本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种低成本的BCR/ABL融合基因快速检测探针及其制备方法。所述制备方法包括以下步骤：从UCSC Genome Browser下载BCR和ABL基因探针所覆盖区域基因组非重复序列，再将分割后的序列批量导入OligoArray软件进行探针设计，然后将设计后的探针加上标签序列后直接合成，再使用带有荧光基团的标签引物对探针进行扩增和标记，得到BCR/ABL融合基因快速检测探针。本发明制备所得BCR/ABL融合基因快速检测探针具有杂交时间短(可在15～30分钟完成杂交实验)、杂交信号明亮、信噪比高、制备成本低等优点。
1.一种低成本BCR/ABL融合基因快速检测探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）从UCSC Genome Browser下载BCR和ABL基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中BCR探针覆盖区域为：chr22 22806485 23854431，ABL探针覆盖区域为：chr9 ~
（2）将步骤（1）获得的BCR基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray 软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端加上
17bp的标签序列、3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的BCR探针序列；所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85 99℃，GC比40 80%，不含TTTT/GGGG/AAAA/~ ~CCCC，探针间最小间隔5bp；所述标签序列的碱基序列如下所示：5’端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG，3’端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG；
（3）将步骤（1）获得的ABL基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray 软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端加上
17bp的标签序列、3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的ABL探针序列；所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85 99℃，GC比40 80%，不含TTTT/GGGG/AAAA/~ ~CCCC，探针间最小间隔5bp；所述标签序列的碱基序列如下所示：5’端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG，3’端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG；
（4）使用DNA合成仪对步骤（2）所得带有标签序列的BCR探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到BCR探针库；同理，使用DNA合成仪对步骤（3）所得带有标签系列的ABL探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到ABL探针库；
（5）分别合成5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物和5’端带有橘红色荧光基团的M13通用引物，使用5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物对BCR探针库进行扩增标记反应，使用5’端带有橘红色的荧光基团的M13通用引物对ABL探针库进行扩增标记反应；所述通用引物的序列如下所示：M13-F TGTAAAACGACGGCCAGT，M13-R CAGGAAACAGCTATGACC；
（6）将步骤（5）所得BCR探针库的扩增标记产物纯化、稀释后即得到荧光标记的BCR探针库， 将步骤（5）所得ABL探针库的扩增标记产物纯化、稀释后即得到荧光标记的ABL探针库，所述荧光标记的BCR探针库和荧光标记的ABL探针库构成了BCR/ABL融合基因快速检测探针。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤（5）所述扩增标记反应的PCR反应体系如下：
2×PCR Mix 25μL 模板 50ng M13-F 1μL M13-R 1μL H2O 补足至50μL。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤（5）所述扩增标记反应的PCR反应条件如下：95℃5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，共进行35个循环；72℃10min。
4.一种包含权利要求1 3任一所述制备方法制备所得BCR/ABL融合基因快速检测探针~的BCR/ABL融合基因检测试剂盒。
5.权利要求4所述试剂盒在制备用于检测BCR/ABL融合基因产品中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，具体的应用方法用于非疾病诊断和治疗目的，包括如下步骤：（1）样本处理：将外周血细胞滴片样本放入盛有2×SSC的容器中，微波炉高火加热处理
