一种无酶电化学生物传感器电极的制备方法及其应用

摘要

一种无酶电化学生物传感器电极的制备方法，所述无酶电化学生物传感器电极基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料，采用电沉积方式一步原位制备聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料修饰电极；所制备的无酶电化学生物传感器电极的应用，用于构建基于电化学方法的无酶的各种生物传感器，具有单组分及多组分检测功能。本发明的优点是：该无酶电化学生物传感器电极制作工艺简单，操作方便；能够通过电化学方法对电极进行多次修饰并实现待测样品的无酶检测；传感器的再现性、重复性、稳定性好，检测限低，测试灵敏度和准确度高；成本低，有利于民用化。

权利要求

1.一种无酶电化学生物传感器电极的制备方法，其特征在于所述无酶电化学生物传感器电极基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料，采用电沉积方式一步原位制备聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料修饰电极，步骤如下：

1)工作电极表面进行清洗处理

将工作电极用氧化铝粉末抛光成镜面后，依次用浓度为50wt％的硝酸水溶液、超纯水、无水乙醇和超纯水中分别超声清洗10min，去除有机及无机污垢，清洁电极表面；

2)配制碳纳米管、氯化钾、氯化镍和3，4-乙烯二氧噻吩的混合溶液

将碳纳米管、氯化钾、氯化镍和3，4-乙烯二氧噻吩混合均匀得到混合溶液，混合溶液中碳纳米管、氯化钾、氯化镍和3，4-乙烯二氧噻吩的浓度分别为0.5mg/mL、0.1mol/L、0.2mol/L及2.1g/L；

3)聚(3,4乙烯二氧噻吩)/镍/碳纳米管修饰电极的制备

将清洗干净的工作电极、参比电极和对电极组成的三电极系统插入到步骤2)得到的混合溶液中，采用循环伏安法进行电沉积处理，电位范围设置为-0.8V～1.5V，电压扫描速度为0.01V/s～0.1V/s，然后取出三电极系统用超纯水冲洗干净，得到聚(3,4乙烯二氧噻吩)/镍/碳纳米管修饰电极；

4)无酶电化学生物传感器电极的制备

把步骤3)中制得的聚(3,4乙烯二氧噻吩)/镍/碳纳米管修饰电极插入到pH为4～10、浓度为0.1～0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中用循环伏安法对镍进行氧化处理，电位范围设置为-

0.8V～1.5V，电压扫描速度为0.01V/s～0.1V/s，取出工作电极用超纯水冲洗干净并用氮气吹干，得到基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料的无酶电化学生物传感器电极。

2.根据权利要求1所述无酶电化学生物传感器电极的制备方法，其特征在于：所述步骤

3)中的工作电极为玻碳电极、金电极或导电玻璃，参比电极为饱和甘汞电极、Ag/AgCl电极或石墨电极；对电极为铂片电极。

3.一种权利要求1所制备的无酶电化学生物传感器电极的应用，其特征在于：用于构建基于电化学方法的无酶检测癌胚抗原CEA及同时检测多巴胺、五羟色胺、色氨酸三种物质的生物传感器，具有单组分及多组分检测功能。

说明书

一种无酶电化学生物传感器电极的制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于电化学生物传感器技术领域，特别涉及一种基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管(PEDOT/NiO/CNT)复合材料的无酶电化学生物传感器电极的制备及生物分子的检测领域中应用方法。

背景技术

[0002] 无酶电化学生物传感器克服酶电化学生物传感器的缺点，不使用酶，所以不易失活可以延长使用寿命，可以实现体外生物分子或者蛋白质的检测；因利用电化学技术实现分析物的测定，检测速度提升、灵敏度提高、成本降低、操作简单。

[0003] 以3,4-乙烯二氧噻吩单体电聚合PEDOT[聚(3,4乙烯二氧噻吩)]过程及镍离子还原成镍的过程，把CNT(碳纳米管)共同修饰到玻碳电极、金电极、导电玻璃等固体电极上，这种原位沉积多组分电催化物质的电沉积方法，不仅能提高敏感膜及固体电极之间的结合强度，还可以直接构造各种纳米结构或形态，并具有所有成分的电催化活性优势。

