GBP1基因及其抑制剂在制备治疗肺鳞癌的药物中的应用

摘要

本发明公开了GBP1基因及其抑制剂在制备治疗肺鳞癌的药物中的应用。miR‑335‑3p可以明显下调肺鳞癌NCI‑H520细胞中GBP1基因的表达水平，双荧光素酶报告基因检测结果表明miR‑335‑3p可以直接调控GBP1基因。细胞增殖活力检测结果表明，miR‑335‑3p通过下调GBP1基因表达显著抑制肺鳞癌NCI‑H520细胞的体外增殖，miR‑335‑3p是GBP1基因表达的抑制剂。西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱对肺鳞癌NCI‑H520移植瘤的生长具有明显的抑制作用，西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱给药处理后的肿瘤组织中GBP1 mRNA和蛋白表达水平显著下调，表明GBP1基因的表达可以促进肺鳞癌的生长增殖，西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱通过下调GBP1基因的表达实现体内抑瘤作用。

权利要求

1.GBP1基因抑制剂在制备治疗肺鳞癌的药物中的应用，其特征在于：所述GBP1基因抑制剂为西贝母碱或轮环藤碱或黄杨碱。

说明书

GBP1基因及其抑制剂在制备治疗肺鳞癌的药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因治疗药物领域，具体涉及GBP1基因及其抑制剂在制备治疗肺鳞癌的药物中的应用。

背景技术

[0002] 肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，死亡率居恶性肿瘤之首。我国肺癌发病率呈现逐年上升趋势，年平均增长近2％。肺癌根据病理学特点的不同分为多种组织类型，肺癌组织类型不同，其治疗措施也不同。根据2004版WHO分类，常见肺癌组织病理学分型分为非小细胞癌(NSCLC)和小细胞癌(SCLC)。非小细胞癌又分为鳞状细胞癌(SCC)、腺癌(AC)和大细胞癌(LCC)。不同肺癌临床治疗方案不同，预后效果也不同。因此，为了提高治疗效果，肺癌的治疗策略已经从传统的以分期为基础的治疗模式转变为以组织学类型和基因突变为指导的个体化、精准的多学科治疗模式。个体化治疗提高了肺癌的治疗和预后效果。

[0003] 诊断的肺癌患者中约80％-85％为非小细胞肺癌，其中肺鳞癌约占20％-30％，属于一种常见的肺癌病理类型。肺鳞癌治疗除传统手术及放化疗外，靶向治疗成为其目前治疗的重要手段。随着表皮生长因子受体酪氨酸激酶受体抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)问世，给肺腺癌患者带来巨大获益后，肺腺癌的各种靶向药物也已相继进入临床，其治疗效果、生存期得到明显改善。相比肺腺癌，肺鳞癌的研究较滞后，仍无有效的靶向药物指导临床实践，原因可能是由于缺乏对其生物学特征的了解。随着对基因学的深入研究为认识肺鳞癌分子生物学特征提供了可能。在肺鳞癌发生发展过程中，相关分子靶点表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α(phosphoin-3-kinase catalytic alphapolypeptide,PIK3CA)、成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)、盘状结构域受体2(discoidin domain receptor 2,DDR2)、第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)、BRAF、MET、胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1receptor,IGF-1R)等发挥着重要作用。

[0004] GBP1(guanylate-bindingprotein 1)是一类由593个氨基酸组成的单体发动蛋白，隶属于干扰素诱导的GTPase超家族。正常人类皮肤组织中不存在GBP1的表达，但当皮肤受到炎症的侵袭GBP1的表达明显增高，并抑制炎症性疾病的加剧，GBP1可能是潜在的炎症预警信号。在内皮细胞中，GBP1可被IFN-γ、IFN-α、IFN-β、TNF-α、ILs等炎症因子强烈诱导，并抑制炎症性疾病中内皮细胞増殖、侵袭。近年来，GBP1的抗肿瘤作用成为关注的热点，多个体内外实验已经证实GBP1可以抑制结肠癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤的形成和发展。

[0005] 申请人前期研究中发现，与正常肺组织相比，肺鳞癌病理组织中GBP1基因表达显著升高，但截至目前尚未有研究证实GBP1与肺鳞癌之间的关系。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供GBP1基因及其抑制剂在制备治疗肺鳞癌的药物中的应用。

