一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法转让专利
申请号 : CN201710038732.3
文献号 : CN106854638B
文献日 : 2019-12-27
发明人 : 孟庆雪 , 张怡 , 刘艳青
申请人 : 天晴干细胞股份有限公司
摘要 :
一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，它涉及一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法。本发明的目的是提供一种不同来源的间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法，进而获得大量的胰岛样细胞。为实现上述目标，具体方法如下：1)脐带、胎盘或脂肪来源间充质干细胞的分离及原代培养；2)分化培养基的制备包括：制备脑组织条件培养基(BTCM)、细胞分化诱导液以及干细胞条件培养基(SCM)；3)三阶段诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化；4)获得的胰岛样细胞的鉴定。通过本方法获得胰岛样细胞成熟度高，较少的细胞数量即可达到快速降糖作用，具有广阔的应用前景，本发明应用于生物医学领域。
权利要求 :
1.一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于它按照以下步骤进行：
一、从脐带、胎盘或脂肪组织中分离获得间充质干细胞，并传代培养；
二、分化培养基制备
所述的分化培养基包括脑组织条件培养基、细胞分化诱导液和干细胞条件培养基；
所述的脑组织条件培养基制备过程如下：在无菌条件下，取出生6～7天大鼠的大脑，用PBS或盐水清洗后，1000rpm离心6min，弃上清，用10％FBS的DMEM高糖培养基重悬沉淀，将脑组织捣碎为单个细胞，收集脑组织细胞用10％FBS的DMEM高糖培养1d后，加入浓度为1～2μmol/L的阿糖胞苷培养，在培养的第5d收集培养液，即为BTCM；
所述的细胞分化诱导液成分为：以DMEM/F12为基础培养基，内含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺、β细胞调节素、Conophylline100μg/L；
所述的干细胞条件培养基制备过程如下：用含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺和2％B27的DMEM/F12培养基培养MSCs，3天后收集培养液即为SCM；
三、将P3代脐带、胎盘或脂肪来源的间充质干细胞以4×104个/ml接种于6孔板中，培养基为含10％FBS的DMEM/F12，24h后更换BTCM培养7天，每2日更换一次BTCM，细胞分化诱导液再培养7天，每2日换一次液，然后细胞分化诱导液和SCM联合共同培养14天，即可获得成熟的胰岛样细胞。
2.根据权利要求1所述的一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于所述的将步骤一传代培养后的脐带、胎盘或脂肪组织间充质干细胞分化为胰岛样细胞具体过程如下：将步骤一传代培养至P3代的脐带、胎盘或脂肪组织的间充质干细胞以4×104个/mL接种量接种于6孔板中，在含10％FBS的DMEM/F12进行培养，培养24h后更换BTCM培养7天，每2日更换一次BTCM，培养7天后，再用细胞分化诱导液培养7天，每2日换一次诱导液，然后用细胞分化诱导液和SCM按体积比为1:1的比例联合共同培养14天，即获得成熟的胰岛样细胞。
3.根据权利要求1所述的一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于所述的脐带间充质干细胞分离及传代培养过程如下：取足月胎儿脐带15～20cm，经过生理盐水和体积百分含量为75％酒精清洗后，剪成长度为2～3cm，分别将动脉和静脉剥离，将中间的华通氏胶分离出来，在无菌条件下剪成0.5～2mm3组织块，按照1g/T75瓶接种，采用10％FBS培养基进行培养，5d后进行换液，待细胞融合度达到80％以上后，通过体积百分浓度为0.125％的胰酶进行消化，获取单个细胞，按照8×105个细胞/T75瓶接种，采用10％FBS培养基进行培养，置于二氧化碳培养箱，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，同时对脐带MSCs的免疫标记检测，检测合格的留存，即完成所述的脐带间充质干细胞分离及传代培养。
4.根据权利要求1所述的一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于所述的胎盘间充质干细胞分离和传代培养过程如下：在无菌条件下，先用体积百分含量为75％酒精对胎盘采集袋进行消毒处理，随后生理盐水清洗胎盘2遍，剥离羊膜后，取胎盘绒毛层组织，加生理盐水清洗血渍，清洗后将绒毛层组织置于50mL洁净离心管内，剪成0.2～1mm3的组织块，加入3倍组织块体积的I型胶原酶，
