2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮化合物及应用

摘要

本发明公开了一种含噻唑杂环类化合物，该化合物是2‑(4‑三氟甲基苯亚胺基)‑5‑(2‑萘基亚甲基)噻唑烷‑4‑酮，简称TNTO，其化学结构如通式(I)所示。本发明还公开了所述化合物作为芳香烃受体激动剂的应用。实验证实，本发明的含噻唑杂环类化合物在10μM的浓度下能显著上调小鼠肝癌细胞中芳香烃受体下游靶基因的相关外源物质代谢酶CYP1A1的基因、蛋白表达，提示该化合物为芳香烃受体的激动剂，有望成为潜在的以芳香烃受体为治疗肿瘤靶点的药物，具有广泛的临床应用前景和经济开发价值。

权利要求

1.2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮在制备芳香烃受体激动剂的药物中应用，其中所述2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮简称TNTO，其化学结构如通式(I)所示：

说明书

2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮化

合物及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种含噻唑杂环类化合物及其应用，尤其涉及一种2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮化合物及其作为芳香烃受体激动剂的应用；属医药化学领域。

背景技术

[0002] 芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)是碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)超亚家族bHLH-PAS(Bhlh-PER-ARNT-SIM)成员之一，是该家族中唯一可以被配体激活的受体。进化分析显示AhR基因在哺乳动物、两栖动物、爬行动物和鸟类中都有存在。在人体的肝、肺、肾、胎盘、扁桃体、B淋巴细胞等各种组织和细胞中也都有存在。AhR作为一种配体激活转录因子，主要调控细胞色素P-450酶系家族Ⅰ相(CYP1)和一些Ⅱ相代谢酶的表达，参与一些药物和毒物的代谢过程。同时，AhR还具有许多内源性功能，如调控细胞周期、免疫应答、细胞分化和昼夜节律等。

[0003] 有研究表明芳香烃受体可以通过参与细胞增殖与凋亡、免疫代谢等过程，影响肿瘤的生长、生活、迁移和侵袭。AhR对肿瘤的调控具有双重作用，在多环芳烃、卤代芳烃等配体作用下，AhR可促进肿瘤生成；但苯并噻唑、氨基黄酮等化合物激活AhR后，可发挥抑癌功能，因此以芳香烃受体为作用靶点，寻找含有活性氮类的化合物不失为一种寻找抗肿瘤药物的手段。

[0004] 针对上述内容，要寻找以芳香烃受体为治疗肿瘤靶点的化合物，首先需要确定该化合物是否为芳香烃受体的激动剂。通过激活芳香烃受体的信号通路，可以激活下游靶基因(如CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1)的相关外源物质代谢酶，可以促进对外源性毒物的代谢，从而保护机体不受外源物质影响。同时间接干预与芳香烃受体相关抗肿瘤信号通路，防止肿瘤的发生。由于芳香烃受体具有一个较为宽松的配体结合口袋，多种内源性和外源性的化合物都被确定为芳香烃受体的配体。确定一个化合物是否为芳香烃受体的激动剂，其方法主要通过检测其通过信号通路对下游相关基因(CYP1A1、CYP1B1等)和相关蛋白表达水平(CYP1A1、CYP1B1等)的上调来进行确定。但经权威机构检索查新发现：有关2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮化合物及其作为芳香烃受体激动剂的应用目前国内外尚未见报导。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型含噻唑杂环类化合物即2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮化合物及其作为芳香烃受体激动剂的应用。

[0006] 本发明所述含噻唑杂环类化合物，其特征在于：该化合物是2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮，简称TNTO(2-(4-trifluoromethyl-phenylimino)-5-(2-naphthyl)methylene-thiazolidin-4-one)，其化学结构如通式(I)所示：

[0007]

[0008] 上述式(I)化合物的制备方法，是由4-三氟甲基苯胺为起始原料，通过与硫氰酸铵反应生成取代苯硫脲，再经过与乙酸乙酯的关环反应，形成噻唑杂环，最后与取代苯甲醛发生缩合反应得到最终产物，其具体合成步骤见实施例1。

[0009] 本发明所述含噻唑杂环类化合物作为芳香烃受体激动剂的应用，其中所述化合物优选是2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮。

[0010] 实验证实：上述2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮，即TNTO化合物在激活芳香烃受体方面具有明显作用，此为新型肿瘤治疗药物的开发提供了美好的前景。