3min直至液体沸腾，然后再中低火继续加热处理10min，处理完成后立即将玻片置于-20℃预冷的梯度酒精中脱水晾干，备用；
（2）BCR/ABL融合基因快速检测探针杂交混合物的制备：将荧光标记的BCR探针库、荧光标记的ABL探针库和杂交缓冲液按照1:1:9的体积比混合；
（3）探针样本共变性：每例样本使用10μL步骤（2）混合所得BCR/ABL融合基因快速检测探针杂交混合物，使用22×22mm盖玻片盖片，使用橡皮胶封片，封片后将玻片置于杂交仪中
（4）杂交后洗涤：待杂交完成后揭去盖玻片，将玻片置于60℃预热的洗液中洗涤去除未结合探针；
（5）复染及镜检：将晾干的玻片滴加10μL抗淬灭封片剂封片，然后在荧光显微镜下观察杂交结果。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，步骤（2）中所述杂交缓冲液的组分为：10wt% 去离子甲酰胺、20wt%硫酸葡聚糖、1μg /mL RNaseA、0.6M氯化钠、10mM柠檬酸缓冲液。
一种低成本的BCR/ABL融合基因快速检测探针及其制备方法
和应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种低成本的BCR/ABL融合基因快速检测探针及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 慢性粒细胞白血病是骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤，占成人白血病的15％。大量研究表明慢性髓性白血病的发病机制是t(9；22)(q34；q11)染色体易位产生BCR/ABL融合基因。BCR/ABL基因融合阳性是慢性髓性白血病的典型临床表现，同时，该肿瘤治疗的关键药物格列卫(甲磺酸伊马替尼)能选择性抑制BCR/ABL阳性细胞，因此，检测BCR/ABL基因融合状况对慢性髓性白血病的诊断及治疗均有指导意义。目前核型分析、PCR法和FISH法是常见的几种检测方式。FISH具有安全、灵敏度高及准确度高等优点。
[0003] 荧光原位杂交是一种在20世纪80年代放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性分子遗传技术，以荧光素标记取代放射性同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。目前FISH常用的检测探针主要是通过对特定人类基因组BAC克隆进行缺口平移法或随机引物法标记，再经Human-cot1 DNA封闭后用于原位杂交实验，但在实际应用中存在较多缺点：第一，此方法包含大量的重复序列，经过封闭后仍有较高的杂交背景；第二，此种方法标记的探针通常需要12-16h(过夜)来完成，杂交实验费时费力；第三，此种方需要添加大量昂贵的Human-cot1 DNA(通常是探针浓度的50～100倍)来封闭重复序列，这大大的增加了探针的制备成本。此外，近年来一种不含重复序列的快速荧光原位杂交探针的制备方法也被建立起来(1h完成杂交实验)，但此种方法需要设计大量引物或者构建大量载体来实现探针的制备，并且探针的制备过程仍采用缺口平移或随机引物等传统方法，易导致批次间的不稳定；这种制备方法仍然需要依赖于人类基因组序列或者BAC克隆序列，原料来源具有一定局限性，整个制备过程繁琐，制备成本和不可控因素大大增加。
发明内容
[0004] 本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种低成本的BCR/ABL融合基因快速检测探针及其制备方法和应用。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] 一种低成本的BCR/ABL融合基因快速检测探针的制备方法，包括如下步骤：
[0007] (1)从UCSC Genome Browser下载BCR和ABL基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中BCR探针覆盖区域为：chr22 22806485～23854431，ABL探针覆盖区域为：chr9 130396674～131075953；
[0008] (2)将步骤(1)获得的BCR基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的BCR探针序列；
[0009] (3)将步骤(1)获得的ABL基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的ABL探针序列；
[0010] (4)使用DNA合成仪对步骤(2)所得带有标签序列的BCR探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到BCR探针库；同理，使用DNA合成仪对步骤(3)所得带有标签系列的ABL探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到ABL探针库；
[0011] (5)分别合成5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物和5’端带有橘红色荧光基团的M13通用引物，使用5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物对BCR探针库进行扩增标记反应，使用5’端带有橘红的荧光基团的M13通用引物对ABL探针库进行扩增标记反应；
[0012] (6)步骤(5)所得BCR探针库的扩增标记产物经纯化、稀释后得到荧光标记的BCR探针库，步骤(5)所得ABL探针库的扩增标记产物经纯化、稀释后得到荧光标记的ABL探针库，所述荧光标记的BCR探针库和荧光标记的ABL探针库构成了BCR/ABL融合基因快速检测探针。