37℃摇床内消化30min，加入10mL无血清培养基终止消化，过滤于50mL洁净离心管内，
1300r/min离心6分钟，弃上清，取沉淀，按照1×106个细胞/T75瓶接种，采用10％FBS培养基进行培养，置于二氧化碳培养箱，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，同时对胎盘MSCs的免疫标记检测，检测合格的留存，即完成所述的胎盘间充质干细胞分离和传代培养。
5.根据权利要求1所述的一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于所述的脂肪间充质干细胞分离和传代培养过程：在无菌条件下，先用体积百分含量为75％酒精处理脂肪采集瓶，随后生理盐水清洗脂肪2～3遍，转移脂肪组织至50mL离心管中，加入3倍组织块体积的I型胶原酶，37℃摇床内消化35min，加入约15mL无血清培养基终止消化，过滤至50mL离心管内，1300r/min离心6分钟，弃上清，取沉淀，按照1×106～1.5×106个细胞/T75瓶接种，采用10％FBS培养基进行培养，放置于二氧化碳培养箱，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，同时对脂肪MSCs的免疫标记检测，检测合格的留存，即完成所述的脂肪间充质干细胞分离和传代培养。
说明书 :
一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物医学领域，特别涉及一种体外诱导干细胞向胰岛样细胞定向分化的方法及胰岛样细胞的应用。
背景技术
[0002] 糖尿病是一种慢性代谢性、多因素疾病，由绝对(I型糖尿病)和相对的(II型糖尿病)胰岛素缺乏导致高血糖症，两者之间的共同点均是胰岛β细胞功能不足，临床早期无明显症状，症状期会出现三多一少现象，常常伴随身体多系统的损害，严重伤害身体，甚至威胁生命。I型糖尿病的发病原因主要是自身免疫反应导致胰岛β细胞破坏，无法维持葡萄糖水平的稳定。胰岛移植，特别是对重症患者，是一种更直接的治疗方法，但由于供体缺乏、胰腺/胰岛分离费用高、移植产生的炎性反应需要多次移植和长期服用免疫排斥药物等问题而未能在临床上广泛应用。糖尿病患者胰岛功能的改善对延缓并发症的发生尤为重要，借助干细胞技术，在糖尿病患者体内重建内源性胰岛素分泌系统，成为再生医学领域中备受关注的研究方向。干细胞具有多向分化潜能，其中间充质干细胞(MSCs)是中胚层中具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为神经、汗腺、骨、软骨、脂肪、肝脏等多种组织细胞。脂肪、脐带和胎盘来源的MSC具有取材方便，传代能力强，免疫反应低，被污染的概率较小，无伦理学限制等优点，在一定条件下可分化为胰岛β细胞或胰岛素生成细胞(IPCs)，此方法成为替代现有短缺的胰岛细胞、实现临床糖尿病治疗的重要研究途径。研究表明，胰腺内分泌细胞来自内胚层，并且表达神经元标志物，同时在脊椎动物的大脑中发现胰岛素基因转录，这些结果都显示胰岛细胞与神经元存在相似之处，因此在神经元条件培养基的作用下可能更有益于胰岛样细胞的生长。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，利用新出生的鼠大脑制备脑组织条件培养基(BTCM)，利用阿糖胞苷、尼克酰胺、B27、Conophylline等诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞，并通过进一步的鉴定来探讨间充质干细胞的分化潜能，同时寻找一种高效的胰岛样细胞的分化体系，为间充质干细胞分化为成熟胰岛样细胞的临床应用奠定基础。
[0004] 本发明的一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，它按照以下步骤进行：
[0005] 一、从脐带、胎盘或脂肪组织中分离获得间充质干细胞，并传代培养；
[0006] 二、分化培养基制备
[0007] 所述的分化培养基包括脑组织条件培养基、细胞分化诱导液和干细胞条件培养基；
[0008] 所述的脑组织条件培养基制备过程如下：在无菌条件下，取出生6～7天大鼠的大脑，用PBS或盐水清洗后，1000rpm离心6min，弃上清，用10％FBS的DMEM高糖培养基重悬沉淀，将脑组织捣碎为单个细胞，收集脑组织细胞用10％FBS的DMEM高糖培养1d后，加入浓度为1～2μmol/L的阿糖胞苷培养，在培养的第5d收集培养液，即为BTCM；
[0009] 所述的细胞分化诱导液成分为：以DMEM/F12为基础培养基，内含2％FBS、80～100μg/L长春碱衍生物和2％B27；