[0004] PEDOT[聚(3,4乙烯二氧噻吩)]是导电聚合物，具有良好的成膜特性，CNT(碳纳米管)具有电导率高、生物相容性强等优势，而二者均具有良好的电催化活性；由PEDOT[聚(3,4乙烯二氧噻吩)]附着在CNT(碳纳米管)表面形成纳米片结构二者共同构成蓬松的海绵状网络结构，增大了比表面积，有利于增加蛋白质的吸附量。NiO有着良好的化学稳定性和电学性能，有强催化作用，代替金，不损失催化活性的同时，能够大大降低制作成本。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对上述存在问题，提供一种无酶电化学生物传感器电极的制备方法及其应用，该无酶电化学生物传感器电极基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料，采用电沉积方式一步原位制备聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料修饰电极，用其可以构建基于电化学方法的无酶的各种生物传感器，具有单组分及多组分检测功能。

[0006] 本发明的技术方案：

[0007] 一种无酶电化学生物传感器电极的制备方法，所述无酶电化学生物传感器电极基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料，采用电沉积方式一步原位制备聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料修饰电极，步骤如下：

[0008] 1)固体电极表面进行清洗处理

[0009] 将固体电极用氧化铝粉末抛光成镜面后，依次用浓度为50wt％的硝酸水溶液、超纯水、无水乙醇和超纯水中分别超声清洗10min，去除有机及无机污垢，清洁电极表面；

[0010] 2)配制碳纳米管、氯化钾、氯化镍和3，4-乙烯二氧噻吩的混合溶液[0011] 将碳纳米管、氯化钾、氯化镍和3，4-乙烯二氧噻吩混合均匀得到混合溶液，混合溶液中碳纳米管、氯化钾、氯化镍和3，4-乙烯二氧噻吩的浓度分别为0.5mg/mL、0.1mol/L、0.2mol/L及2.1g/L；

[0012] 3)聚(3,4乙烯二氧噻吩)/镍/碳纳米管修饰电极的制备

[0013] 将清洗干净的工作电极、参比电极和对电极组成的三电极系统插入到步骤2)得到的混合溶液中，采用循环伏安法进行电沉积处理，电位范围设置为-0.8V～1.5V，电压扫描速度为0.01V/s～0.1V/s，然后取出三电极系统用超纯水冲洗干净，得到聚(3,4乙烯二氧噻吩)/镍/碳纳米管修饰电极；

[0014] 4)无酶电化学生物传感器电极的制备

[0015] 把步骤3)中制得的聚(3,4乙烯二氧噻吩)/镍/碳纳米管修饰电极插入到pH为4～10、浓度为0.1～0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中用循环伏安法对镍进行氧化处理，电位范围设置为-0.8V～1.5V，电压扫描速度为0.01V/s～0.1V/s，取出工作电极用超纯水冲洗干净并用氮气吹干，得到基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料的无酶电化学生物传感器电极。

[0016] 所述步骤3)中的工作电极为玻碳电极、金电极或导电玻璃，参比电极为饱和甘汞电极、Ag/AgCl电极、贡/硫酸亚汞电极或石墨电极；对电极为铂片电极。

[0017] 一种所制备的无酶电化学生物传感器电极的应用，用于构建基于电化学方法的无酶的各种生物传感器，具有单组分及多组分检测功能。

[0018] 本发明的优点是：

[0019] 该无酶电化学生物传感器电极制作工艺简单，操作方便；能够通过电化学方法对电极进行多次修饰并实现待测样品的无酶检测；传感器的再现性、重复性、稳定性好，检测限低，测试灵敏度和准确度高；成本低，有利于民用化。