[0011] 为了更好的理解本发明的实质及本发明所述化合物的作用，下面结合TNTO化合物的实验及结果，来进一步阐述其在激活芳香烃受体中的作用。

[0012] HepaWT细胞的制备：以常规方法培养HepaWT细胞，收集生长状态良好的且处于对数期的细胞，备用。

[0013] 1.10μM的TNTO化合物作用于HepaWT细胞24小时后，实时荧光定量PCR(RT-PCR)分析CYP1A1的表达(图1)。显示2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮化合物引起CYP1A1基因表达量上调。

[0014] 2.10μM的TNTO化合物作用于HepaWT细胞24小时后，蛋白质印迹法(Western Blot)分析CYP1A1蛋白的表达(图2)。显示2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮化合物引起CYP1A1蛋白表达量上调。

[0015] 通过上述实验及其结果，可以得到以下结论：

[0016] 本发明所述的化合物2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮能显著引起CYP1A1相关基因和蛋白的表达上调，激活芳香烃受体信号通路。提示这种含有活性氮类的芳香烃受体激动剂对寻找以芳香烃受体为靶点的抗肿瘤药物具有重要意义。

[0017] 本发明公开的新型含噻唑杂环类化合物即2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮化合物及其作为芳香烃受体激动剂的应用预示该化合物有望成为以芳香烃受体为靶点的治疗肿瘤的有潜力药物，具有很大的开发应用前景。

附图说明

[0018] 图1为HepaWT细胞中TNTO(10μM)对CYP1A1基因表达的影响。

[0019] 其中，DMSO(0.1％)为阳性对照，TCDD(1nM)为阴性对照，TNTO(10μM)化合物。

[0020] 图2为HepaWT细胞中TNTO(10μM)对CYP1A1蛋白表达的影响。

[0021] 其中，DMSO(0.1％)为阳性对照，TCDD(1nM)为阴性对照，TNTO(10μM)化合物。

具体实施方式

[0022] 实施例1：2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮的制备[0023] 按HCl:H2O(1:4)的比例配成盐酸溶液。称取11.4g(150mmol)硫氰酸铵溶于50mL盐酸溶液中，加入12.4mL(100mmol)4-三氟甲基苯胺,搅拌条件下加热到85℃，混合物变澄清，反应12小时候后，TLC监测反应，反应结束后，将混合物冷却到室温，有黏稠的油状液体出现，用乙酸乙酯萃取，萃取液用10％盐酸溶液，氯化钠饱和溶液，水依次洗涤，萃取液减压蒸除溶剂，得到4-三氟甲基苯硫脲。

[0024] 将4-三氟甲基苯硫脲0.906mL(6.0mmol)，无水乙酸钠2479mg(30mmol)，加入到20mL乙醇中,搅拌条件下，加入氯代乙酸乙酯1.28mL(12mmol)，然后在60℃下加热6个小时，TLC检测反应,反应结束后冷却到室温，出现沉淀。将反应液过滤,固体用乙醇洗涤，得到部分粗产物，滤液减压蒸馏，然后用乙酸乙酯和水萃取，有机相合并得到更多的粗产物。粗产物在乙酸乙酯中重结晶，得到产物2-(4-三氟甲基苯基)氨基-1,3-噻唑-4-酮。

[0025] 称取2-(4-三氟甲基苯基)氨基-1,3-噻唑-4-酮130.1mg(0.5mmol)溶于3mL乙醇中，加入2-萘甲醛81.2mg(0.6mmol)，哌啶100μL，在平行合成仪上，60℃恒温振荡，反应24小时。反应通过TLC监测，反应完毕后冷却到室温，在反应过程中有大量沉淀生成，经过分析表征，沉淀即为产物2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮。过滤，用乙酸乙酯，乙醇，石油醚依次进行洗涤，若没有沉淀生成，将溶剂蒸干，按1：2配比加入乙醇(乙酸乙酯)或者石油醚，振荡，则大部分出现沉淀，过滤，滤渣用大量乙酸乙酯，乙醇，石油醚依次进行洗涤。仍旧没有沉淀产生的通过硅胶柱层析进行分离，展开液由不同比例的乙酸乙酯和石油醚组成。

[0026] 产物为黄色粉末，收率30％。

[0027] 1HNMR(400MHz,DMSO)：δ(ppm)＝8.55(s,1H),8.00～7.90(m,3H),7.82(s,1H),7.70(s,1H),7.66～7.62(d,2H),7.58～7.55(m,1H),7.50～7.43(m,2H),7.30～7.26(d,
2H)；ESI-MS,C21H13F3N2OS,m/z 399.7(M+1)。

[0028] 上述2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮的合成路线如下：

[0029]

[0030] 实施例2：2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮化合物引起CYP1A1基因表达量上调验证