[0010] 所述的干细胞条件培养基制备过程如下：用含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺的DMEM/F12培养基培养MSCs，3天后收集培养液即为SCM；
[0011] 三、将步骤一传代培养后的脐带、胎盘或脂肪组织间充质干细胞分化为胰岛样细胞，进行鉴定后，即完成所述的诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞。
[0012] 所述的长春碱衍生物为Conophylline。
[0013] 本发明包含以下有益效果：
[0014] 1)本发明所提供的诱导体系安全、无副作用，采用大鼠脑制备BTCM，其中包含多种天然诱导因子，联合尼克酰胺、Conophylline和B27等细胞因子的协同作用高效诱导胰岛素分泌细胞的生成。与传统方法相比，此次诱导体系使用细胞因子种类少且剂量少，降低临床使用风险。在最后阶段的SCM为胰岛素样细胞簇提供保护作用，克服了细胞易凋亡、分化不成熟、葡萄糖诱导毒性等缺点。
[0015] 2)本发明获得的胰岛样细胞分泌能力强。已报道的数据显示胰岛样细胞团在高葡萄糖刺激下，胰岛素分泌量约为50～70mU/L，而本发明诱导的胰岛样细胞团具有更高、更快的胰岛素分泌能力，在低糖刺激下已达到(33.88±4.05mU/L)，高糖作用下达到(105.65±7.43mU/L)，很大程度上提高了胰岛样细胞的胰岛素分泌能力，对葡萄糖刺激做出快速反应，达到快速降低血糖的功能。
[0016] 本发明的诱导方法与传统的多细胞因子联合诱导相比，可获得更多并且成熟的胰岛样细胞，显著提高诱导分化效率，同时已分化的胰岛样细胞存活时间长、增殖活性高，在葡萄糖刺激下能在较短的时间内作出快速反应，达到快速降糖作用。同时，本发明方法无需基因转染，避免基因改变和致瘤风险，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0017] 图1为胰岛样细胞的双硫腙染色图；
[0018] 图2为基因表达情况图；
[0019] 图3为胰岛素的分泌受外环境糖的调节结果图；
[0020] 图4为胰岛样细胞移植后分别在第3天、10天大鼠血糖水平图。
具体实施方式
[0021] 具体实施方式一：本实施方式的一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，它按照以下步骤进行：
[0022] 一、从脐带、胎盘或脂肪组织中分离获得间充质干细胞，并传代培养；
[0023] 二、分化培养基制备
[0024] 所述的分化培养基为脑组织条件培养基、细胞分化诱导液和干细胞条件培养基；
[0025] 所述的脑组织条件培养基制备过程如下：在无菌条件下，取出生6～7天大鼠的大脑，用PBS或盐水清洗后，1000rpm离心6min，弃上清，用10％FBS的DMEM高糖培养基重悬沉淀，将脑组织捣碎为单个细胞，收集脑组织细胞用10％FBS的DMEM高糖培养1d后，加入浓度为1～2μmol/L的阿糖胞苷培养，在培养的第5d收集培养液，即为BTCM；
[0026] 所述的细胞分化诱导液成分为：以DMEM/F12为基础培养基，内含2％FBS、80～100μg/L长春碱衍生物和2％B27；
[0027] 所述的干细胞条件培养基制备过程如下：用含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺的DMEM/F12培养基培养MSCs，3天后收集培养液即为SCM；
[0028] 三、将步骤一传代培养后的脐带、胎盘或脂肪组织间充质干细胞分化为胰岛样细胞，进行鉴定后，即完成所述的诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞。
[0029] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的将步骤一传代培养后的脐带、胎盘或脂肪组织间充质干细胞分化为胰岛样细胞具体过程如下：
[0030] 将步骤一传代培养至P3代的脐带、胎盘或脂肪组织的间充质干细胞以4×104个/mL接种量接种于6孔板中，以含10％FBS的DMEM/F12的培养基进行培养，培养24h后更换BTCM培养7天，每2日更换一次BTCM，培养7天后，再用细胞分化诱导液培养7天，每2日换一次诱导液，然后用细胞分化诱导液和SCM按体积比为1:1的比例联合共同培养14天，即获得成熟的胰岛样细胞。其它与具体实施方式一相同。
[0031] 具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的脐带间充质干细胞分离及传代培养过程如下：
