一种LR酶可识别和作用的位点对和引物对及质粒构建方法

摘要

本发明涉及一种LR酶可识别和作用的位点对，其序列如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸1和SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸2组成。还涉及一种引物对，其特征在于，由引物1和引物2组成，引物1包括寡核苷酸1和待扩增基因的5’端特征引物，引物2包括寡核苷酸2和所述基因的3’端特征引物，并且寡核苷酸1和寡核苷酸2均处于相应引物的5’端。还涉及使用该引物对的质粒构建方法。本发明将LR反应中LR酶的识别位点缩短到36bp左右，大大改进了原有的Gateway克隆，使得在表达质粒构建过程中，可绕过BP反应，直接进行LR反应，简化了操作步骤并节约了人工成本和试剂成本。

权利要求

1.一种DNA片段作为LR酶可识别和作用的位点对的应用，其特征在于，所述DNA片段由序列如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸1和序列如SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸2组成。

2.一种引物对，其特征在于，由引物1和引物2组成，引物1由序列如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸1和待扩增基因的5’端特征引物组成，引物2由序列如SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸2和所述基因的3’端特征引物组成，并且寡核苷酸1和寡核苷酸2均处于相应引物的5’端。

3.一种质粒构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：使用权利要求2所述引物对扩增待扩增基因，得到PCR产物，所述待扩增基因的长度为400-800bp；

S2：将所述PCR产物与终质粒R4L1pDEST_HISi进行LR反应，筛选得到带有所述基因的终质粒，所述终质粒为带有attR位点对并且所述attR位点对之间设置ccdB基因。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S2中所述终质粒为带有筛选标记的表达质粒，并且S2具体包括：S21：将所述PCR产物、所述终质粒以及LR反应试剂混合，进行LR反应，得到反应产物；

S22：用所述反应产物转化感受态大肠杆菌细胞；

S23：用所述筛选标记筛选转化了带有所述基因的表达质粒的大肠杆菌细胞；

S24：培养S23筛选得到的大肠杆菌细胞，提取质粒，即得到纯化的带有所述基因的表达质粒。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌细胞为DH5α。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述筛选标记为抗抗生素抗性。

说明书

一种LR酶可识别和作用的位点对和引物对及质粒构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学领域，更特别的，涉及一种LR酶可识别和作用的位点对，包含该位点对的引物对，以及使用该引物对的质粒构建方法。

背景技术

[0002] Gateway是一个载体构建方法的名称，需要通过BP和LR两个反应。BP反应需要BP酶，LR反应需要LR酶，BP反应是将目的DNA片段连接到中间载体，LR反应是将连接到中间载体上的目标片段转移到终载体上。BP反应是attB与attP特异位点的识别交换，生成attL(载体叫entry载体)和attR特异位点，LR反应是attL和attR特异位点的识别交换，生成attB和attP特异识别位点。attL一般为125bp，我们需要在目标DNA片段的左右引物5’端加25bp(bp为碱基数单位)的attB位点，中间载体上有attP(载体叫pDONR载体)识别位点，终载体上有attR识别位点。

[0003] 目前大多数用Gateway技术构建载体的实验室中，主要通过以下两种方式构建：

[0004] 第一，通过BP反应将DNA目标片段连接到pDONR载体上，得到entry载体，然后entry载体与终载体通过LR反应，将目标片段连接到终载体。但是BP酶价格昂贵，且在实际应用中，由于回收PCR产物的质量不高，浓度要求达不到BP反应的要求，这一步有点难度。

[0005] 第二，通过酶切的方式将DNA片段连接到entry载体上，然后entry载体与终载体通过LR反应，将目标片段连接到终载体。这种方法通过酶切的方式连接载体，舍弃了重组位点连接快速，效率高的优点，而且酶切连接方法的单酶切DNA片段的连接方向不能确定，双酶切又存在难以找到两种酶的效率都高。

[0006] 2008年，美国的孟山都公司发了一篇文章，在DNA片段的左右引物5’端直接合成attL位点，然后将PCR产物与终载体进行LR反应，将目标片段连接到终载体，他们是将原长125bp的attL缩短为48bp，该方法目前还没有在实验室中应用。该方法仍然存在缺陷，DNA左右引物5’端加的48bp太长，合成引物的费用增多，且在PCR扩增时，因为引物太长，必须通过两步法扩增DNA片段，操作麻烦且也增加了重复引物的合成费用。

[0007] 2013年美国的life公司也发了一篇文章，将BP，LR反应一起进行，该方法也少有实验室应用。该方法虽然减少了实验步骤，但是，仍然要进行BP反应和LR反应，并且，由于BP反应的试剂成本比较贵。

发明内容

[0008] 为解决以上问题，本发明提供了一种LR酶可识别和作用的位点对，其由序列如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸1和序列如SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸2组成。

