一种快速区分金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌的检测方法

摘要

本发明公开了一种快速区分金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌的检测方法，利用顶空气相色谱‑质谱联用技术检测金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌液态发酵产生的挥发性产物，根据两种葡萄球菌产生的挥发性产物种类不同，区分金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌。本发明采用的方法比现有的传统生化实验鉴定时间缩短1‑2天，可以快速区分平板上的金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌，实现快速筛选。该方法自动化程度高，有效降低一线检测人员接触食源致病菌的几率，减少食源致病菌对人和环境污染的风险。

权利要求

1.一种快速区分金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌的检测方法，其特征在于，利用顶空气相色谱-质谱联用技术检测金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌液态发酵的挥发性产物，根据两种葡萄球菌产生的挥发性产物种类不同，区分金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌；

所述的检测方法具体包括下列步骤：

（1）金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌的培养物制备

接种环分别转接金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌到灭菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，30-40 ℃，120-200 r/min条件下，摇床振荡培养8-18 h；吸取培养物5 mL转入20 mL顶空瓶内，加盖密封，作为测试样品；

其中，胰蛋白胨大豆肉汤组分为：

胰蛋白胨17.0 g/L，植物蛋白胨 3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，葡萄糖2.5 g/L，磷酸氢二钾 2.5 g/L；

（2）HS-GC-MS分析

顶空（HS）进样条件：加热箱温度40-60 ℃，定量环温度：85 ℃，传输线温度：100 ℃，样品平衡时间：30-60 min；色谱柱压力：7.7 psi；填充压力：15 psi；加压时间：0.2 min；进样持续时间：1.0 min，拔针时间：0.5 min；

气相色谱（GC）条件：30 m × 250 μm × 0.25μm的 HP-INNOWax气相色谱柱；分流进样，分流比为5:1，隔垫吹扫流量为3 mL/min；升温程序：初始温度50 ℃保持2min，以7 ℃/min升至180 ℃；再以10 ℃/min升至250 ℃，保持2 min，进样口温度：250℃ ；载气：高纯氦(He)，流速：1 mL/min；

质谱（MS）条件：离子源EI，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，电子能量70 eV，传输线温度280 ℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：33-300 u，溶剂延迟：1-3 min；

（3）金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌的挥发性产物区分

金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌产生的挥发性产物种类不同，主要区分化合物为乙醇，金黄色葡萄球菌的胰蛋白胨大豆肉汤液态发酵产生的挥发性产物中可以检测到大量乙醇，并且采用面积归一法计算乙醇的相对含量为55%-85%，而沃氏葡萄球菌的液态发酵产生的挥发性产物中未检测到乙醇，检测到大量乙酸，并且采用面积归一法计算乙酸的相对含量为70%-81%。

说明书

一种快速区分金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种利用顶空气相色谱-质谱联用(Headspace gas chromatography-mass spectrometry，HS-GC-MS)技术快速区分金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌的检测方法。

背景技术

[0002] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)可引起肺炎、急性肠炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染，易引起食物中毒；通常是通过人畜化脓性感染的动物食品进入人的体内，而一般容易受污染的食品主要是动物性食品，如牛肉、禽肉、乳制品等。受到金黄色葡萄球菌污染的食物与正常食物在外形与味觉上没有区别，因此准确、快速地检测食品中的金黄色葡萄球菌具有十分重要的意义。金黄色葡萄球菌的检测多采用传统的生化反应实验等，该方法所需时间长，一般情况下需要5-7天，很难满足快速检测的需要。

[0003] 食品安全国家标准《GB 4789.10-2016食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》中，金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上形态：呈圆形，表面光滑，菌落直径为2-3mm，颜色呈灰黑色，周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。日常检测过程中，沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)在进出口食品中经常检测到，其在Baird-Parker平板上的形态与金黄色葡萄球菌相似：圆形，表面光滑，湿润，菌落直径为2-3mm，颜色呈灰黑色，周围有沉淀环。因此两种葡萄球菌在Baird-Parker平板上难以区分。金黄色葡萄球菌在血平板上形态：菌落较大，圆形，光滑凸起，湿润，金黄色(有时为白色)，菌落周围可见透明溶血圈；沃氏葡萄球菌在血平板上形态：菌落为圆形，表面光滑，灰白色，菌落周围有溶血圈，因此两种葡萄球菌在血平板上形态相似，不易区分。两种葡萄球菌染色镜检都为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄球状，镜检无法区分。