[0013] 上述方案中，步骤(2)和步骤(3)中所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85～99℃，GC比40～80％，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针间最小间隔5bp。
[0014] 上述方案中，步骤(2)和步骤(3)中所述标签序列的碱基序列如下所示：
[0015] 5’端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG(M13上游序列)
[0016] 3’端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG(M13下游序列)。
[0017] 上述方案中，步骤(5)中所述通用引物序列为：
[0018] M13-F TGTAAAACGACGGCCAGT；
[0019] M13-R CAGGAAACAGCTATGACC。
[0020] 上述方案中，步骤(5)所述扩增标记反应的PCR反应体系如下：
[0021]
[0022] 上述方案中，步骤(5)所述扩增标记反应的PCR反应条件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共进行35个循环；72℃10min。
[0023] 包含上述制备方法制备所得BCR/ABL融合基因快速检测探针的试剂盒。
[0024] 上述试剂盒在制备检测BCR/ABL融合基因试产品中的应用，具体的应用方式包括如下步骤：
[0025] (1)样本处理：将外周血细胞滴片样本放入盛有2×SSC的容器中，微波炉高火加热处理3min直至液体沸腾，然后再中低火继续加热处理10min，处理完成后立即将玻片置于-20℃预冷的梯度酒精中脱水晾干，备用；
[0026] (2)BCR/ABL融合基因快速检测探针杂交混合物的制备：将荧光标记的BCR探针库、荧光标记的ABL探针库和杂交缓冲液按照1:1:9的体积比混合；
[0027] (3)探针样本共変性：每例样本使用10μL步骤(2)混合所得BCR/ABL融合基因快速检测探针杂交混合物，使用22×22mm盖玻片盖片，使用橡皮胶封片，封片后将玻片置于杂交仪中90℃变性1min，37℃杂交15～30min；
[0028] (4)杂交后洗涤：待杂交完成后揭去盖玻片，将玻片置于60℃预热的洗液中洗涤去除未结合探针；
[0029] (5)复染及镜检：将晾干的玻片滴加10μL抗淬灭封片剂封片，然后在荧光显微镜下观察杂交结果。
[0030] 上述方案中，步骤(2)中所述杂交缓冲液的组分为：10wt％去离子甲酰胺、20wt％硫酸葡聚糖、1μg/mL RNaseA、0.6M氯化钠、10mM柠檬酸缓冲液。
[0031] 上述方案中，步骤(3)中所述洗液含0.3M氯化钠、0.03M柠檬酸钠和0.1％Tween-20。
[0032] 本发明的有益效果如下：
[0033] (1)相比于传统的BAC克隆FISH，本发明所述制备方法完全不依赖BAC克隆，且不含有重复序列，不需要昂贵的Human-cot1DNA进行封闭，大大降低了杂交背景和制备成本。
[0034] (2)相比于近年来建立的不含重复序列的快速荧光原位杂交探针的制备方法，本发明所述制备方法中，探针的筛选主要依赖程序完成，并且使用的是更为稳定的PCR法扩增和标记探针，探针标记率更高更均一，仅在探针5’端进行荧光标记所以不影响探针的杂交配对反应；此外本发明不采用容易受环境或操作手法影响的缺口平移反应和随机引物反应来标记探针，所标记的探针长短一致，增加了批次间的稳定性；
[0035] (3)与现有技术相比，本发明通过优化探针设计配合特定的杂交缓冲液以及独特的检测方法，本发明可在15-30min内完成杂交实验，这比现有技术中最快需要1h来完成杂交实验所耗费的时间相比，降低了50％以上。
[0036] (4)本发明所述的探针具有极高的信噪比，并且具有很高的特异性和样本检出率。
附图说明
[0037] 图1为探针制备示意图。
[0038] 图2为探针与靶基因结合示意图。
[0039] 图3为chunks.pl程序使用代码图。
[0040] 图4为去除重复序列后BCR基因部分探针序列图。
[0041] 图5为本发明BCR/ABL探针的检测结果图。
[0042] 图6为本发明BCR/ABL探针与雅培探针不同杂交时间结果对比图。
具体实施方式
[0043] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0044] 实施例1 BCR/ABL融合基因快速检测探针的制备
[0045] 本实施例所述BCR/ABL融合基因快速检测探针的制备过程示意图如图1所示，具体包括如下步骤：
[0046] (1)从UCSC Genome Browser下载BCR和ABL基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中BCR探针覆盖区域为：chr22 22806485～23854431，ABL探针覆盖区域为：chr9 130396674～131075953；所获取的序列保存为fasta格式，基因组中重复序列区域替换为N；
