一种开花植物花粉特异性表达DCP2启动子

摘要

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种开花植物花粉特异性表达的DCP2启动子。该启动子包含1336 bp，具体碱基序列如SEQ ID No.1所示。该启动子用于在花粉粒中特异性表达目的基因，或者通过调控花粉产生或生存能力的基因表达而导致雄性不育。利用该启动子可构建一种拟南芥开花期花粉特异性表达载体pDCP2‑GUS。本发明通过对启动子DCP2的分离和功能鉴定，可为相关目的基因在花粉中特异表达，或者控制花粉育性提供了新的途径，也为相关基因研究及作物培育奠定了基础，具有较为重要的理论和应用意义。

权利要求

1.一种开花植物花粉特异性表达DCP2启动子，其特征在于，该启动子碱基序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述开花植物花粉特异性表达DCP2启动子在拟南芥中的应用，其特征在于，用于在花粉粒中特异性表达目的基因，或者通过调控花粉产生或生存能力的基因表达而导致雄性不育。

3.如权利要求2所述开花植物花粉特异性表达DCP2启动子在拟南芥中的应用，其特征在于，所述目的基因为GUS基因；所述调控花粉产生或生存能力的基因具体为：登录号分别为AJ344210.1的Ms1、登录号为X73652的Ms2或者登录号为X17554.1的Wun1。

4.利用权利要求1所述DCP2启动子所构建的一种拟南芥开花期花粉特异性表达载体pDCP2-GUS。

5.权利要求4所述拟南芥开花期花粉特异性表达载体pDCP2-GUS的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）将DCP2启动子与pMD18-T载体进行连接，构建pMD18-DCP2；

（2）将pMD18-DCP2质粒与质粒pBAR-GUS分别进行AgeI及SpeI双酶切，分别回收酶切产物，并将酶切产物进行连接；

（3）将步骤（2）中连接产物转化大肠杆菌感受态细胞进行抗性筛选，获得重组载体pDCP2-GUS。

6.利用权利要求4所述拟南芥开花期花粉特异性表达载体pDCP2-GUS的转基因拟南芥培育方法，其特征在于，将花粉特异性表达载体pDCP2-GUS转化农杆菌后，采用农杆菌介导的花粉管渗透法对野生型拟南芥受体进行转化，利用除草剂进行抗性筛选，最终可获得转基因拟南芥。

说明书

一种开花植物花粉特异性表达DCP2启动子

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种开花植物花粉特异性表达的DCP2启动子。

背景技术

[0002] 在基因的结构与功能研究中，转录水平的调控是一个关键步骤，基因转录起始是一系列反式作用因子和转录位点共同作用的结果。编码蛋白质的基因包含启动子和编码区，启动子一般位于编码区上游，是反式作用因子的结合位点。

[0003] 启动子按其表达方式可分为三类：组成型启动子、诱导性启动子和组织特异性启动子。组成型启动子在生物体各个发育时期和所有的组织中都启动基因表达，具有时空特异性和表达量恒定性。诱导性启动子能在某些物理或化学信号的诱导下启动基因表达，或可以大幅度地提高基因的转录水平，一部分诱导性启动子同时具组织特异性。组织特异性表达启动子只在某种细胞、组织或者器官中启动基因表达，这些启动子还往往表现出一定的化学物理信号诱导性，还受到组织细胞生理状态以及发育阶段的影响，依据表达组织的不同，这些启动子有根特异性启动子、维管束特异性启动子、茎秆和叶片特异性启动子、花粉特异性启动子、种子和果实特异性启动子等。

[0004] 随着大量DNA序列的积累和各种基因数据库的建立，启动子预测及鉴定和分析的计算机软件和网站也相继产生，启动子克隆的方法也很多。目前，许多植物启动子已被克隆，并已申请了专利保护。但花粉特异启动子方面，所见报道相对较少。

[0005] 花粉的形成发生在雄蕊的花药中，植物雄性不育系是作物杂种优势利用的重要途径，因此对花药及花粉发育的研究具有重要的应用价值。杂交繁育是将两种植物的所需遗传性状导入一种植物的传统方法。为了可靠的获得性状一致的杂种，应确保亲本系之一为雄性不育。产生雄性不育的技术，一种是人工地或机械化除去雄性亲本植物的花药或穗状雄花，但该方法费时、费力而且不完全可靠。另一种是利用基因工程来获得雄性不育系和恢复系。

[0006] 外源基因能否在植物组织中特异高效表达，依赖于能高效、特异表达的植物表达载体，其中启动子的选择是关键条件之一。因此，当需要在全部植物细胞中表达时，使用组成型启动子。相反，当需要在植物优先的组织中表达时，使用组织特异性启动子。外源基因在目标组织中的优先表达减少了组成型启动子在全部植物细胞中启动异源核苷酸序列转录所发生的植物资源消耗。基于这些目的，开发新的、尤其是花粉特异表达的启动子，具有十分重要的应用意义。