[0007] 上述目的是通过如下技术方案实现的：

[0008] GBP1基因作为药物靶标在筛选制备治疗肺鳞癌的药物中的应用。

[0009] GBP1基因的抑制剂在制备治疗肺鳞癌的药物中的应用。

[0010] 优选地，所述抑制剂选自siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、cDNA或其表达载体，或选自小分子化合物。

[0011] 优选地，所述抑制剂为包含有miR-335-3p基因片段的表达载体。

[0012] 优选地，所述小分子化合物为西贝母碱。

[0013] 优选地，所述小分子化合物为轮环藤碱。

[0014] 优选地，所述小分子化合物为黄杨碱。

[0015] 一种用于治疗肺腺癌的药物，含有上述抑制剂。

[0016] 本发明的有益效果：

[0017] 本发明发现miR-335-3p可以明显下调肺鳞癌NCI-H520细胞中GBP1基因的表达水平，双荧光素酶报告基因检测结果表明miR-335-3p可以直接调控GBP1基因。细胞增殖活力检测结果表明，miR-335-3p通过下调GBP1基因表达显著抑制肺鳞癌NCI-H520细胞的体外增殖，miR-335-3p是GBP1基因表达的抑制剂。西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱对肺鳞癌NCI-H520移植瘤的生长具有明显的抑制作用，西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱给药处理后的肿瘤组织中GBP1 mRNA和蛋白表达水平显著下调，表明GBP1基因的表达可以促进肺鳞癌的生长增殖，西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱通过下调GBP1基因的表达实现体内抑瘤作用。

附图说明

[0018] 图1为转染后各组miR-335-3p表达量变化及各组GBP1 mRNA和蛋白表达水平变化；

[0019] 图2为各转染组肺腺癌NCI-H520细胞增殖活力比较。

具体实施方式

[0020] 下面结合具体实施例和附图详细介绍本发明的技术方案和技术效果。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知。

[0021] 实施例1 miR-335-3p靶向下调GBP1基因表达

[0022] 一、实验材料

[0023] miR-335-3p模拟物miR-335-3p mimics、阻遏物miR-335-3p inhibitor、miR-335-3p模拟物阴性对照miR-335-3p mimics negative control和阻遏物阴性对照miR-335-3p inhibitor negative control购自广州市锐博生物科技有限公司。

[0024] PCR引物委托广州市锐博生物科技有限公司设计合成。

[0025] TRIzol试剂和转染试剂Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司。

[0026] 肺鳞癌NCI-H520细胞株为本公司长期冻存，用于转染质粒载体的Hela细胞株购于中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。RPMI1640培养基和胎牛血清购于Gibco公司。肺鳞癌NCI-H520细胞株和Hela细胞株用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基按常规方法培养。

[0027] BCA蛋白浓度测定试剂盒购自西安赫特生物技术有限公司。

[0028] GBP1一抗购于Abnova公司，β-actin一抗购于Abcam公司，HRP标记的二抗购于北京中杉金桥生物科技有限公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Promega公司。CCK-8试剂盒购于南京凯基生物有限公司。miRcute miRNA提取分离试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，RNeasy Mini Kit总RNA提取试剂盒购自杭州沃森生物技术有限公司，RNA逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，Real-time PCR试剂盒购自TaKaRa公司。

[0029] 二、实验方法

[0030] 1、细胞培养及转染

[0031] 肺鳞癌NCI-H520细胞株用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基按常规方法培养。将NCI-H520细胞分为5组，即miR-335-3p模拟物转染组、阻遏物转染组、模拟物阴性对照转染组、阻遏物阴性对照转染组和只加转染试剂的空白对照组。转染在六孔细胞培养板内、待细胞结合度约60％-70％时进行，每孔板加入25pmol的模拟物或阻遏物或阴性对照和10μL的转染试剂，使模拟物或阻遏物或阴性对照的终浓度为10pmol/mL，转染后5h换液。