[0032] 取足月胎儿脐带15～20cm，经过生理盐水和体积百分含量为75％酒精清洗后，剪成长度为2～3cm，分别将动脉和静脉剥离，将中间的华通氏胶分离出来，在无菌条件下剪成0.5～2mm3组织块，按照1g/T75瓶接种，采用10％FBS培养基进行培养，5d后进行换液，待细胞融合度达到80％以上后，通过体积百分浓度为0.125％的胰酶进行消化，获取单个细胞，按照8×105个细胞/T75瓶接种，采用10％FBS培养基进行培养，置于二氧化碳培养箱，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，同时对脐带MSCs的免疫标记检测，检测合格的留存，即完成所述的脐带间充质干细胞分离及传代培养。
[0033] 其它与具体实施方式一相同。
[0034] 本市实施方式所述的检测合格为：检测后发现均表达典型的MSCs表面抗原：CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原：CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31，符合干细胞的特性，即为检测合格。
[0035] 具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的胎盘间充质干细胞分离和传代培养过程如下：
[0036] 在无菌条件下，先用体积百分含量为75％酒精对胎盘采集袋进行消毒处理，随后生理盐水清洗胎盘2遍，剥离羊膜后，取胎盘绒毛层组织，加生理盐水清洗血渍，清洗后将绒毛层组织置于50mL洁净离心管内，剪成0.2～1mm3的组织块，加入3倍组织块体积的I型胶原酶，37℃摇床内消化30min，加入10mL无血清培养基终止消化，过滤于50mL洁净离心管内，1300r/min离心6分钟，弃上清，取沉淀，按照1×106个细胞/T75瓶接种，采用10％FBS培养基进行培养，置于二氧化碳培养箱，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，同时对胎盘MSCs的免疫标记检测，检测合格的留存，即完成所述的胎盘间充质干细胞分离和传代培养。
[0037] 其它与具体实施方式一相同。
[0038] 本市实施方式所述的检测合格为：检测后发现均表达典型的MSCs表面抗原：CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原：CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31，符合干细胞的特性，即为检测合格。
[0039] 具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的脂肪间充质干细胞分离和传代培养过程：
[0040] 在无菌条件下，先用体积百分含量为75％酒精处理脂肪采集瓶，随后生理盐水清洗脂肪2～3遍，转移脂肪组织至50mL离心管中，加入3倍组织块体积的I型胶原酶，37℃摇床内消化35min，加入约15mL无血清培养基终止消化，过滤至50mL离心管内，1300r/min离心6分钟，弃上清，取沉淀，按照1×106～1.5×106个细胞/T75瓶接种，采用10％FBS培养基进行培养，放置于二氧化碳培养箱，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，同时对脂肪MSCs的免疫标记检测，检测合格的留存，即完成所述的脂肪间充质干细胞分离和传代培养。
[0041] 其它与具体实施方式一相同。
[0042] 本市实施方式所述的检测合格为：检测后发现均表达典型的MSCs表面抗原：CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原：CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31，符合干细胞的特性，即为检测合格。
[0043] 本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
[0044] 通过以下实施例验证本发明的有益效果：
[0045] 实施例1：
[0046] 间充质干细胞的制备
[0047] 1.1脐带间充质干细胞的制备
[0048] 无菌条件下取足月胎儿脐带15～20cm，经过生理盐水和体积百分含量为75％酒精清洗后，剪成长度为2～3cm小段，分别将动脉和静脉剥离，将中间的华通氏胶分离出来，在无菌条件下解剖成0.5～2mm3小组织块，按照1g/T75瓶接种，采用10％FBS培养基进行培养，5d后进行换液，待细胞融合度达到80％以上后，通过体积百分浓度为0.125％的胰酶进行消化，获取单个细胞，按照8×105个细胞/T75瓶接种，采用10％FBS培养基进行培养，放置于二氧化碳培养箱，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，同时对脐带MSCs的免疫标记检测，发现它们均表达典型的MSCs表面抗原：CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原：CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31，符合干细胞的特性。