发明内容

[0007] 本发明目的是提供一种植物开花时花粉特异性表达的DCP2启动子，从而为相关基因研究及新植物品种培育奠定应用基础。

[0008] 本发明的技术方案详述如下。

[0009] 一种开花植物花粉特异性表达DCP2启动子，其来源于拟南芥（Arabidopssis thaliana），包含1336 bp，具体碱基序列如SEQ ID No.1所示；分析表明，该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件。

[0010] 所述开花植物花粉特异性表达DCP2启动子在拟南芥中的应用，用于在花粉粒中特异性表达目的基因（如GUS基因），或者通过调控花粉产生或生存能力的基因表达（如登录号分别为AJ344210.1、X73652和X17554.1的Ms1、Ms2、Wun1等）而导致雄性不育。

[0011] 利用所述DCP2启动子所构建的一种拟南芥开花期花粉特异性表达载体，命名为pDCP2-GUS，通过将DCP2启动子插入载体pBAR-GUS构建而成，所构建的pDCP2-GUS载体，在启动子的下游含有GUS报告基因，在拟南芥开花期花粉中特异性表达。

[0012] 所述拟南芥开花期花粉特异性表达载体pDCP2-GUS的制备方法，具体包括如下步骤：

[0013] （1）将DCP2启动子与pMD18-T载体进行连接，构建pMD18-DCP2；

[0014] （2）将pMD18-DCP2质粒与质粒pBAR-GUS分别进行AgeI及SpeI双酶切，分别回收酶切产物，并将酶切产物进行连接；

[0015] （3）将步骤（2）中连接产物转化大肠杆菌感受态细胞进行抗性筛选，获得重组载体pDCP2-GUS。

[0016] 利用所述花粉特异性表达载体pDCP2-GUS的转基因拟南芥培育方法，将花粉特异性表达载体pDCP2-GUS转化农杆菌后，采用农杆菌介导的花粉管渗透法对野生型拟南芥受体进行转化，利用除草剂进行抗性筛选，最终可获得转基因拟南芥。

[0017] 发明人通过公共DNA序列和基因表达数据，获得了一种在花中表达量较高的拟南芥DCP2基因，进而通过DNA序列分析，得到了其启动子区域，经进一步转基因验证后，确定了所获得的启动子DCP2为一种开花时花粉中特异性表达的启动子。

[0018] 总体而言，本发明通过对启动子DCP2的分离和功能鉴定，可为相关目的基因在花粉中特异表达，或者控制花粉育性提供了新的途径，也为相关基因研究及作物培育奠定了基础，具有较为重要的理论和应用意义。

附图说明

[0019] 图1 为DCP2::GUS转基因植物的GUS染色结果，其中：A. 有花粉的花药；B.单朵花；C.花序；D.果荚；E. 莲座叶；F.根；染色结果显示GUS基因在花粉中特异性表达，其它部位均不表达，图中的蓝色斑点即为花粉。

具体实施方式

[0020] 下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料及实验背景情况简要介绍如下。

[0021] 生物材料：

[0022] 野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana），常用模式植物材料；

[0023] 载体pBAR-GUS，来自BioVector NTCC保藏中心；

[0024] 载体pMD18-T，购自宝生物（大连）有限公司；

[0025] 所用引物及测序均由上海生物工程技术服务有限公司完成；

[0026] 主要实验试剂：

[0027] AgeI限制性内切酶、2 X连接试剂盒等关键试剂均购自宝生物（大连）有限公司；

[0028] 植物DNA分离试剂盒、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购于全式金生物技术有限公司。

[0029] 实施例1

[0030] 在已有公共DNA序列和发明人前期对拟南芥DCP2基因研究基础上，发明人设计了特异性引物，利用PCR方法克隆获得了DCP2启动子，并对其进行了测序。本实施例就花粉特异性表达的启动子DCP2的PCR过程简要介绍如下。

[0031] （1）提取拟南芥基因组DNA

[0032] 参考植物DNA分离试剂盒说明书，提取野生型拟南芥基因组DNA；所提取的基因组DNA分装保存-20℃备用。

[0033] （2）设计特异性扩增引物，并进行PCR扩增

[0034] 为便于定向克隆，在引物的5’端分别添加AgeI、SpeI限制性内切酶位点，具体引物序列设计如下：

[0035] DCP2-F：5’-AACCGGTCTTGGAACAATTTGGCTC-3’，

[0036] DCP2-R：5’-AACTAGTAGTTCTTGCCTTTAAAACCCT-3’；

[0037] 以步骤（1）中的拟南芥DNA为模板，50μL扩增体系设计如下：

[0038] 10 X Buffer，5μL；

[0039] dNTP Mix (2.5 each)，5μL；

[0040] 正向引物（DCP2-F），10μM、1μL；

[0041] 反向引物（DCP2-R），10μM、1μL；

[0042] Polymerase，2.5U/μL、1.0μL；

[0043] DNA模板，1μL (50 ng)；

[0044] ddH2O加至50μL；

[0045] 利用PCR仪（美国赛默飞世尔Arktik 多功能PCR仪）进行扩增，扩增程序为：95℃、3min；95℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，30个循环；72℃、5min。