[0004] 随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速的金黄色葡萄球菌检测方法。PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，增菌液中往往含有PCR抑制剂，从而影响PCR的扩增结果。免疫学检测方法，金黄色葡萄球菌和沃氏葡萄球菌都属于葡萄球菌属，由于菌体抗原交叉反应的存在，难以有效区分金黄色葡萄球菌和沃氏葡萄球菌。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种快速区分金黄色葡萄球菌和沃氏葡萄球菌的检测方法，以克服现有技术的上述缺点，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。

[0006] 本发明的主要原理为：利用顶空气相色谱-质谱联用(Headspace  gas chromatography-mass spectrometry，HS-GC-MS)技术检测金黄色葡萄球菌和沃氏葡萄球菌液态发酵产生的挥发性产物，根据两种葡萄球菌产生的挥发性产物种类不同达到区分的目的，具体包括下列步骤：

[0007] 1、金黄色葡萄球菌和沃氏葡萄球菌的培养物制备

[0008] 接种环转接菌株到灭菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，30-40℃，100-200r/min条件下，摇床振荡培养8-18h。吸取该培养物1-10mL转入20mL顶空瓶内，加盖密封，作为测试样品。

[0009] 其中，胰蛋白胨大豆肉汤组分为：

[0010] 胰蛋白胨17.0g/L，植物蛋白胨3.0g/L，氯化钠5.0g/L，葡萄糖2.5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L。

[0011] 2、HS-GC-MS分析

[0012] 顶空(HS)进样条件：加热箱温度40-60℃，定量环温度：85℃，传输线温度：100℃，样品平衡时间：30-60min；色谱柱压力：7.7psi；填充压力：15psi；加压时间：0.2min；进样持续时间：1.0min，拔针时间：0.5min。

[0013] 气相色谱(GC)条件：色谱柱(30m×250μm×0.25μm)；分流进样，分流比为5:1，隔垫吹扫流量为3mL/min；升温程序：初始温度35-55℃保持2-10min，以3-10℃/min升至120-200℃；再以5-10℃/min升至250℃，保持1-5min，进样口温度：250℃；载气：高纯氦(He)，流速：1mL/min。

[0014] 质谱(MS)条件：离子源EI，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70eV，传输线温度280℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：30-300u，溶剂延迟：1-3min。

[0015] 3、挥发性产物的定性与定量

[0016] MS结果经计算机检索谱库进行定性分析，同时由软件系统完成手动对照检索。采用提取离子流方式报告挥发性物质的峰面积。

[0017] 其中，两种葡萄球菌产生的挥发性产物种类不同，主要区分化合物为乙醇，金黄色葡萄球菌的液态发酵的挥发性产物中可以检测到大量乙醇，并且采用面积归一法计算乙醇的相对含量为55％-85％，而沃氏葡萄球菌的液态发酵的挥发性产物中未检测到乙醇，检测到大量乙酸，并且采用面积归一法计算乙酸的相对含量为70％-81％。

[0018] 本发明的有益效果：

[0019] 本发明的方法作为一种筛选工具，比现有的传统生化实验鉴定时间缩短1-2天，可以快速区分BP平板或血平板上的金黄色葡萄球菌和沃氏葡萄球菌，实现快速筛选。相对于PCR方法和免疫方法，该筛选方法自动化程度更高，降低一线检测人员接触食源致病菌的几率，减少食源致病菌对人和环境污染的风险。

具体实施方式

[0020] 下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。

[0021] 图1是沃氏葡萄球菌CGMCC 1.2824与金黄色葡萄球菌ATCC 25923产生的挥发性化合物的总离子流色谱图。

[0022] 实施例1

[0023] (1)金黄色葡萄球菌ATCC 25923与沃氏葡萄球菌CGMCC 1.2824的培养物制备[0024] 接种环无菌操作转接金黄色葡萄球菌ATCC 25923到5mL的灭菌胰蛋白胨大豆肉汤中，36℃，150r/min条件下，摇床振荡培养12h。吸取全部培养物转入20mL安捷伦钳口顶空样品瓶内，加盖密封，作为金黄色葡萄球菌待测试培养物。