[0049] 1.2胎盘间充质干细胞的制备
[0050] 在无菌条件下，先用75％酒精对胎盘采集袋进行消毒处理，随后生理盐水清洗胎盘2遍，剥离羊膜后，取胎盘绒毛层组织，加生理盐水清洗血渍，清洗后将绒毛层组织置于3
50mL洁净离心管内，剪成0.2～1mm 大小组织块，加入3倍组织块体积的I型胶原酶，37℃摇床内消化30min，加入10mL无血清培养基终止消化，过滤于50mL洁净离心管内，1300r/min离心6分钟，弃上清，取沉淀，按照1×106个细胞/T75瓶接种，采用10％FBS培养基进行培养，置于二氧化碳培养箱，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，同时对胎盘MSCs的免疫标记检测，发现它们均表达典型的MSCs表面抗原：CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原：CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31，符合干细胞的特性。
50mL洁净离心管内，剪成0.2～1mm 大小组织块，加入3倍组织块体积的I型胶原酶，37℃摇床内消化30min，加入10mL无血清培养基终止消化，过滤于50mL洁净离心管内，1300r/min离心6分钟，弃上清，取沉淀，按照1×106个细胞/T75瓶接种，采用10％FBS培养基进行培养，置于二氧化碳培养箱，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，同时对胎盘MSCs的免疫标记检测，发现它们均表达典型的MSCs表面抗原：CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原：CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31，符合干细胞的特性。
[0051] 1.3脂肪间充质干细胞的制备
[0052] 在无菌条件下，先用75％酒精处理脂肪采集瓶，随后生理盐水清洗脂肪2～3遍，转移脂肪组织至50mL离心管中，加入3倍组织块体积的I型胶原酶，37℃摇床内消化35min，加入约15mL无血清培养基终止消化，过滤至50mL离心管内，1300r/min离心6分钟，弃上清，取沉淀，按照1×106～1.5×106个细胞/T75瓶接种，采用10％FBS培养基进行培养，放置于二氧化碳培养箱，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，同时对脂肪MSCs的免疫标记检测，发现它们均表达典型的MSCs表面抗原：CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原：CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31，符合干细胞的特性。
[0053] 实施例2：
[0054] 分化培养基制备
[0055] 2.1脑组织条件培养基(BTCM)制备
[0056] 在无菌条件下，取出生6～7天大鼠的大脑，用PBS或盐水清洗后1000rpm离心6min，弃上清，用10％FBS-DMEM重悬沉淀(脑组织)，将脑组织捣碎为单个细胞，收集脑组织细胞用10％FBS-DMEM培养，第二天加入2μmol/L的阿糖胞苷，在培养的第五天收集培养液即为BTCM。
[0057] 2.2细胞分化诱导液制备
[0058] 以DMEM/F12为基础培养基，内含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺、β细胞调节素、Conophylline100μg/L。
[0059] 2.3干细胞条件培养基(SCM)制备
[0060] 用含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺和2％B27的DMEM/F12培养基培养MSCs，3天后收集培养液即为SCM。
[0061] 实施例3：
[0062] 体外诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞
[0063] 3.1体外诱导分化为胰岛样细胞
[0064] 将P3代脐带、胎盘或脂肪来源的间充质干细胞以4×104个/ml接种于6孔板中，培养基为含10％FBS的DMEM/F12，24h后更换BTCM培养7天，每2日更换一次BTCM。细胞分化诱导液再培养7天，每2日换一次液，然后细胞分化诱导液和SCM联合共同培养14天，即可获得成熟的胰岛样细胞。
[0065] 3.2体外诱导胰岛样细胞的鉴定
[0066] (1)双硫腙染色鉴定
