer TUBB3-2：cttggggccctgggcctccga；
以TUBB3-5HA为模板，设计Primer TUBB3-1-longnew和Primer TUBB3-2为引物，通过PCR反应得到与载体序列有重叠的DNA片段的TUBB3-5HA-long；
Primer TUBB3-1-longnew：cgggctgcagcgaccaatgtggggatgtggtgcggaaggagtg；Primer TUBB3-2：cttggggccctgggcctccga；
以hiPSCs的基因组DNA为模板，设计Primer TUBB3-5和Primer TUBB3-6-short为引物，通过PCR反应得到DNA片段TUBB3-3HA；
Primer TUBB3-5：agctgctcgcagctggagtg；
Primer TUBB3-6-short：actgtggagggctgggcagtc；
以得到的TUBB3-3HA为模板，设计Primer TUBB3-6-longnew和Primer TUBB3-5为引物，通过PCR反应得到与载体序列有重叠的DNA片段TUBB3-3HA-long；
Primer TUBB3-6-longnew：gataagcttgatatccactgtggactgtggagggctgggcagtc；
Primer TUBB3-5：agctgctcgcagctggagtg；
以mRFP序列为模板，设计Primer TUBB3-3和Primer TUBB3-4为引物，通过PCR反应得到与TUBB3-5HA-long有重叠的DNA片段TagRFP；
Primer TUBB3-3：cggaggcccagggccccaagagggcaaagagggccacgaacttctctctgttaaagc；
Primer TUBB3-4：cactccagctgcgagcagctctatcaattaagtttgtgccccag；
取纯化的pSC线性化载体、TUBB3-5HA-long、TagRFP和TUBB3-3HA-long片段混匀，通过Gibson克隆试剂盒制备得到pSC-TUBB3-5HA-mRFP-3HA靶向载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
（2）构建sgRNA导向载体设计如下结构的序列1和序列2混匀，在100℃下加热，退火后与pBS-U6-sgRNA载体连接，制备得到pBS-U6-TUBB3-sgRNA导向载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
序列1：CACCGGTACATCTCGCCCTCTTCCT；
序列2：AAACAGGAAG AGGGCGAGAT GTACC；
（3）构建携带EGFP报告基因的Cas9表达载体取如SEQ ID No.6所示核苷酸序列结构的IRES-EGFP序列亚克隆到pCAG-Cas9-bpA载体中的Cas9片段的下游，构建得到pCAG-Cas9-IRES-EGFP-bpA表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
取Target vector、导向载体pBS-U6-TUBB3-sgRNA和pCAG-Cas9-IRES-EGFP-bpA混匀，在lipofectamine 3000的介导下共转染至hiPSCs，制备得到hiPSCs单细胞悬液；
（5）扩增含有TUBB3-mRFP的阳性hiPSCs克隆分选制得的hiPSCs单细胞悬液，将EGFP的阳性hiPSCs细胞以极低密度接种在含有E8条件培养基孔板，并挑取单细胞克隆进一步培养通过PCR鉴定并获得含有TUBB3-mRFP的阳性hiPSCs克隆，记为hiPSCs-TUBB3-mRFP；
（6）制备携带Mash1、Neurogenin2的慢病毒表达载体以中国人总RNA为模板，通过RT-PCR方法克隆人Mash1 cDNA和Ngn2cDNA，然后在亚克隆至含有报告基因EGFP的强力霉素诱导型慢病毒表达载体上，分别制得具有SEQ ID No.4所示核苷酸序列的载体Tet-O-hMash1-IRES-EGFP和具有SEQ ID No.5所示核苷酸序列的载体Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP；
（7）制备慢病毒上清液分别把Tet-O-hMash1-IRES-EGFP、Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP表达载体与慢病毒包装系统混匀，在lipofectamine2000的介导下转染至293FT细胞系，分别制得病毒上清Tet-O-hMash1-IRES-EGFP、Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP；