[0032] 转染过程严格按照转染试剂Lipofectamine 2000的操作说明进行。

[0033] 2、RT-PCR法检测miR-335-3p表达水平

[0034] 在转染后48h收获细胞，按照miRcute miRNA提取分离试剂盒所提供的步骤提取miRNA。用紫外分光光度仪测定所提取RNA的浓度及纯度，之后按照TaKaRa逆转录试剂盒所提供的步骤将其逆转录为cDNA，反应条件：25℃×30min，42℃×30min，85℃×5min。以cDNA为模板，按照TaKaRa RT-PCR试剂盒提供的步骤加入相关试剂及miR-335-3p引物，以U6为内参，在ABI-7300实时荧光定量仪上进行PCR扩增。反应条件：95℃×3min，(95℃×12s，62℃×40s)×40循环。实验结果采用2-ΔΔCt法进行表达量相对定量分析。

[0035] miR-335-3p序列：5'-UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC-3'

[0036] m i R - 3 3 5 - 3 p 逆 转 录 引 物 ： 5 ' -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGGTCAGGA-3'

[0037] miR-335-3p RT-PCR上游引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTTTTTCATTATTGCTCC-3'[0038] miR-335-3p RT-PCR下游引物：5'-CGCCGCAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'

[0039] 3、RT-PCR法检测GBP1 mRNA表达水平

[0040] 在转染后48h收获细胞，采用Trizol法提取总RNA，用紫外分光光度仪测定所提取RNA的浓度及纯度，结果浓度均在300ng/μL以上，OD260/OD280比值均在1.8左右。按照TaKaRa逆转录试剂盒所提供的步骤将其逆转录为cDNA，反应条件：25℃×30min，42℃×30min，85℃×5min。以cDNA为模板，按照TaKaRa RT-PCR试剂盒提供的步骤加入相关试剂及引物，以GAPDH为内参，在ABI-7300实时荧光定量仪上进行PCR扩增。反应条件：95℃×3min，-ΔΔCt
(95℃×12s，62℃×40s)×40循环。实验结果采用2 法进行表达量相对定量分析。

[0041] RT-PCR引物序列设计如下：

[0042] GBP1 RT-PCR上游引物：5'-TGGAACGTGTGAAAGCTGAG-3'；

[0043] GBP1 RT-PCR下游引物：5'-TGACAGGAAGGTCTGGTCT-3'

[0044] GAPDH RT-PCR上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'；

[0045] GAPDH RT-PCR下游引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'

[0046] 4、Western blot法检测GBP1蛋白表达水平

[0047] 在转染后48h收获细胞，以β-actin为内参，步骤如下：用裂解液裂解各组细胞，匀浆后离心取上清，采用BCA试剂盒测蛋白含量。按50μg蛋白上样行SDS-PAGE电泳。湿转印法将蛋白质转印至PVDF膜；50g/L脱脂奶粉溶液室温封闭2h，加入GBP1一抗稀释液和β-actin一抗稀释液，室温摇床轻摇过夜；TBST洗膜，加入HRP标记的二抗，室温摇床轻摇1.5h；TBST充分漂洗，加入ECL显色液，自动凝胶分析仪照相，以相应蛋白条带灰度值除以内参β-actin灰度值校正得到相应蛋白的相对表达量。

[0048] 5、双荧光素酶报告基因检测

[0049] 克隆扩增GBP1基因的3'UTR区全长，将引物重组到psiCHECK-2质粒，生物信息学预测miR-335-3p与GBP1基因的靶结合位点，并针对该点进行定点突变，表达海肾荧光素酶的pRL-TK质粒用来作为内参照调整细胞数量和转染效率的差异，miR-335-3p模拟物及其阴性对照和miR-335-3p阻遏物及其阴性对照分别和火萤荧光素酶报告载体共转染进Hela细胞，双荧光素酶活性检测按试剂盒说明书操作。该部分实验外包给江苏凯基生物科技有限公司。

[0050] 6、细胞增殖活力检测

[0051] 采用CCK-8方法检测转染细胞的增殖活力，分别在转染1d-6d内检测。细胞接种在96孔板内，每孔内加入5000个细胞、100μL培养液和10μL检测试剂。于添加CCK-8试剂2h后上酶标仪在450nm处检测各孔OD值，每组重复4次。

