一种检测血液中谷胱甘肽的荧光探针及其合成方法与应用

摘要

一种检测血液里谷胱甘肽(GSH)含量的荧光探针及其合成方法与应用。探针合成步骤简单，光稳定性好。在检测过程中，该荧光探针首先作为底物与谷胱甘肽硫转移酶(GST)结合，并与GST的另一专一底物GSH反应后产生荧光，荧光增强约35倍，且最大发射波长在近红外区域(～700nm)。与现有的GSH荧光探针相比，该探针能够在复杂体系下专一性的检测GSH的含量，并且具有较宽的动态响应窗口，效率高等特点。本发明实现了在复杂环境中探针对GSH的专一性、高效性的识别，在生物及医学领域有极其重要的应用价值。

权利要求

1.一种检测血液中谷胱甘肽的荧光探针，其特征在于：该荧光探针的结构如下：。

2.一种权利要求1所述的检测血液中谷胱甘肽的荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤如下：前体化合物与2，4-二硝基溴苯和三乙胺混合，以乙腈为溶剂在70-80°C加热回流5-6 h，冷却后加入2-4倍体积的二氯甲烷，之后用饱和食盐水萃取3-5次，干燥，过滤，旋干溶剂，柱层析分离得到固体产物；

所述前体化合物为 。

3.按照权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述前体化合物与2，4-二硝基溴苯质量比为1:1-1.5、前体化合物与三乙胺的质量/体积比为1:10-15g/mL、前体化合物与乙腈的质量/体积比为1:100-150g/mL。

4.按照权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述柱层析在室温下过硅胶柱，在二氯甲烷：无水甲醇=20-30:1的条件下洗脱产物。

5.一种权利要求1所述的检测血液中谷胱甘肽的荧光探针在非诊断和非治疗目的的谷胱甘肽检测中的应用，其特征在于：检测时在谷胱甘肽硫转移酶的催化下进行。

说明书

一种检测血液中谷胱甘肽的荧光探针及其合成方法与应用

技术领域

[0001] 本本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种检测血液中GSH的荧光探针、其合成方法及应用。

背景技术

[0002] 还原型谷胱甘肽(GSH)是生物体内主要的非蛋白类巯基化合物，是保持机体正常运转的重要分子。它的存在不但可以预防衰老、癌症、心脏病、老年痴呆等疾病，还是评价帕金森症与阿尔兹海默病的重要标准。在人体的新陈代谢过程中，GSH扮演着对抗氧化压力和对外源性化合物解毒的作用。研究显示，新陈代谢的重要器官肝脏内含有大量的GSH，肝细胞内GSH浓度的改变会影响线粒体膜转运蛋白的活性，从而影响肝功能。相比于细胞和组织内毫摩尔浓度的GSH，血浆内GSH浓度虽然只有微摩尔级，但精确地检测其中GSH的浓度变化却尤为重要。这不仅仅因为维持正常的血浆内GSH含量可以保护细胞免受自由基和氧化压力的损伤，检测血液样品中GSH的浓度变化还可用于诊断人体c-谷酰基循环的紊乱。研究显示，感染HIV的病人血浆内GSH的含量就远低于正常人，通过有效地监控血浆内GSH浓度变化可以作为诊断是否感染HIV的依据之一。

[0003] 荧光探针能够实时原位检测活体细胞或血液内物种的分布和浓度变化，具有灵敏度高、选择性好、操作简单等优点，已成为细胞生物学和医学领域最为有用的工具。识别GSH的小分子荧光探针近几年来也成为研究热点之一。在小分子荧光探针设计中，主要是利用GSH上巯基较强的亲核性，通过麦克尔加成、醛的环化缩合、二硫键或磺酰胺及磺酸酯键的解离等反应，使GSH与荧光探针分子共价连接而产生荧光波长变化，或发生亲核取代反应离去淬灭基团而使荧光恢复。代表性的工作有美国纽约大学的Chang(J.Am.Chem.Soc.2007,129,4510)，湖南大学的杨荣华(J.Am.Chem.Soc.2010,132,725)，中科院理化所的杨清正(J.Am.Chem.Soc.2012,134,18928)，韩国梨花女子大学的Yoon(J.Am.Chem.Soc.2014,136,
5351)，韩国外国语大学的Kim(J.Am.Chem.Soc.2014,136,7018)，湖南师范大学的张友玉(Chem.Commun.2013,49,4640)，华东理工大学的朱为宏(Chem.Commun.2014,50,1751)和赵春常(Chem.Eur.J.2014,20,11471)，山东师范大学的唐波(Chem.Commun.2014,50,15439)等人发明的荧光探针。这些探针已部分用于细胞及模型动物内GSH的荧光成像。