（8）hiPSCs-TUBB3-mRFP慢病毒感染把制得的hiPSCs-TUBB3-mRFP进行培养，并取病毒上清Tet-O-hMash1-IRES-EGFP、Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP、转录激活子rtTA2感染hiPSCs-TUBB3-mRFP，感染后更换为分化培养基进行定向分化培养，即得。
3.根据权利要求2所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述pSC线性化载体、TUBB3-5HA-long、TagRFP和TUBB3-3HA-long为等摩尔数混合。
4.根据权利要求2或3所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述序列1和序列2为等摩尔数混合。
5.根据权利要求2所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述Target vector、导向载体pBS-U6-TUBB3-sgRNA和Cas9-IRES-EGF为等摩尔数混合。
6.根据权利要求2所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，其特征在于，所述步骤（7）中，所述慢病毒包装系统包括pVSVG、pRSV-REV、pMDL g/p RRE。
7.根据权利要求2所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，其特征在于，所述步骤（8）中，所述Tet-O-hMash1-IRES-EGFP、Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP及转录激活子rtTA2按照MOI值=5去感染hiPSCs-TUBB3-mRFP。
8.根据权利要求7所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，其特征在于，所述步骤（8）中，所述分化步骤是在所述感染步骤24小时以后进行的。
9.根据权利要求7或8所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，其特征在于，所述步骤（8）中，所述定向分化培养步骤具体包括：D1-D5：培养基为含有10 µM SB431542、100 nM LDN-193189的KSR 分化培养基；
D6-D11：培养基为含有100nM LDN-193189、3µM CHIR99021的KSR/N2分化培养基；
D12-D13：培养基为含有100nM LDN-193189、3µM CHIR99021、10ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF、1ng/ml TGF3和0.1mMcAMP的Neurobasal/B27分化培养基；
D14-D21：培养基为含有10ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF、 1ng/ml TGF3和0.1mMcAMP的Neurobasal/B27分化培养基；
D22-D31：培养基为含有10ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF、0.2mM ascorbic acid和
0.1mMcAMP的Neurobasal/B27分化培养基。
一种制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法。
背景技术
[0002] 胚胎干细胞（embryonicstemcells，ES cells）是来源于哺乳动物囊胚内细胞团（innercellmass，ICM）的多潜能干细胞，具有无限自我更新和多向分化能力。ES细胞在疾病模型建立与机理研究、细胞治疗、药物发现与评价等方面极具应用价值。然而，使用人类胚胎涉及伦理和免疫排斥问题，科学家们曾尝试通过不同途径实现体细胞重编程以获取ES细胞样多潜能干细胞，早期途径主要有体细胞核移植、细胞融合和细胞提取物诱导，但亦因面临伦理、免疫排斥、技术、宗教和法律等问题限制了多潜能干细胞的研究与应用。而经特定转录因子诱导的体细胞重编程克服了上述障碍，无疑是获取多潜能干细胞的理想途径之一。2006年，日本Yamanaka研究小组将逆转录病毒介导的Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc4个基因转入小鼠成纤维细胞，首次将体细胞直接重编程为ES细胞样的多潜能干细胞，并命名为诱导多潜能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPSCs），标志着体细胞重编程为iPS细胞技术诞生。iPSCs是一种具有自我复制能力、且在一定条件下可以分化成多种靶向功能细胞的干细胞，由于iPSCs具备分化为人体内所有组织细胞的潜能，因此，多潜能干细胞的使用，已经逐渐成为人们寻找胰岛β细胞替代物的新资源。迄今为止，大鼠、人、猪、猴和兔的iPS细胞系皆已建立，并证实小鼠iPS细胞具有ES细胞的发育全能性。iPS细胞在疾病模型建立与机理研究、药物的发现与评价方面已取得重大成果，并有望用于细胞治疗。