[0067] 对诱导后的胰岛样细胞进行双硫腙染色，移除细胞培养基，用PBS清洗2次，然后加入1mlPBS和50μl双硫腙工作液，37℃孵育20min，移出双硫腙染液，用PBS洗2次，在倒置显微镜下观察细胞着色情况并拍照记录。结果表明诱导后的细胞由间充质干细胞的长梭形变为圆形，细胞被染成砖红色，为阳性胰岛样细胞，结果见图1。
[0068] (2)RT-PCR特异性基因检测
[0069] 用Trizol试剂提取间充质干细胞和诱导后胰岛样细胞的总RNA，经RT-PCR检测人胰岛素(Insulin)和胰高血糖素(Glucagon)基因的表达，同时以β-actin基因为参照，引物见表1，RT-PCR结果见图2。
[0070] 表1：RT-PCR基因引物
[0071] 基因 上游引物 下游引物Insulin 5’-GCCTTTGTGAACCAACACCTG-3’ 5’-GTTGCAGTAGTTCTCCAGCTG-3’Glucagon 5’-AGGCAGACCCACTCAGTGA-3’ 5’-AACAATGGCGACCTCTTCTG-3’
β-actin 5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’ 5’-TAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’[0072] 结果显示，间充质干细胞和胰岛样细胞均表达内参基因，间充质干细胞不表达胰岛素和胰高血糖素基因，而诱导后产生的胰岛样细胞表达胰岛素和胰高血糖素基因，说明间充质干细胞已诱导分化为胰岛样细胞。
β-actin 5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’ 5’-TAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’[0072] 结果显示，间充质干细胞和胰岛样细胞均表达内参基因，间充质干细胞不表达胰岛素和胰高血糖素基因，而诱导后产生的胰岛样细胞表达胰岛素和胰高血糖素基因，说明间充质干细胞已诱导分化为胰岛样细胞。
[0073] (3)葡萄糖刺激胰岛素分泌实验
[0074] 实验分组：对照组为未诱导间充质干细胞；实验1组为诱导后胰岛样细胞在5.8mmol/L葡萄糖DMEM中培养；实验2组为诱导后胰岛样细胞在18.7mmol/L葡萄糖DMEM中培养。
[0075] 挑取约50个诱导后的细胞团(50～150μm)至1.5ml离心管中，PBS清洗2遍后加入1ml无糖DMEM预培养3～6h。然后以300μl含5.8mmol/L葡萄糖、25mmol/L葡萄糖的DMEM在37度下依次培养2h。收集上清液，用ELISA法检测上清中不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌量。结果显示对照组细胞上清中几乎检测不到胰岛素，而经诱导后的细胞团在5.8mmol/L葡萄糖刺激下胰岛素分泌量为(33.88±4.05mU/L)，经25mmol/L葡萄糖孵育2h后胰岛素分泌量为(105.65±7.43mU/L)，随着葡萄糖浓度的增加其胰岛素分泌量增加，差异极显著。由此可知，诱导后胰岛样细胞团对葡萄糖刺激敏感，其胰岛素的分泌受外环境糖的调节(见图
3)。
3)。
[0076] 实施例4：体内移植实验
[0077] 糖尿病大鼠造模，本研究采用SD大鼠，雌雄各半，体重250g左右，空腹12h(禁食不禁水)后尾静脉取血，血糖仪测血糖，空腹血糖>11.1mmol/L者剔除，排除造模前的高血糖。大鼠单次腹膜内注射溶于0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.5)的链脲佐菌素，剂量为50mg/kg。
糖尿病的诱导通过链脲霉素注射4天后血糖的评估来确认，血糖高于16.7mmol/L并出现多饮、多食、多尿的大鼠认为造模成功。选择糖尿病造模成功的大鼠随机分为三组，即正常组、糖尿病对照组和胰岛样细胞移植组。胰岛样细胞移植后分别在第3天、10天检测两组大鼠血糖水平，结果见表2和图4。
糖尿病的诱导通过链脲霉素注射4天后血糖的评估来确认，血糖高于16.7mmol/L并出现多饮、多食、多尿的大鼠认为造模成功。选择糖尿病造模成功的大鼠随机分为三组，即正常组、糖尿病对照组和胰岛样细胞移植组。胰岛样细胞移植后分别在第3天、10天检测两组大鼠血糖水平，结果见表2和图4。
[0078] 具体的实验动物分组如下：
[0079] 正常组：5只健康大鼠
[0080] 糖尿病对照组：接受链脲菌素诱导I型糖尿病的5只大鼠，不做任何处理；
[0081] 胰岛样细胞移植组：5只糖尿病大鼠接受胰岛样细胞移植(102-103细胞静脉注射一次)
[0082] 表2各组大鼠血糖水平(mmol/L)(差(x±s，％)
[0083]
[0084] 由表2和图4结果显示，糖尿病组大鼠血糖普遍较高，胰岛样细胞移植后大鼠血糖出现下降，并且差异显著。随着时间的延长，胰岛样细胞移植组血糖进一步降低，且差异显著，以上结果表明已分化的胰岛样细胞对糖尿病大鼠具有一定的降糖作用。