[0004] 然而，已报道的小分子GSH荧光探针存在选择性不专一、难以响应GSH动态变化、难以检测低浓度GSH、灵敏度易受生物体系复杂环境影响等缺点。这是由于这些反应型荧光探针与GSH之间发生的是不可逆反应，并且反应速度依赖于探针和GSH的高浓度和单一合适的反应条件。同时，生物体内还富含其他含巯基的生物分子，如半胱氨酸(Cys)和高半胱氨酸(Hcy)，它们的结构与GSH相似，含有的巯基同样能够与探针分子发生相似的反应，使得探针表现为对GSH识别的不专一。因此，开发能够在复杂环境的生物体系中真正专一识别GSH，并且具有宽的GSH动态响应窗口的荧光探针成为当前的迫切需要。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种检测GSH的荧光探针、其制备方法及应用，该探针对GSH具有专一的选择性和较高的灵敏度，制备方法简单，适合生物医药等实际应用。

[0006] 本发明提供了一种检测血液中谷胱甘肽(GSH)的荧光探针，该荧光探针结构如下：

[0007]

[0008] 本发明提供了所述荧光探针的制备方法，该方法具体步骤如下：

[0009] 前体化合物与2，4-二硝基溴苯和三乙胺混合，以乙腈为溶剂在70-80℃加热回流5-6h，冷却后加入2-4倍体积的二氯甲烷，之后用饱和食盐水萃取3-5次，干燥，过滤，旋干溶剂，柱层析分离得到固体产物，

[0010] 所述前体化合物为 (公开号：CN 104710815 A)。

[0011] 所述前体化合物与2，4-二硝基溴苯质量比为1:1-1.5、前体化合物与三乙胺的质量/体积比为1:10-15(g/mL)、前体化合物与乙腈的质量/体积比为1:100-150(g/mL)。

[0012] 所述柱层析在室温下过硅胶柱，在二氯甲烷：无水甲醇＝20-30:1的条件下洗脱产物。所述的检测血液中谷胱甘肽(GSH)的荧光探针可以在谷胱甘肽(GSH)检测中应用。

[0013] 所述谷胱甘肽(GSH)检测包括血液内谷胱甘肽的检测医学中对谷胱甘肽的检测，上述检测在谷胱甘肽硫转移酶的催化进行。

[0014] 其中一种上述荧光探针的具体合成路线如下：

[0015]

[0016] 本发明提供的荧光探针应用于血液内GSH的检测及其在医学中对GSH的检测。

[0017] 本发明具有以下具体特征：

[0018] 探针分子合成路线简单、反应条件温和、后处理简单方便，对GSH识别能力专一，响应速度较快。探针发射波长在近红外区域(～700nm)，荧光信号较弱，在GST蛋白的存在下，与GSH作用荧光增强约35倍。与现有的GSH荧光探针相比，该探针选择性高，对生物体内富含的巯基化合物Cys，Hcy基本无响应。能够在复杂环境的生物体系中专一识别GSH，在生物及医学领域有极其重要的应用价值。

附图说明

[0019] 图1本发明荧光探针的结构式；

[0020] 图2本发明荧光探针合成路线图；

[0021] 图3实施例1制备的荧光探针核磁谱图氢谱；

[0022] 图4实施例1制备的荧光探针核磁谱图碳谱；

[0023] 图5为实施例1制备的荧光探针分别或同时与GST、GSH作用后的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1μM，GST浓度为1μM，GSH浓度为5eq；

[0024] 图6为实施例1制备的荧光探针在GST存在下分别与20种氨基酸作用后的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1μM，GST浓度为1μM，20种氨基酸浓度分别为5μM；

[0025] 图7为实施例1制备的荧光探针在GST存在下分别与Cys，Hcy和GSH作用后的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1μM，GST浓度为1μM，Cys，Hcy和GSH浓度分别为5μM；

[0026] 图8为实施例1制备的荧光探针在GST存在下对GSH的检测极限

[0027] 图9为实施例1制备的荧光探针在20％的血清中对GSH的检测，荧光探针的浓度为1μM，GST浓度为1μM，GSH浓度为5μM。

具体实施方式

[0028] 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。实施例1：血液中检测GSH的荧光探针的制备，基本合成方法如下：