[0003] 鉴于人iPSCs（hiPSCs）在疾病机理探索和再生医学等方面的巨大应用前景，iPSCs发明者荣获2012年度生理学或医学诺贝尔奖。而诱导hiPSCs定向分化为神经元是研究神经元发育、神经系统疾病机制、筛选神经系统药物、检测化合物/环境毒素的神经遗传毒性、治疗神经系统疾病的不可或缺的技术平台。携带有报告基因的hiPSCs源性神经元是实现上述研究目的之有力武器。然而如何稳定获得这种hiPSCs源性神经元依然是目前亟待解决的难题。
[0004] 目前，制备携带报告基因hiPSCs源性神经元的策略主要包括：（1）外源性神经元启动子控制报告基因表达，通过逆转录病毒/慢病毒载体随机整合在hiPSCs基因组中，其缺点是由于整合位点的随机性，使得外源性报告基因有可能影响整合位点附近功能基因的表达，也导致实验的可重复性受到一些限制；（2）通过同源重组的方式以内源性神经元启动子控制报告基因表达，但是导致同源重组的效率非常低下。现有技术中制备源性神经元通常采用有两种方式：（A）报告基因被敲入、替换神经元标识蛋白的一条等位基因，这种方式的缺点是导致神经元标识蛋白表达量降低从而影响其正常生理功能；（B）神经元标识蛋白与报告基因形成融合蛋白，这种方式的缺点是可能会影响神经元标识蛋白的某些功能，也有可能导致报告基因的失活。
发明内容
[0005] 为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，采用Crispr/Cas9基因编辑技术将报告基因mRFP敲入到TUBB3等位基因中，使TUBB3编码序列与mRFP编码序列通过2A肽链连接，获得TUBB3-2A-mRFP序列，并进而制得含有TUBB3-2A-mRFP序列的人iPSCs记为hiPSCs-TUBB3-mRFP；并通过定向诱导分化程序，将制得的hiPSCs-TUBB3-mRFP高效分化为神经元，即得。
[0007] 具体的，所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，包括如下步骤：
[0008] （1）构建靶向载体pSC-TUBB3-5HA-mRFP-3HA
[0009] 以hiPSCs的基因组DNA为模板，设计Primer TUBB3-1-short和Primer TUBB3-2为引物，通过PCR反应得到DNA片段TUBB3-5HA；
[0010] Primer TUBB3-1-short：ggatgtggtgcggaaggagtg；
[0011] Primer TUBB3-2：cttggggccctgggcctccga；
[0012] 以TUBB3-5HA为模板，设计Primer TUBB3-1-longnew和Primer TUBB3-2为引物，通过PCR反应得到与载体序列有重叠的DNA片段的TUBB3-5HA-long；
[0013] Primer TUBB3-1-longnew：cgggctgcagcgaccaatgtggggatgtggtgcggaaggagtg；
[0014] Primer TUBB3-2：cttggggccctgggcctccga；
[0015] 以hiPSCs的基因组DNA为模板，设计Primer TUBB3-5和Primer TUBB3-6-short为引物，通过PCR反应得到DNA片段TUBB3-3HA；
[0016] Primer TUBB3-5：agctgctcgcagctggagtg；
[0017] Primer TUBB3-6-short：actgtggagggctgggcagtc；
[0018] 以得到的TUBB3-3HA为模板，设计Primer TUBB3-6-longnew和Primer TUBB3-5为引物，通过PCR反应得到与载体序列有重叠的DNA片段TUBB3-3HA-long；
[0019] Primer TUBB3-6-longnew：gataagcttgatatccactgtggactgtggagggctgggcagtc；
[0020] Primer TUBB3-5：agctgctcgcagctggagtg；
[0021] 以mRFP序列为模板，设计Primer TUBB3-3和Primer TUBB3-4为引物，通过PCR反应得到与TUBB3-5HA-long有重叠的DNA片段TagRFP；
[0022] Primer TUBB3-3：cggaggcccagggccccaagagggcaaagagggccacgaacttctctctgttaaagc；
[0023] Primer TUBB3-4：cactccagctgcgagcagctctatcaattaagtttgtgccccag；
[0024] 取纯化的pSC线性化载体、TUBB3-5HA-long、TagRFP和TUBB3-3HA-long片段混匀，通过Gibson克隆试剂盒制备得到pSC-TUBB3-5HA-mRFP-3HA靶向载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0025] （2）构建sgRNA导向载体