[0031] 1.将HepaWT细胞以1×105mL-1的密度接种至直径60mm的细胞培养皿中。24h后，将此细胞分别与2-(4-三氟甲基苯胺基)-5-(2-萘基亚甲基)-1,3-噻唑-4-酮(10μM)、DMSO(0.1％,阴性对照)、TCDD(1nM,阳性对照)在37℃含5％CO2的条件下作用24h。

[0032] 2.RNA的提取：收集细胞，弃掉培养基，用预热的PBS溶液冲洗2遍。加入适量的裂解液裂解细胞，用移液器缓慢地吹打几次。将裂解物转移到放在2mL收集管中的离心柱内13000rpm离心1分钟。弃下清，将离心柱放入新2mL收集管内。

[0033] 向离心柱内加入700μL Wash Buffer 1(已加无水乙醇)，13000rpm离心1分钟。弃下清，向离心柱内加入600μL Wash Buffer 2(已加无水乙醇)，13000rpm离心1分钟。弃下清，向离心柱内加入250μL Wash Buffer 2(已加无水乙醇)，13000rpm离心2分钟。

[0034] 洗脱：将离心柱放入新的1.5mL离心管内，取50-100μL无核酸酶的水滴加到离心柱的膜中央，13000rpm离心1分钟，获得样品的总RNA溶液，做好标记后冰浴待用或-70℃长期保存。

[0035] 3.RNA的纯化

[0036] DNAse I消化RNA样品，去除可能含有的基因组DNA。用无RNA酶的水将经过DNAse I消化的RNA样品(RNA≤45μg)的体积调整为200μL。随后加700μL buffer RLT，充分混匀。加500μL无水乙醇，用移液器轻轻吸打数次混匀后，取700μL得到的溶液过柱，轻轻盖上管盖，室温10,000rpm离心15秒，去除收集管中的液体。重复，将剩余样品过柱，每次所加的样品体积≤700μL。将柱子转移到新的2mL收集管后，加500μL Buffer RPE洗柱子，轻轻盖上管盖，室温10,000rpm离心15秒，去除收集管中的液体，将柱子放回收集管中。加500μL 80％乙醇到柱子中，轻轻盖上管盖，室温10,000rpm离心2分钟，将收集管及液体丢弃。将柱子转移到一新的2mL收集管，打开柱子的盖子，最大转速离心5分钟，将收集管及液体丢弃。洗脱，将柱子转移到一新的1.5mL收集管，取14μL无RNA酶的水悬空加到柱子的膜中央，轻轻盖上盖子，最大转速离心1分钟洗脱RNA。

[0037] 4.测定总RNA的浓度并评价其提取质量。

[0038] 使用仪器NanoDrop 2000C前用无核酸酶的水调零，测定RNA的浓度及其在260nm和280nm处的紫外吸收。RNA提取质量参考A260/A280的比值，适宜比值范围为1.8至2.1。

[0039] 5.cDNA的合成

[0040] 将总RNA浓度调平后，使用第一链cDNA合成试剂盒将总RNA逆转录成cDNA：

[0041] a.将无菌无核酸酶的PCR管置于冰上，将下述反应物依次加入：

[0042]

[0043] b.将上述混合物放入PCR仪中，65℃孵育5分钟，4℃孵育10分钟，期间配制并加入：

[0044]

[0045] c.混合，短暂离心。放入PCR仪中，25℃孵育5分钟，42℃孵育60分钟，70℃孵育5分钟终止反应。做好标记后冰浴待用或-30℃长期保存。

[0046] 6.qPCR分析

[0047] 引物：CYP1A1 5’-TCTCGTGGAGCCTCATGTACCT-3’(正向引物)

[0048] 5’-TGCCGATCTCTGCCAATCA-3’(反向引物)

[0049] β-actin 5’-GACGGCCAGGTCATCACTATTG-3’(正向引物)

[0050] 5’-AGGAAGGCTGGAAAAGAGCC-3’(反向引物)

[0051] a.按下表配制PCR反应混合液(反应液配制可在室温进行)，

[0052]

[0053] b.qPCR时，取10μL RT-PCR产物加260μL H2O配成270μL cDNA工作液，按上表配PCR反应混合液：二步法配制，对于10μL体系，若有M个样品，先将Mix 5μL×(6M+10)与一对primers 0.25μL×(6M+10)预混合(一般每个样品设5-6个技术重复)，分装到5mL离心管，用电子枪依次将下述液体加入反应管中(Mix+primers)5.5μL+(cDNA工作液)4.5μL。

[0054] c.贴好封膜，短暂离心60s。

[0055] 结果见图1，显示2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮化合物引起CYP1A1基因表达量上调。