[0047] (2)将步骤(1)获得的BCR基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl(chunks.pl程序使用代码图见图3)分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85～99℃，GC比40～80％，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针间最小间隔5bp；然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到带有标签的一系列BCR探针序列(图4所示为BCR基因探针池，由于序列过多不一一展示)；标签序列的碱基序列如下：5’端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG(M13上游序列)，3’端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG(M13下游序列)；
[0048] (3)将步骤(1)获得的ABL基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl(chunks.pl程序使用代码图见图3)分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85～99℃，GC比40～80％，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针间最小间隔5bp；然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到带有标签的一系列ABL探针序列；标签序列的碱基序列同步骤(2)；
[0049] (4)使用DNA合成仪对步骤(2)所得带有标签序列的BCR探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到BCR探针库，所述BCR探针库包含1863条带有标签序列的BCR探针；同理，使用DNA合成仪对步骤(3)所得带有标签序列的ABL探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到ABL探针库，所述ABL探针库包含1511条带有标签序列的ABL探针；
[0050] (5)分别合成5’端带有绿色荧光基团和橘红色荧光基团的M13通用引物，通用引物序列为：M13-F TGTAAAACGACGGCCAGT，M13-R CAGGAAACAGCTATGACC；使用5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物对BCR探针库进行扩增标记反应；使用5’端带有橘红的荧光基团的M13通用引物对ABL探针库进行扩增标记反应；所述扩增标记反应的PCR反应体系如下：
[0051]
[0052] 所述扩增标记反应的PCR反应条件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共进行35个循环；72℃10min；
[0053] (6)使用乙醇醋酸钠法分别对步骤(5)所得BCR探针库的扩增标记产物和ABL探针库的扩增标记产物进行纯化，纯化后再经稀释得到：浓度为20ng/μL的荧光标记的BCR探针库和浓度为20ng/μL的荧光标记的ABL探针库。
[0054] 实施例2BCR/ABL融合基因快速检测探针的检测方法
[0055] 本实施例所述BCR/ABL融合基因快速检测探针在用于检测BCR/ABL融合基因的试剂盒中的应用，具体包括如下步骤：
[0056] (1)样本处理：将外周血细胞滴片样本放入盛有2×SSC的容器中，微波炉高火加热处理3min直至液体沸腾，然后再中低火继续加热处理10min，处理完成后立即将玻片置于-20℃预冷的梯度酒精中脱水晾干，备用；
[0057] (2)BCR/ABL融合基因快速检测探针杂交混合物的制备：将实施例1制备所得浓度为20ng/μL的荧光标记的BCR探针库、浓度为20ng/μL的荧光标记的ABL探针库和杂交缓冲液按照1:1:9的体积比混合；所述杂交缓冲液的组分为：10wt％去离子甲酰胺、20wt％硫酸葡聚糖、1ugRNaseA、0.6M氯化钠、10mM柠檬酸缓冲液；
[0058] (3)探针样本共変性：每例样本使用10μL步骤(2)混合所得BCR/ABL融合基因快速检测探针杂交混合物，使用22×22mm盖玻片盖片，使用橡皮胶封片，封片后将玻片置于杂交仪中90℃变性1min，37℃杂交15min～30min；
[0059] (4)杂交后洗涤：待杂交完成后揭去盖玻片，将玻片置于60℃预热的洗液(含0.3M氯化钠、0.03M柠檬酸钠和0.1％Tween-20)中洗涤去除未结合探针；
[0060] (5)复染及镜检：将晾干的玻片滴加10μL抗淬灭封片剂封片，然后在荧光显微镜下观察杂交结果。
[0061] 注意事项：步骤(2)～步骤(4)需避光操作，检测结果如图5所示。
[0062] 采用实施例1制备的BCR/ABL融合基因快速检测探针及实施例2所述检测方法，设置杂交的时间梯度为10min、15min、30min、1h、16h；同时使用雅培公司BCR/ABL探针严格按照其提供的说明书进行样本处理及杂交操作，同样设置杂交10min、15min、30min、1h、16h时间梯度，作为对照。检测结果如图6所示，从图6看出：本发明所制备的BCR/ABL融合基因快速检测探针在杂交时间为15min时就有较好的杂交信号强度，杂交时间为30min及以上时均具有强烈杂交信号；雅培公司雅培公司BCR/ABL探针仅在杂交时间为16小时出现可见清晰杂交信号，充分说明了本发明制备的探针杂交所用时间短及杂交信号强的特点，也说明了本发明制备的探针具有极高的信噪比，很高的特异性和样本检出率。同时本发明制备的探针不含重复系列，且探针长短均一，探针与靶基因结合示意图如图2所示，从图2可以看出，所述探针与靶基因非重复系列区域的结合特异性非常高。
[0063] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