[0026] 设计如下结构的序列1和序列2混匀，高温加热，退火后与pBS-U6-sgRNA载体连接，制备得到pBS-U6-TUBB3-sgRNA导向载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0027] 序列1：CACCGGTACATCTCGCCCTCTTCCT；
[0028] 序列2：AAACAGGAAG AGGGCGAGAT GTACC；
[0029] （3）构建携带EGFP报告基因的Cas9表达载体
[0030] 取如SEQ ID No.6所示核苷酸序列结构的IRES-EGFP序列亚克隆到pCAG-Cas9-bpA载体中的Cas9片段的下游，构建得到pCAG-Cas9-IRES-EGFP-bpA表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0031] （4）制备hiPSCs单细胞悬液
[0032] 取Target vector、导向载体pBS-U6-TUBB3-sgRNA和pCAG-Cas9-IRES-EGFP-bpA混匀，在lipofectamine 3000的介导下共转染至hiPSCs，制备得到hiPSCs单细胞悬液；
[0033] （5）扩增含有TUBB3-mRFP的阳性hiPSCs克隆
[0034] 分选制得的hiPSCs单细胞悬液，将EGFP的阳性hiPSCs细胞以极低密度接种在含有E8条件培养基孔板，并挑取单细胞克隆进一步培养，获得含有TUBB3-mRFP的阳性hiPSCs克隆，记为hiPSCs-TUBB3-mRFP；
[0035] （6）制备携带Mash1、Neurogenin2的慢病毒表达载体
[0036] 以中国人总RNA为模板，通过RT-PCR方法克隆人Mash1cDNA和Ngn2cDNA，然后在亚克隆至含有报告基因EGFP的强力霉素诱导型慢病毒表达载体上，分别制得具有SEQ ID No.4所示核苷酸序列的载体Tet-O-hMash1-IRES-EGFP和具有SEQ ID No.5所示核苷酸序列的载体Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP；
[0037] （7）制备慢病毒上清液
[0038] 分别把Tet-O-hMash1-IRES-EGFP、Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP表达载体与慢病毒包装系统混匀，在lipofectamine2000的介导下转染至293FT细胞系，分别制得病毒上清Tet-O-hMash1-IRES-EGFP、Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP；
[0039] （8）hiPSCs-TUBB3-mRFP慢病毒感染
[0040] 把制得的hiPSCs-TUBB3-mRFP进行培养，并取病毒上清Tet-O-hMash1-IRES-EGFP、Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP、转录激活子rtTA2感染hiPSCs-TUBB3-mRFP，感染后更换为分化培养基进行定向分化培养，即得。
[0041] 所述步骤（1）中，所述pSC线性化载体、TUBB3-5HA-long、TagRFP和TUBB3-3HA-long为等摩尔数混合。
[0042] 所述步骤（2）中，所述序列1和序列2为等摩尔数混合。
[0043] 所述步骤（2）中，所述高温加热步骤为100℃加热5分钟。
[0044] 所述步骤（4）中，所述Target vector、导向载体pBS-U6-TUBB3-sgRNA和Cas9-IRES-EGF为等摩尔数混合。
[0045] 所述步骤（7）中，所述慢病毒包装系统包括pVSVG、pRSV-REV、pMDL g/p RRE。
[0046] 所述步骤（8）中，所述Tet-O-hMash1-IRES-EGFP、Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP及转录激活子rtTA2按照MOI值=5去感染hiPSCs-TUBB3-mRFP。
[0047] 所述步骤（8）中，所述分化步骤是在所述感染步骤24小时以后进行的。
[0048] 所述步骤（8）中，所述定向分化培养步骤具体包括：
[0049] D1-D5：培养基为含有10 µM SB431542、100 nM LDN-193189的KSR 分化培养基；
[0050] D6-D11：培养基为含有100nM LDN-193189、3µM CHIR99021的KSR/N2分化培养基；
[0051] D12-D13：培养基为含有100nM LDN-193189、3µM CHIR99021、10ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF、1ng/ml TGF3和0.1mMcAMP的Neurobasal/B27分化培养基；