[0052] 相对增殖活力(％)＝转染组OD值/空白对照组OD值×100％。

[0053] 三、实验结果

[0054] 1、转染后各组miR-335-3p表达水平比较

[0055] 与空白对照组比，miR-335-3p模拟物转染组细胞miR-335-3p表达水平显著上调(P＜0.05)，miR-335-3p阻遏物转染组细胞miR-335-3p表达水平显著下调(P＜0.05)，模拟物阴性对照转染组和阻遏物阴性对照转染组细胞miR-335-3p表达水平无显著变化(P＞0.05)。

[0056] 结果如表1和图1所示。

[0057] 表1转染后各组miR-335-3p表达水平比较

[0058]

[0059] 2、转染后各组GBP1 mRNA表达水平比较

[0060] 与空白对照组比，miR-335-3p模拟物转染组细胞GBP1 mRNA表达水平显著下调(P＜0.05)，miR-335-3p阻遏物转染组细胞GBP1 mRNA表达水平显著上调(P＜0.05)，模拟物阴性对照转染组和阻遏物阴性对照转染组细胞GBP1 mRNA表达水平无显著变化(P＞0.05)。

[0061] 结果如表2和图1所示。

[0062] 表2转染后各组GBP1 mRNA表达水平比较

[0063]

[0064] 3、转染后各组GBP1蛋白表达水平比较

[0065] 与空白对照组比，miR-335-3p模拟物转染组细胞GBP1蛋白表达水平显著下调(P＜0.05)，miR-335-3p阻遏物转染组细胞GBP1蛋白表达水平显著上调(P＜0.05)，模拟物阴性对照转染组和阻遏物阴性对照转染组细胞GBP1蛋白表达水平无显著变化(P＞0.05)。结果如图1。

[0066] 4、双荧光素酶报告基因检测结果

[0067] 对miR-335-3p和GBP1的野生型结合位点进行定点突变。miR-335-3p模拟物和野生型GBP1共转染组的Hela细胞荧光素酶活性下降55％，而突变型转染组中荧光素酶活性无明显变化，同时在miR-335-3p阻遏物和阴性对照组中也未观察到有荧光素酶活性的改变。上述结果表明miR-335-3p可以直接调控GBP1基因。

[0068] 5、细胞增殖活力检测结果

[0069] 与空白对照组比，miR-335-3p模拟物转染组细胞增殖缓慢，miR-335-3p阻遏物转染组细胞增殖活力增强，模拟物阴性对照转染组和阻遏物阴性对照转染组细胞增殖活力无显著变化。

[0070] 结果如图2所示。

[0071] 上述结果表明，miR-335-3p可以明显下调肺鳞癌NCI-H520细胞中GBP1基因的表达水平，双荧光素酶报告基因检测结果表明miR-335-3p可以直接调控GBP1基因。细胞增殖活力检测结果表明，miR-335-3p通过下调GBP1基因表达显著抑制肺鳞癌NCI-H520细胞的体外增殖，miR-335-3p是GBP1基因表达的抑制剂。

[0072] 实施例2靶向下调GBP1基因表达的小分子化合物的发现

[0073] 一、实验材料

[0074] 西贝母碱(CAS编号：61825-98-7)、轮环藤碱(CAS编号：518-94-5)和黄杨碱(CAS编号：860-79-7)为本公司标准品库中储存的化合物。将西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱分别用二甲基亚砜溶解配成浓度为1mg/mL的母液，使用时用培养基稀释至所需浓度。

[0075] 其他实验材料同实施例1。

[0076] 二、实验方法

[0077] 1、细胞培养及化合物给药处理

[0078] 肺鳞癌NCI-H520细胞株用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基按常规方法培养。将NCI-H520细胞分为7组，即西贝母碱低剂量组和高剂量组、轮环藤碱低剂量组和高剂量组、黄杨碱低剂量组和高剂量组和只加等量溶剂的空白对照组。取对数生长期的细胞，传到
24孔板中，贴壁培养过夜。吸去培养基，加入含药培养基继续培养24h，其中，低剂量组含药培养基中药物浓度为5μM，高剂量组含药培养基中药物浓度为10μM。