[0046] 对PCR扩增产物电泳并回收纯化，部分回收产物进行测序分析，获得DCP2启动子序列，该启动子包括1336 bp，其碱基序列具体如SEQ ID NO.1所示。

[0047] 实施例2

[0048] 由于相关载体构建是相关基因研究及转基因植物培育的基础，因而本实施例就花粉特异性表达载体pDCP2-GUS的构建过程简要介绍如下。

[0049] （1）将DCP2启动子与pMD18-T载体进行连接

[0050] 参考2 X连接试剂盒说明书，将实施例1中所回收的1300 bp左右的特异性扩增产物与pMD18-T载体进行连接，10μL连接体系设计如下：

[0051] Ligation Mix，5μL；

[0052] pMD18-T，1μL；

[0053] 所回收步骤（1）中PCR产物，2.5μL（200 ng左右）；

[0054] ddH2O，1.5μL；

[0055] 16℃连接过夜。

[0056] （2）转化并筛选

[0057] 取步骤（1）中5μL连接产物，热击转化大肠杆菌感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素(50mg/L)的固体LB培养基上进行重组子的筛选，挑取阳性克隆进行测序验证，对构建正确的质粒命名为pMD18-DCP2。

[0058] （3）酶切，并连接

[0059] 将步骤（2）中筛选获得的pMD18-DCP2质粒与质粒pBAR-GUS分别进行AgeI及SpeI双酶切，回收酶切产物，并根据2 X连接试剂盒说明书，将启动子DCP2连接到pBAR-GUS中，10μL连接体系设计如下：

[0060] Ligation Mix，5μL；

[0061] pBAR-GUS酶切产物，1μL（大约100 ng）；

[0062] pMD18-DCP2酶切产物，4.0μL（100 ng左右）；

[0063] 16℃连接过夜。

[0064] （4）转化、筛选获得重组载体pDCP2-GUS

[0065] 取步骤（3）中5μL连接产物，热击转化大肠杆菌感受态细胞，涂布在卡那霉素(50mg/L)的LB培养基上进行重组子的筛选，挑取阳性克隆进行测序验证，对构建正确的质粒命名为pDCP2-GUS。

[0066] 需要解释的是，所构建的pDCP2-GUS质粒中，由于含有GUS基因，而GUS基因在表达后经染色后可呈现蓝色，因而可用于检测启动子的活性及表达特异性。

[0067] 实施例3

[0068] 利用实施例2中所构建重组质粒pDCP2-GUS，可进一步转化植株，并用于构建转基因植株，本实施例就相关实验简要介绍如下。

[0069] （1）转化农杆菌，制备转染液

[0070] 取100μL农杆菌GV3101感受态细胞，加入1μL实施例2中所制备的pDCP2-GUS质粒，利用液氮冻融法进行转化；

[0071] 转化后，在含有卡那霉素、利福平和链霉素（浓度分别为50mg/L、25mg/L和50mg/L）的YEB培养板上，28℃培养，挑取阳性克隆，进行PCR验证，PCR验证用引物设计如下：

[0072] F：5’-GGTCTGCACCATCGTCAACCACTACA-3’，

[0073] R：5’-GGCAGGCTGAAGTCCAGCTGCCAGAA-3’；

[0074] 对验证正确的转化菌株保藏备用。

[0075] （2）转化拟南芥

[0076] 取步骤（1）中构建正确的转化菌株，采用渗透法转化野生型拟南芥，自交收集T1代种子。

[0077] 将T1代种子经75%酒精消毒10分钟，在超净台吹干后撒在含25mg/L glufosinate（配制方法为150 μLRELY (18.19% glufosinate ammounium（草铵膦）) 定容至1L）的MS培养基上；4℃暗培养2天后，置于培养室培养，培养条件为22 24℃，16小时光照；~

[0078] 对抗性拟南芥苗，提取其DNA，进行PCR验证（PCR验证用引物同步骤（1）中F、R引物），经PCR验证正确的转基因阳性植株，自交结实获得T2代种子。

[0079] 对所获得的T2代种子进行GUS染色分析

[0080] T2代种子参照（2）所描述的方法进行消毒和抗性筛选，选择抗性筛选存活比率为3:1的植株进行GUS活性的组织化学染色分析。具体如下：

[0081] 将待检测的样品与底物X-Gluc(1.0 mmol/L X-Gluc，50 mmol/L 磷酸缓冲液，pH 7.0，10 mmol/L EDTA-Na，pH 8.0，甲醇 终浓度20%，0.1% Triton X-100，10 mmol/L 巯基乙醇)的染色反应液于37℃保温过夜，进行组织化学染色；

[0082] 然后用70%乙醇脱去组织的叶绿体颜色后观察照相。

[0083] 结果如图1所示，仅在转基因拟南芥的花粉中显蓝色，拟南芥的其它花粉器官组织（花瓣、雌蕊、子房、花药）和营养组织（根、叶）中未见蓝色，表明该1336 bp 的DCP2启动子可驱动GUS基因在拟南芥花粉中特异性表达。