[0052] D14-D21：培养基为含有10ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF、 1ng/ml TGF3和0.1mMcAMP的Neurobasal/B27分化培养基；
[0053] D22-D31：培养基为含有10ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF、0.2mM ascorbic acid和0.1mMcAMP的Neurobasal/B27分化培养基。
[0054] 本发明所述制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，通过Crispr/Cas9基因编辑技术将报告基因mRFP敲入到TUBB3等位基因中，制备了在TUBB3启动子控制下表达报告基因的hiPSCs细胞系；并使得TUBB3编码序列与mRFP编码序列通过2A肽链连接，从而使mRFP表达丰度在iPSCs向神经元分化初始阶段就能被检测到使mRFP的表达丰度能代表内源性TUBB3的表达；并且，本发明所述方法，通过特定的定向诱导分化程序，我们把hiPSCs-TUBB3-mRFP高效分化为神经元，报告基因RFP的表达与神经元标志物的拟合度超过90%，从而为流式细胞仪高通量、特异性分选神经元提供了实验基础，并进一步为筛选神经系统药物、检测化合物/环境毒素的神经遗传毒性提供技术平台。
附图说明
[0055] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0056] 图1 为本发明构建靶向载体pSC-TUBB3-5HA-mRFP-3HA的示意图；
[0057] 图2为本发明构建pCAG-Cas9-IRES-EGFP-bpA表达载体的示意图；
[0058] 图3为本发明构建携带人Mash1cDNA的诱导型慢病毒载体的示意图；
[0059] 图4为本发明构建携带人Ngn2cDNA的诱导型慢病毒载体的示意图；
[0060] 图5为本发明hiPSCs向神经元定向分化示意图；
[0061] 图6为本发明分化为神经元的iPSCs，其中，A：定向分化为神经元的hiPSCs；B：报告基因RFP染色；C：细胞核染色；D：图A、B、C的重叠图；
[0062] 图7为不同分化时期RFP的表达情况。
具体实施方式
[0063] 本发明下述实施例中所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法，采用Crispr/Cas9基因编辑技术将报告基因mRFP敲入到TUBB3等位基因中，使TUBB3编码序列与mRFP编码序列通过2A肽链连接，获得TUBB3-2A-mRFP序列，并进而制得含有TUBB3-2A-mRFP序列的人iPSCs记为hiPSCs-TUBB3-mRFP；并通过定向诱导分化程序，将制得的hiPSCs-TUBB3-mRFP高效分化为神经元。
[0064] 实施例1
[0065] 本发明所述的制备可实时示踪iPSCs源性神经元的方法具体而言，所述方法包括如下步骤：
[0066] （1）构建靶向载体pSC-TUBB3-5HA-mRFP-3HA
[0067] 如图1所示，以hiPSCs的基因组DNA为模板，设计Primer TUBB3-1-short和Primer TUBB3-2为引物，通过PCR反应得到DNA片段TUBB3-5HA；
[0068] Primer TUBB3-1-short：ggatgtggtgcggaaggagtg；
[0069] Primer TUBB3-2：cttggggccctgggcctccga；
[0070] 所述PCR反应具体为：50ul反应体系，引物终浓度10uM，模板量：0.5ug，变性温度94℃，2分钟，循环数为1；变性温度94℃持续20秒，退火温度53℃持续20秒，延伸温度72℃持续25秒；循环数为35；延伸温度72℃持续10分钟，循环数为1；
[0071] 以TUBB3-5HA为模板，设计Primer TUBB3-1-longnew和Primer TUBB3-2为引物，通过PCR反应得到与载体序列有重叠的DNA片段的TUBB3-5HA-long；
[0072] Primer TUBB3-1-longnew：cgggctgcagcgaccaatgtggggatgtggtgcggaaggagtg；
[0073] Primer TUBB3-2：cttggggccctgggcctccga；
[0074] 所述PCR反应具体为：50ul反应体系，引物终浓度10uM，模板量：100ng，变性温度94℃，2分钟，循环数为1；变性温度94℃持续20秒，退火温度53℃持续20秒，延伸温度72℃持续25秒；循环数为35；延伸温度72℃持续10分钟，循环数为1；
[0075] 以hiPSCs的基因组DNA为模板，设计Primer TUBB3-5和Primer TUBB3-6-short为引物，通过PCR反应得到DNA片段TUBB3-3HA；
[0076] Primer TUBB3-5：agctgctcgcagctggagtg；