[0056] 实施例3：2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮化合物引起CYP1A1蛋白表达量上调验证

[0057] 1.将HepaWT细胞以1×105mL-1的密度接种至直径60mm的细胞培养皿中。24h后，将此细胞分别与2-(4-三氟甲基苯胺基)-5-(2-萘基亚甲基)-1,3-噻唑烷-4-酮(10μM)、DMSO(5％，阴性对照)、TCDD(1nM,阳性对照)在37℃含5％CO2的条件下作用24h。

[0058] 将皿内培养液弃去，用4℃预冷好的PBS洗涤三遍。将PBS弃净后把皿置于冰上，加入4mL PBS。用细胞刮下细胞。显微镜下观察剩余细胞量。将PBS用无菌软管吸入无菌15mL离心管中，5min，1000rpm，4℃条件下离心。离心，去除上清液，获得细胞团。加3mL冷PBS，用枪吹散。类似洗涤重复三遍。

[0059] 将上清液去除干净，每管加50μL裂解液(1mL Ripa+10μL protein inhibitor cocktail+1μL 0.3％PMSF)，用枪吹散，移到置于冰上的1.5mL离心管内，细胞被冰上裂解30min，每隔10min涡旋一次。将裂解完毕的液体，进行离心(1300rpm，10min，4℃)。取上清，于-80℃条件下保存。应用BCA蛋白浓度测定法对细胞裂解液中的蛋白浓度进行定量。

[0060] 2.电泳部分

[0061] 2.1丙烯酰胺凝胶的制备

[0062] 根据待分离的蛋白分子量确定所需胶的浓度。在小烧杯中依次加入高纯水，十二烷基硫酸钠(SDS)，丙烯酰胺，Tris-Base(分离胶为pH 8.8，浓缩胶为pH 6.8)，混匀，迅速加入过硫酸钠(AP)，四甲基乙二胺(TEMED)，混匀，迅速加入玻璃板间，异丙醇液封。待30min胶凝固后，按上述顺序配置浓缩胶(Tris-Base，pH 6.8)，除净液封水，灌入浓缩胶至其溢出玻璃板，小心插入点样梳，如有空隙，补胶，待其凝固。

[0063] 2.2电泳

[0064] 浓缩胶凝固后会与分离胶间形成一清晰界面，将胶板取下，放入玻璃板，使电极、胶构成回路。将胶、电极放入电解槽内，将电解槽放入电泳盒内。将1×电泳缓冲液倒入内槽至溢出，使外槽电泳液面高于内槽的铂丝。小心拔出点样梳，使电泳缓冲液充满每个点样孔。将准备好的样品和蛋白质Marker，依次小心加入每个点样孔。将电泳槽的盖子盖好。60V电泳30min左右，至溴酚蓝被压缩成细线进入分离胶，继而用120V电泳90min，当溴酚蓝(约10kDa)到达胶底部时停止电泳。

[0065] 2.3电转

[0066] 取出胶板，小心打开，切除浓缩胶及溴酚蓝以下部分，量尺寸，切角做标记，置于电转缓冲液中，浸泡15min。电转所用海绵、滤纸也用电转缓冲液浸泡15min。根据胶的尺寸，剪取PVDF膜。依次用甲醇15s，MilliQ水2min，放于电转缓冲液中浸泡15-60min。注意赶气泡，关好夹子。插入电转槽，放上准备好的冰盒，放在外槽内，倒入电转液，盖上盖子。蛋白荷负电，使蛋白从低电势的胶转移至高电势的膜上。电转时间90min，电压70V。

[0067] 2.4免疫印迹

[0068] 电转完毕后，打开夹子，将PVDF膜置于摇床上，依次浸于甲醇中10s，定性滤纸干燥15min，甲醇10s，丽春红染色2-5min，水洗可见条带，作为中间检测电转是否成功。根据预染的protein marker切膜，做好标记，TBS/T洗3次，每次5min。将膜至于封闭液中，室温下在摇床上摇1h。将膜置于相应的一抗稀释液中，室温下摇1h，于4℃过夜。膜用TBS/T洗3次，每次
5min。之后，将膜置于二抗稀释液中，室温孵育1h。弃二抗，膜用TBS/T洗3次，每次5min。

[0069] 2.5分析

[0070] 利用双色红外激光成像系统(Odyssey Infrared Imaging，LI-COR)对膜进行拍摄，并用软件ImageJ software分析条带结果。

[0071] 结果见图2，显示2-(4-三氟甲基苯亚胺基)-5-(2-萘基亚甲基)噻唑烷-4-酮化合物引起CYP1A1蛋白表达量上调。