[0009] 本发明还提供了一种引物对，其由引物1和引物2组成，引物1包括序列如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸1和待扩增基因的5’端特征引物，引物2包括序列如SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸2和所述基因的3’端特征引物，并且寡核苷酸1和寡核苷酸2均处于相应引物的5’端。

[0010] 本发明还提供了一种质粒构建方法，其包括以下步骤：

[0011] S1：使用权利要求2或3所述引物对扩增待扩增基因，得到PCR产物；

[0012] S2：将所述PCR产物与带有attR位点的终质粒进行LR反应，得到带有所述基因的终质粒。

[0013] 优选地，S2中所述终质粒为带有筛选标记的表达质粒，并且S2具体包括：

[0014] S21：将所述PCR产物、所述终质粒以及LR反应试剂混合，进行LR反应，得到反应产物；

[0015] S22：用所述反应产物转化感受态大肠杆菌细胞；

[0016] S23：用所述筛选标记筛选转化了带有所述基因的表达质粒的大肠杆菌细胞；

[0017] S24：培养S23筛选得到的大肠杆菌细胞，提取质粒，即得到纯化的带有所述基因的表达质粒。

[0018] 优选地，所述大肠杆菌细胞为DH5α。

[0019] 优选地，所述筛选标记为抗抗生素抗性。

[0020] 本发明将LR反应中LR酶的识别位点缩短到36bp左右，大大改进了原有的Gateway克隆，使得在表达质粒构建过程中，可绕过BP反应，直接用PCR产物与终质粒进行LR反应，简化了操作步骤并节约了人工成本和试剂成本。

附图说明

[0021] 图1为直接LR反应的原理示意图；

[0022] 图2为R4L1pDEST_HISi的质粒图；

[0023] 图3为attL”-400+R4L1pDEST_HISi的菌落PCR的电泳照片；

[0024] 图4为attL”-800+R4L1pDEST_HISi的菌落PCR的电泳照片。

具体实施方式

[0025] 以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

[0026] 本发明将传统的分别为125bp左右的attL特异位点对缩短为各36bp左右，将该位点对命名为attL”(其中，attL”1序列如SEQ ID NO:1所示，attL”2序列如SEQ ID NO:2所示)。然后将PCR产物通过LR反应直接插入到终载体上。

[0027] 本实验中使用400bp和800bp的DNA片段和R4L1pDEST_HISi载体连接，验证36bp左右的attL”。其中，R4L1pDEST_HISi的质粒图如图2所示。步骤如下：

[0028] 1.PCR扩增目的片段

[0029] 使用引物1(SEQ ID NO:3)和2(SEQ ID NO:4)扩增400bp长的目标片段，引物3(SEQ ID NO:5)和4(SEQ ID NO:6)扩增800bp长的目标片段，15μL扩增体系的组成为：模板0.5μL，10×Taq buffer 1.5μL，2.5mM dNTP 0.5μL，引物1/20.5μL/0.5μL,Taq DNA polymerase 
0.4μL，余下为ddH2O。

[0030] 反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃ 1000bp/min，31个循环；72℃延伸5min；25℃ 10min。

[0031] PCR结束后，用1％的琼脂糖跑电泳，按照胶回收试剂盒(生工生物工程有限公司，中国，上海)回收目标PCR产物。

[0032] 3.LR反应

[0033] 将回收的PCR产物直接与R4L1pDEST_HISi载体进行LR反应。LR反应的体系和条件如表1所示。

[0034] 表1 LR反应体系

[0035]

[0036] 4.转化DH5α和抗生素筛选

[0037] LR反应之后，将反应液转入到DH5α感受态细胞(全式金生物，中国，北京)中。(1)将感受态从-80℃的冰箱中拿出放到冰上5min，待感受态融化后；(2)反应液全部加入感受态细胞中，冰浴30min；(3)快速将感受态混合物、42℃水浴90s；(4)将混合物拿出，冰浴3min；(5)加入800μL的LB液体培养基，37℃，180r/min培养45min；(6)将培养物7000r/min，1min离心，去掉700μL上清，用剩下的100μL LB培养基将沉淀物用枪吸打混匀，用涂棒将100μL菌液均匀涂抹于含相应抗生素的培养皿上，37℃培养箱中培养12h。

[0038] 5.菌落PCR验证

[0039] 12h后挑选长出的菌落为模板做菌落PCR，体系同前，所用引物以及延伸时间都与扩增DNA片段的PCR条件对应。结果如图3和4所示：图3为attL”-400+R4L1pDEST_HISi的菌落PCR，其中6、10和12泳道出现了目标带，47880为阳性对照；图4为attL”-800+R4L1 pDEST_HISi的菌落PCR，其中1、2、3、4、5、6和8泳道出现了目标带，T-800为阳性对照，ddH20为阴性对照。

[0040] 由此可见，该方法能够通过将PCR产物直接进行LR反应，并得到期望的克隆。

[0041] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。