[0025] 接种环无菌操作转接沃氏葡萄球菌CGMCC 1.2824到5mL的灭菌胰蛋白胨大豆肉汤中，36℃，150r/min条件下，摇床振荡培养12h。吸取全部培养物转入20mL安捷伦钳口顶空样品瓶内，加盖密封，作为沃氏葡萄球菌待测试培养物。

[0026] 其中，蛋胰白胨17.0g/L，植物蛋白胨3.0g/L，氯化钠5.0g/L，葡萄糖2.5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L。购自北京陆桥技术责任有限公司。

[0027] (2)培养物的顶空气相色谱-质谱联用法分析

[0028] 采用美国安捷伦公司Agilent 7890B-5977A系列气相色谱/质谱联用系统(配有Agilent 7697A顶空自动进样器)对金黄色葡萄球菌待测试培养物、沃氏葡萄球菌待测试培养物进行挥发性产物的分析。顶空进样、气相色谱和质谱条件如下：

[0029] 顶空(HS)进样条件：加热箱温度50℃，定量环温度：85℃，传输线温度：100℃，样品平衡时间：50min；色谱柱压力：7.7psi；填充压力：15psi；加压时间：0.2min；进样持续时间：1.0min，拔针时间：0.5min。

[0030] 气相色谱(GC)条件：HP-INNOWax色谱柱(30m×250μm×0.25μm)；分流进样，分流比为5:1，隔垫吹扫流量为3mL/min；升温程序：初始温度50℃保持2min，以7℃/min升至180℃；再以10℃/min升至250℃，保持2min，进样口温度：250℃；载气：高纯氦(He)，流速：1mL/min。

[0031] 质谱(MS)条件：离子源EI，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70eV，传输线温度280℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：33～300u，溶剂延迟：2.2min。

[0032] (3)挥发性产物的定性与定量

[0033] 采用安捷伦GCMS Chemstation软件中的谱库(NIST11.L)对气相色谱-质谱结果进行化合物的定性分析，同时由NIST MS Search 2.0软件系统完成手动对照检索，要求正反向匹配因子(Match)都大于700(良好匹配)，可能性(Prob.％)大于60。采用提取离子流方式计算挥发性物质的峰面积，利用面积归一法计算挥发性化合物的相对含量。选取相对含量大于1％的代表性挥发性化合物作为区分金黄色葡萄球菌和沃氏葡萄球菌的化合物种类(表1)。

[0034] 表1金黄色葡葡球菌ATCC 25923与沃氏葡葡球菌CGMCC 1.2824产生的各种挥发性化合物

[0035]

[0036] 注：CAS编号是化学物质登录号。

[0037] 金黄色葡萄球菌ATCC 25923与沃氏葡萄球菌CGMCC 1.2824产生的挥发性化合物的总离子流色谱图(图1)可以直观显示出两种葡萄球菌的化合物种类差别。其中，沃氏葡萄球菌CGMCC 1.2824的挥发性化合物(图1-A)中未检测到乙醇，检测到大量乙酸(相对含量为80.4％)，而在金黄色葡萄球菌ATCC 25923的挥发性化合物(图1-B)检测到大量乙醇(相对含量65％)。

[0038] 方法验证

[0039] 一种快速区分金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌的检测方法，该方法通过10株不同来源的金黄色葡萄球菌和沃氏葡萄球菌进行方法验证，产生的挥发性化合物见表2。表2数据结果表明该方法可以有效区分10株不同来源的金黄色葡萄球菌和沃氏葡萄球菌，方法的稳定性良好，通过进一步验证大量不同来源的金黄色葡萄球菌和沃氏葡萄球菌，可以应用于日常检测中区分金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌。

[0040] 表2 金黄色葡萄球菌与沃氏葡萄球菌产生的各种挥发性化合物

[0041]

[0042]

[0043] 注：金黄色葡萄球菌ATCC29213和金黄色葡萄球菌CGMCC1.1529为标准菌株；金黄色葡葡球菌F13-23、金黄色葡葡球菌F9-17、金黄色葡葡球菌F9-5、金黄色葡萄球菌F13-7、金黄色葡萄球菌F9-10、金黄色葡葡球菌F9-12、沃氏葡葡球菌F18-2和沃氏葡萄球菌F16-4分离自不同的食品基质中，实验室甘油冷冻保存。

[0044] 当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。