[0079] 2、RT-PCR法检测GBP1 mRNA表达水平

[0080] 给药培养24h收获细胞，采用Trizol法提取总RNA，用紫外分光光度仪测定所提取RNA的浓度及纯度，结果浓度均在300ng/μL以上，OD260/OD280比值均在1.8左右。按照TaKaRa逆转录试剂盒所提供的步骤将其逆转录为cDNA，反应条件：25℃×30min，42℃×30min，85℃×5min。以cDNA为模板，按照TaKaRa RT-PCR试剂盒提供的步骤加入相关试剂及引物，以GAPDH为内参，在ABI-7300实时荧光定量仪上进行PCR扩增。反应条件：95℃×3min，(95℃×12s，62℃×40s)×40循环。实验结果采用2-ΔΔCt法进行表达量相对定量分析。

[0081] RT-PCR引物序列设计如下：

[0082] GBP1 RT-PCR上游引物：5'-TGGAACGTGTGAAAGCTGAG-3'；

[0083] GBP1 RT-PCR下游引物：5'-TGACAGGAAGGTCTGGTCT-3'

[0084] GAPDH RT-PCR上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'；

[0085] GAPDH RT-PCR下游引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'

[0086] 3、Western blot法检测GBP1蛋白表达水平

[0087] 给药培养24h收获细胞，以β-actin为内参，步骤如下：用裂解液裂解各组细胞，匀浆后离心取上清，采用BCA试剂盒测蛋白含量。按50μg蛋白上样行SDS-PAGE电泳。湿转印法将蛋白质转印至PVDF膜；50g/L脱脂奶粉溶液室温封闭2h，加入GBP1一抗稀释液和β-actin一抗稀释液，室温摇床轻摇过夜；TBST洗膜，加入HRP标记的二抗，室温摇床轻摇1.5h；TBST充分漂洗，加入ECL显色液，自动凝胶分析仪照相，以相应蛋白条带灰度值除以内参β-actin灰度值校正得到相应蛋白的相对表达量。

[0088] 4、细胞增殖活力检测

[0089] 给药培养24h收获细胞，采用CCK-8方法检测各组细胞的增殖活力。细胞接种在96孔板内，每孔内加入5000个细胞、100μL培养液和10μL检测试剂。于添加CCK-8试剂2h后上酶标仪在450nm处检测各孔OD值，每组重复4次。

[0090] 相对增殖活力(％)＝给药组OD值/空白对照组OD值×100％。

[0091] 三、实验结果

[0092] 1、给药处理后各组GBP1 mRNA表达水平比较

[0093] 与空白对照组比，各药物低剂量和高剂量组细胞GBP1 mRNA表达水平显著下调(P＜0.05)，且呈一定的浓度依赖关系。结果如表3所示。

[0094] 表3给药处理后各组GBP1 mRNA表达水平比较

[0095]

[0096] 2、给药处理后各组GBP1蛋白表达水平比较

[0097] 与空白对照组比，各药物低剂量和高剂量组细胞GBP1蛋白表达水平显著下调(P＜0.05)，且呈一定的浓度依赖关系。结果如表4所示。

[0098] 表4给药处理后各组GBP1蛋白表达水平比较

[0099]

[0100] 3、细胞增殖活力检测结果

[0101] 与空白对照组比，各药物低剂量和高剂量组细胞增殖活力显著降低，且呈一定的浓度依赖关系。结果如表5所示。

[0102] 表5西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱处理对肺腺癌NCI-H520细胞增殖活力的影响[0103]

[0104] 上述结果表明，西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱可以明显下调肺鳞癌NCI-H520细胞中GBP1基因的表达水平。细胞增殖活力检测结果表明，西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱通过下调GBP1基因表达显著抑制肺鳞癌NCI-H520细胞的体外增殖，西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱是GBP1基因表达的有效抑制剂。

[0105] 实施例3靶向下调GBP1基因表达的小分子化合物对肺鳞癌的体内抑瘤作用[0106] 一、实验材料

[0107] SPF级BALB/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，7周龄，体重19.5～22.5g。所有小鼠置于温度(22±2)℃、湿度(60±5)℃、12h明暗交替环境中饲养。