[0077] Primer TUBB3-6-short：actgtggagggctgggcagtc；
[0078] 所述PCR反应具体为：50ul反应体系，引物终浓度10uM，模板量：0.5ug，变性温度94℃，2分钟，循环数为1；变性温度94℃持续20秒，退火温度52℃持续20秒，延伸温度72℃持续25秒；循环数为35；延伸温度72℃持续10分钟，循环数为1；
[0079] 以得到的TUBB3-3HA为模板，设计Primer TUBB3-6-longnew和Primer TUBB3-5为引物，通过PCR反应得到与载体序列有重叠的DNA片段TUBB3-3HA-long；
[0080] Primer TUBB3-6-longnew：gataagcttgatatccactgtggactgtggagggctgggcagtc；
[0081] Primer TUBB3-5：agctgctcgcagctggagtg；
[0082] 所述PCR反应具体为：550ul反应体系，引物终浓度10uM，模板量：100ng，变性温度94℃，2分钟，循环数为1；变性温度94℃持续20秒，退火温度51℃持续20秒，延伸温度72℃持续25秒；循环数为35；延伸温度72℃持续10分钟，循环数为1；
[0083] 以mRFP序列为模板，设计Primer TUBB3-3和Primer TUBB3-4为引物，通过PCR反应得到与TUBB3-5HA-long有重叠的DNA片段TagRFP；
[0084] Primer TUBB3-3：cggaggcccagggccccaagagggcaaagagggccacgaacttctctctgttaaagc；
[0085] Primer TUBB3-4：cactccagctgcgagcagctctatcaattaagtttgtgccccag；
[0086] 所述PCR反应具体为：50ul反应体系，引物终浓度10uM，模板量：100ng，变性温度94℃，2分钟，循环数为1；变性温度94℃持续20秒，退火温度55℃持续20秒，延伸温度72℃持续25秒；循环数为35；延伸温度72℃持续10分钟，循环数为1；
[0087] 取纯化的pSC线性化载体、TUBB3-5HA-long、TagRFP和TUBB3-3HA-long片段按照等摩尔数进行混匀，通过Gibson克隆试剂盒制备得到pSC-TUBB3-5HA-mRFP-3HA靶向载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示（其中下划线是5HA-mRFP-3HA序列）；
[0088] （2）构建sgRNA导向载体
[0089] 设计如下结构的序列1和序列2，按照等摩尔数进行混匀，于100℃高温下加热5min，退火后与已知载体pBS-U6-sgRNA载体连接，制备得到pBS-U6-TUBB3-sgRNA导向载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示（下划线显示的是TUBB3-sgRNA序列，除去下划线部分则为pBS-U6-sgRNA载体序列）；
[0090] 序列1：CACCGGTACATCTCGCCCTCTTCCT；
[0091] 序列2：AAACAGGAAG AGGGCGAGAT GTACC；
[0092] （3）构建携带EGFP报告基因的Cas9表达载体
[0093] 如图2所示，取如SEQ ID No.6所示核苷酸序列结构的IRES-EGFP序列亚克隆到已知载体pCAG-Cas9-bpA载体中的Cas9片段的下游，构建得到pCAG-Cas9-IRES-EGFP-bpA表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示（除去SEQ ID No.6所示核苷酸序列结构的部分即为pCAG-Cas9-bpA载体序列）；
[0094] （4）制备hiPSCs单细胞悬液
[0095] 取Target vector、导向载体pBS-U6-TUBB3-sgRNA和pCAG-Cas9-IRES-EGFP-bpA按照等摩尔进行混匀，在lipofectamine 3000的介导下共转染至hiPSCs，转染6小时后，更换培养基，48小时后，制备得到hiPSCs单细胞悬液；
[0096] （5）分选含有EGFP的hiPSCs，扩增含有TUBB3-mRFP的阳性hiPSCs克隆[0097] 通过流式细胞仪分选制得的hiPSCs单细胞悬液，将EGFP的阳性hiPSCs细胞以极低密度接种在含有E8条件培养基的6孔板中，4-5天后挑取80个单细胞克隆至两个96孔板进一步培养，其中一个96孔板的细胞用于提取基因组DNA，另一个通过PCR鉴定含有TUBB3-mRFP的阳性hiPSCs克隆，记为hiPSCs-TUBB3-mRFP；
[0098] （6）制备携带Mash1、Neurogenin2的慢病毒表达载体