附图说明

[0020] 图1为使用本发明提出的方法制备的基于PEDOT/NiO/CNT复合材料的无酶电化学生物传感器电极的扫描电子显微镜(SEM)照片。

[0021] 图2为使用本发明提出的方法制备的基于PEDOT/NiO/CNT复合材料的无酶电化学生物传感器电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为对电极在不同的癌胚抗原浓度下测得差分脉冲伏安(DPV)曲线及工作曲线，图中a为DPV曲线，b为癌胚抗原样品的工作曲线，其中，癌胚抗原样品的线性范围为：151fg/mL～1510fg/mL。

[0022] 图3为使用本发明提出的方法制备的基于PEDOT/NiO/CNT复合材料的无酶电化学生物传感器电极，检测多巴胺、五羟色胺及色氨酸的DPV曲线。

具体实施方式

[0023] 下面对本发明的实施例作详细说明，下述的实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实时方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0024] 实施例1：

[0025] 一种无酶电化学生物传感器电极的制备方法，所述无酶电化学生物传感器电极基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料，采用电沉积方式一步原位制备聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料修饰电极，步骤如下：

[0026] (1)工作电极的制备

[0027] ①将玻碳电极表面进行清洗处理：将玻碳电极用氧化铝粉末抛光成镜面后，依次用浓度为50wt％的硝酸水溶液、超纯水、无水乙醇和超纯水中分别超声清洗10min，去除有机及无机污垢，清洁电极表面；

[0028] ②配制碳纳米管、氯化钾、氯化镍和3，4-乙烯二氧噻吩的混合溶液，混合溶液中其浓度依次为0.5mg/mL、0.1mol/L、0.2mol/L及2.1g/L；

[0029] ③清洗干净的玻碳电极、饱和甘汞电极和铂片电极组成的三电极系统插入到②所配溶液中采用循环伏安法进行电沉积处理，然后取出三电极系统用超纯水冲洗干净，获得PEDOT/Ni/CNT修饰电极，循环伏安法的参数中，电位范围设置为-0.8V～1.5V，扫描速度为0.1V/s，电压循环次数为52圈；

[0030] ④再把步骤③中制备的PEDOT/Ni/CNT修饰电极插入到pH值为4～10、浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲溶液中，用循环伏安法对镍进行氧化处理，取出工作电极用超纯水冲洗干净并氮气吹干电极，得到基于PEDOT/NiO/CNT复合材料的无酶电化学生物传感器电极。
循环伏安法的参数中，电位范围设置为-0.8V～1.5V,扫描速度为0.1V/s，电压循环次数为
12圈，即制得PEDOT/NiO/CNT复合材料修饰电极。基于PEDOT/NiO/CNT复合材料的无酶电化学生物传感器电极的SEM照片如图1所示。

[0031] (2)制作电化学生物传感器的工作曲线：

[0032] 将步骤(1)④中得到的工作电极孵育固定癌胚抗体，用牛血清白蛋白封闭非特异性位点：将癌胚抗体用pH值为7.4、浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲溶液稀释，将电极浸入癌胚抗体溶液中37℃恒温孵育12小时，清洗干燥后放入1.5wt％的牛血清(BSA)溶液中37℃恒温密闭放置30min并干燥，即得到固定了癌胚抗体的敏感膜；

[0033] 再将其插入配制的癌胚抗原(CEA)溶液中37℃恒温密闭放置30min，最后取出电极用pH值为7.4、浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲溶液冲洗并氮气吹干电极；

[0034] 打开电化学工作站，将固定了癌胚抗原(CEA)的工作电极、对电极和参比电极正确连接在电化学工作站中；

[0035] 以5mL铁氰化钾溶液为底液，采用差分脉冲伏安法分别测定不同浓度的癌胚抗原的峰电流，其中差分脉冲伏安法的参数中，电位范围设置为-1.0V～1.0V；电位增量设置为0.004V；振幅设置为0.05V；脉冲宽度设置为0.06s；脉冲周期设置为0.5s；铁氰化钾溶液的配制方法为0.005mol/L的K3Fe4(CN)6和0.005mol/L的K4Fe3(CN)6溶于0.1mol/L的KCl溶液中。