[0029] 在50mL的单口瓶中加入罗丹荧前体化合物(0.2mmol)与2，4-二硝基溴苯63mg(0.25mmol)，加入乙腈10mL，三乙胺0.5mL，80℃加热回流6h，冷却后加入4倍体积的二氯甲烷，之后用饱和食盐水萃取3次，干燥，过滤，旋干溶剂，在室温下过硅胶柱，在二氯甲烷：无水甲醇＝20:1的条件下洗脱得到产物，产率为70％。

[0030] 探针分子的氢谱和碳谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.85(d,J＝4Hz,1H),8.36(dd,J＝9.2,2.4Hz,1H),8.03(d,J＝7.6Hz,1H),7.68(t,J＝7.2Hz,1H),7.62(t,J＝
7.2Hz,1H),7.23(d,J＝8.4Hz,1H),7.17(d,J＝9.2Hz,1H),6.99(d,J＝2.3Hz,1H),6.87(d,J＝8.4Hz,1H),6.74(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),6.37(s,1H),5.69(s,1H),3.37(dd,J＝13.2,
6.0Hz,4H),3.17(t,J＝8.8Hz,2H),3.01–2.92(m,2H),1.21(t,J＝7.2Hz,3H),0.87(t,J＝
6.8Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ169.38,155.30,154.68,153.37,153.03,144.84,
141.98,138.41,134.86,132.27,130.55,129.68,128.87,126.99,124.99,124.04,122.06,
119.42,117.44,114.74,108.55,107.63,104.39,96.88,53.41,46.76,45.87,45.52,
45.36,10.28,9.67,8.61.

[0031] 实施例2：实施例1制备的荧光探针在GST存在下对GSH的响应情况

[0032] 将该探针溶于DMSO溶液中配制成10-3M的母液，在4mL，20mM pH＝7.4[0033] 的PBS溶液中分别配置1μM探针，探针(1μM)和GSH(5μM)的混合溶液，探针(1μM)和GST(1μM)的混合溶液，探针(1μM)、GSH(5μM)和GST(1μM)的混合溶液，测定荧光得到图5。

[0034] 图5中只有探针存在时(1μM)显示微弱的荧光，并且在探针溶液中只加入GSH(5μM)时，荧光也只有一点增强。而当1μM的GST的存在下加入GSH荧光有显著的增强，增强约35倍，发射波长在近红外区(～700nm)。

[0035] 实施例3：实施例1制备的荧光探针的选择性

[0036] 在4mL，20mM pH＝7.4的PBS溶液中加入1μM探针、1μM GST，随后分别加入5μM的20种氨基酸和GSH，测定荧光得到图6，结果显示只有加入GSH后荧光有明显的增强，说明本探针能对GSH特异性识别。

[0037] 在4mL，20mM pH＝7.4的PBS溶液中加入1μM探针、1μM GST，随后分别加入5μM的GSH、Cys和Hcy，测定荧光强度得到图7。结果显示只有加入GSH时荧光有明显的增强，证明该探针对生物体内大量存在的生物巯基化合物Cys和Hcy没有响应，进一步证明本探针对GSH的选择性识别能力。

[0038] 实施例4：实施例1制备的荧光探针对GSH的检测极限

[0039] 在4mL，20mM pH＝7.4的PBS溶液中加入1μM探针、1μM GST，随后加入不同浓度GSH(分别为0.01μM，0.1μM，0.2μM，0.4μM和0.6μM)，测试其荧光强度变化，然后以GSH的浓度为横坐标，荧光强度的积分面积为纵坐标得到一条归一化的直线(图8)，根据公式[0040] 检测极限＝blank+3σ算出检测极限为9.7nM。

[0041] 实施例5：荧光探针在血液中对GSH的检测

[0042] 用20mM pH＝7.4的PBS溶液稀释得到20％的胎牛血清，在该血清中分别加入1μM探针，探针(1μM)和GST(1μM)的混合溶液，探针(1μM)、GSH(5μM)和GST(1μM)的混合溶液，分别测定荧光得到图9，虽然探针(1μM)加入血清后荧光有增强，但是当GST(1μM)和GSH(5μM)加入后荧光增强更明显，约6倍的增强，证明该探针可以在血液中检测GSH。