[0099] 如图3和4所示，以中国人总RNA为模板，通过RT-PCR方法克隆人Mash1cDNA（其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示）和Ngn2cDNA（其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示），然后在亚克隆至含有报告基因EGFP的强力霉素诱导型慢病毒表达载体上，分别制得具有SEQ ID No.4所示核苷酸序列的载体Tet-O-hMash1-IRES-EGFP和具有SEQ ID No.5所示核苷酸序列的载体Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP；
[0100] （7）制备慢病毒上清液
[0101] 分别把制得的Tet-O-hMash1-IRES-EGFP、Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP表达载体与慢病毒包装系统（所述慢病毒包装系统包括pVSVG、pRSV-REV、pMDL g/p RRE）混匀，在lipofectamine2000的介导下转染至293FT细胞系，在不含抗生素的DMEM中培养6小时后更换为DMEM完全培养基，转染72小时后分别收取病毒上清Tet-O-hMash1-IRES-EGFP、Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP，并通过3000g离心力去除上清液中的细胞残渣后，用0.45um的滤膜过滤上清液，最后使用超速离心机在50000g的离心力作用下得到病毒颗粒沉淀，用无菌PBS溶液溶解病毒颗粒沉淀后冻存在-80℃冰箱，浓缩的病毒上清通过梯度稀释法感染HEK293细胞系以测定病毒浓度；
[0102] （8）hiPSCs-TUBB3-mRFP慢病毒感染
[0103] 把hiPSCs-TUBB3-mRFP以1.8x105细胞/ml的密度接种到Matrigel包被的6孔板中，培养基为含有Y-27632ROCK inhibitor的E8，第二天更换为正常E8培养基；把病毒上清Tet-O-hMash1-IRES-EGFP、Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP、转录激活子rtTA2按照MOI（multiplicity of infection，感染复数）值=5去感染hiPSCs-TUBB3-mRFP，24小时后按照图5所示步骤更换为含有10 µM SB431542和100 nM LDN-193189的KSR 分化培养基，即可完成iPSCs源性神经元的分化，所述分化培养步骤具体如下：
[0104] D1-D5（天）：培养基为含有10 µM SB431542、100 nM LDN-193189的KSR 分化培养基；
[0105] D6-D11：培养基为含有100nM LDN-193189、3µM CHIR99021的KSR/N2分化培养基；
[0106] D12-D13：培养基为含有100nM LDN-193189、3µM CHIR99021、10ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF、1ng/ml TGF3和0.1mMcAMP的Neurobasal/B27分化培养基；
[0107] D14-D21：培养基为含有10ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF、 1ng/ml TGF3和0.1mMcAMP的Neurobasal/B27分化培养基；
[0108] D22-D31：培养基为含有10ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF、0.2mM ascorbic acid和0.1mMcAMP的Neurobasal/B27分化培养基。
[0109] 实施例2
[0110] 取上述实施例1中分化的神经元用4% PFA（多聚甲醛）固定，通过标准细胞免疫荧光染色对RFP/TUBB3进行染色，通过DAPI进行核复染以方便计数，应用高内涵成像分析系统对结果进行分析。结果如图6所示，超过90%的携带报告基因hiPSCs（图6中B）在分化体系中表达神经元标志物TUBB3。
[0111] 同时，本发明所述方法还在分所述分化步骤进行中对所述分化情况进行观察，结果如图7所示：其中，A图结果显示分化2天后有较弱的mRFP在活体iPSCs的表达；B图结果显示分化2天后EGFP的表达，提示外源性hMash1和hNgn2已经表达，并促进iPSCs向TUBB3阳性（mRFP阳性）神经元方向分化；C图结果显示分化4天后有较强的mRFP在活体iPSCs的表达；D图结果显示分化4天后EGFP的表达，提示外源性hMash1和hNgn2已经高表达，并促进iPSCs表达更强的神经元标识物TUBB3（mRFP的表达即代表内源性TUBB3的表达）。可见，本发明所述方法可有效制得iPSCs源性神经元，并进一步可实现实时示踪。
[0112] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