[0108] 二、实验方法

[0109] 1、动物模型的建立、分组和给药

[0110] 取对数生长期肺鳞癌NCI-H520细胞用0.25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，台盼蓝拒染法记数活细胞数占95％以上，将细胞密度调至1×107/ml，每只裸鼠取0.2ml细胞悬液接种于右大腿背侧皮下，术前测量体重。接种后每日观察，待出现肉眼可见移植瘤后，用游标卡尺测量移植瘤，待移植瘤体积达100mm3左右将裸鼠按瘤体积和荷瘤鼠体重均衡原则随机分为空白对照组、西贝母碱组、轮环藤碱组和黄杨碱组，空白对照组给予等体积生理盐水，给药组给药剂量为10mg/kg/d，经皮下注射给药，隔天一次，连续十次。药物处理结束后一天，颈椎脱臼法处死裸鼠，照相，观察记录裸鼠包块形态大小，将肿块剥出、称重，-80℃冷藏备用。

[0111] 抑瘤率的测定：

[0112] 用游标卡尺测量肿瘤的最大纵径(a)及最大横径(b)1次，肿瘤体积＝0.5×a×b2，按照如下公式计算各化合物的体内抑瘤率：

[0113] 抑瘤率(％)＝(对照组肿瘤体积-给药组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100％。

[0114] 2、RT-PCR法检测肿瘤组织中GBP1 mRNA表达水平

[0115] 液氮磨组织提取RNA，取100mg组织加入1mL Trizol，提取总RNA。紫外分光光度计测定A260及A280，分析RNA纯度并调整浓度。按照TaKaRa逆转录试剂盒所提供的步骤将其逆转录为cDNA，反应条件：25℃×30min，42℃×30min，85℃×5min。以cDNA为模板，按照TaKaRaRT-PCR试剂盒提供的步骤加入相关试剂及引物，以GAPDH为内参，在ABI-7300实时荧光定量仪上进行PCR扩增。反应条件：95℃×3min，(95℃×12s，62℃×40s)×40循环。实验结果采用2-ΔΔCt法进行表达量相对定量分析。

[0116] RT-PCR引物序列设计如下：

[0117] GBP1 RT-PCR上游引物：5'-TGGAACGTGTGAAAGCTGAG-3'；

[0118] GBP1 RT-PCR下游引物：5'-TGACAGGAAGGTCTGGTCT-3'

[0119] GAPDH RT-PCR上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'；

[0120] GAPDH RT-PCR下游引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'

[0121] 3、Western blot法检测肿瘤组织中GBP1蛋白表达水平

[0122] 液氮磨组织提取蛋白质，取100mg组织加入0.75mL细胞裂解液，提取总蛋白。运用BCA法测定蛋白量。每例取50μg，上样行SDS-PAGE电泳。湿转印法将蛋白质转印至PVDF膜；50g/L脱脂奶粉溶液室温封闭2h，加入GBP1一抗稀释液和β-actin一抗稀释液，室温摇床轻摇过夜；TBST洗膜，加入HRP标记的二抗，室温摇床轻摇1.5h；TBST充分漂洗，加入ECL显色液，自动凝胶分析仪照相，以相应蛋白条带灰度值除以内参β-actin灰度值校正得到相应蛋白的相对表达量。

[0123] 三、实验结果

[0124] 1、各化合物对肿瘤生长的影响

[0125] 与空白对照组相比，西贝母碱组、轮环藤碱组和黄杨碱组肿瘤体积明显较小，表明西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱具有体内抑瘤作用，各组抑瘤率如表6所示。

[0126] 表6各化合物对肿瘤生长的影响

[0127]

[0128] 2、各化合物对肿瘤组织中GBP1 mRNA和蛋白表达水平影响

[0129] 与空白对照组相比，西贝母碱组、轮环藤碱组和黄杨碱组肿瘤组织中GBP1 mRNA和蛋白表达水平显著下调(P＜0.05)。结果如表7所示。

[0130] 表7各化合物对肿瘤组织中GBP1 mRNA和蛋白表达水平影响

[0131]

[0132] 上述结果表明，西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱对肺鳞癌NCI-H520移植瘤的生长具有明显的抑制作用，西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱给药处理后的肿瘤组织中GBP1 mRNA和蛋白表达水平显著下调，表明GBP1基因的表达可以促进肺鳞癌的生长增殖，西贝母碱、轮环藤碱和黄杨碱通过下调GBP1基因的表达实现体内抑瘤作用。