[0036] 根据得到的峰电流与癌胚抗原(CEA)浓度，以CEA浓度为横坐标，峰电流作为纵坐标，绘制曲线，进行线性拟合获得工作曲线，如图2所示。测定结果表明：CEA的线性回归方程为ICEA(μA)＝84.5-0.043[CEA](fg/mL)，([CEA]：151fg/mL～1510fg/mL，R＝0.996)，检测限为0.15pg/mL。

[0037] 实施例2：

[0038] 一种无酶电化学生物传感器电极的制备方法，所述无酶电化学生物传感器电极基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料，采用电沉积方式一步原位制备聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料修饰电极，步骤如下：

[0039] (1)工作电极的制备

[0040] ①将玻碳电极表面进行清洗处理：将玻碳电极用氧化铝粉末抛光成镜面后，依次用浓度为50wt％的硝酸水溶液、超纯水、无水乙醇和超纯水中分别超声清洗10min，去除有机及无机污垢，清洁电极表面；

[0041] ②配制碳纳米管、氯化钾、氯化镍和3，4-乙烯二氧噻吩的混合溶液，这些物质的浓度依次为0.5mg/mL、0.1mol/L、0.2mol/L及2.1g/L；

[0042] ③清洗干净的玻碳电极、饱和甘汞电极和铂片电极组成的三电极系统插入到②所配溶液中采用循环伏安法进行电沉积处理，然后取出三电极系统用超纯水冲洗干净，获得PEDOT/Ni/CNT修饰电极，循环伏安法的参数中，电位范围设置为-0.8V～1.5V，扫描速度为0.1V/s，电压循环次数为52圈；

[0043] ④再把步骤③中制备的PEDOT/Ni/CNT修饰电极插入到pH值范围为4～10、浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲溶液中用循环伏安法对镍进行氧化处理，取出工作电极用超纯水冲洗干净并氮气吹干电极，得到基于PEDOT/NiO/CNT复合材料的无酶电化学生物传感器电极。循环伏安法的参数中，电位范围设置为-0.8V～1.5V，扫描速度为0.1V/s，电压循环次数为12圈，基于PEDOT/NiO/CNT复合材料的无酶电化学生物传感器电极的SEM照片如附图1所示。

[0044] (2)绘制DPV曲线：

[0045] 以磷酸缓冲溶液为底液，配制pH值为7.0的多巴胺溶液、五羟色胺溶液、色氨酸溶液以及三者的混合溶液。其中多巴胺浓度为1μmol/L，五羟色胺浓度为1μmol/L，色氨酸浓度为10μmol/L。

[0046] PEDOT/NiO/CNT复合材料修饰电极、饱和甘汞电极和铂片电极连接电化学工作站，并将这三个电极插入到配制的多巴胺溶液、五羟色胺溶液、色氨酸溶液以及三者的混合溶液中，采用电化学工作站中的差分脉冲伏安法测试电流—电压曲线，如图3所示。差分脉冲伏安法的参数中电位范围设置为-0.6V～1.2V；电位增量设置为0.004V，振幅设置为0.05V，脉冲宽度设置为0.06s，脉冲周期设置为0.5s。由于每种待测物的电化学响应特性不同，在上述步骤中测试的差分脉冲伏安法电压—电流曲线中，会出现这三种待测物的响应特征峰。从曲线中获得多巴胺、五羟色胺、色氨酸的峰电位依次为0.13V、0.29V、0.59V左右，峰电位差均超过100mV，显然具有峰分离能力，这些峰电位作为定性指标。

[0047] 本实施例中，检测多巴胺、五羟色胺、色氨酸三种物质的浓度依次为1μmol/L、1μmol/L及10μmol/L。当采用DPV法对三种生物分子单独及叠加测试时，在单独溶液及混合物中三者的峰电位保持不变，且峰电流也基本没有变化，表示本方法制备的基于PEDOT/NiO/CNT复合材料的无酶电化学生物传感器电极对于多组分同时测定具有高的选择性。