本发明公开了一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒及其应用，所述试剂盒包含47对常染色体InDel位点基因座、2对Y染色体InDel位点基因座以及1对性别鉴定基因的特异性扩增引物。所述试剂盒能够用于人类个体识别、亲权鉴定以及降解检材识别。本发明包含49个分型较均衡的InDel位点和1个性别鉴定基因，采用六色STR荧光检测系统，高于目前已经公开的法医InDel检测试剂盒；本发明适用于中国人群的检测；本发明建立的50个位点的扩增体系，扩增片段短，扩增子控制在200bp，适用于高度降解检材的InDel分型；本发明所述扩增体系提高了降解检材中位点的检出数目；本发明所述的体系中引入的2个Y‑InDel位点，能够对性别鉴定基因Amelogenin起到辅助判定的作用。
1.一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含47对常染色体InDel位点基因座的特异性扩增引物、2对Y染色体InDel位点基因座的特异性扩增引物以及1对性别鉴定基因的特异性扩增引物；所述InDel位点基因座为：InDel-01：rs3067397、InDel-02：rs10607699、InDel-03：rs71852971、InDel-04：rs67487831、InDel-05：rs140683187、InDel-06：rs5787309、InDel-07：rs34287950、InDel-
08：rs67100350、InDel-09：rs769299、InDel-10：rs3076465、InDel-11：rs67939200、InDel-
12：rs145941537、InDel-13：rs67264216、InDel-14：rs35453727、InDel-15：rs35065898、InDel-16：rs60575667、InDel-17：rs66911131、InDel-18：rs61490765、InDel-19：rs34419736、InDel-20：rs34421865、InDel-21：rs66739142、InDel-22：rs3029189、InDel-
23：rs33971783、InDel-24：rs72085595、InDel-25：rs34529638、InDel-26：rs11277697、InDel-27：rs10558392、InDel-28：rs538690481、InDel-29：rs140323077、InDel-30：rs66477007、InDel-31：rs3834231、InDel-32：rs145577149、InDel-33：rs35309403、InDel-
34：rs66595817、InDel-35：rs1160980、InDel-36：rs79225518、InDel-37：rs3217112、InDel-38：rs67426579、InDel-39：rs151335218、InDel-40：rs142221201、InDel-41：rs34209360、InDel-42：rs67700747、InDel-43：rs67365630、InDel-44：rs35464887、InDel-
45：rs5897566、InDel-46：rs35267904、InDel-47：rs67405073、InDel-48：rs199815934、InDel-49：rs76041101，性别鉴定基因为Amelogenin；其中所述的rs号表示该位点在dbSNP数据库中的编号；所述特异性扩增引物的序列如下：InDel-01、SEQ ID NO.1-2；InDel-02、SEQ ID NO.3-4；InDel-03、SEQ ID NO.5-6；InDel-04、SEQ ID NO.7-8；InDel-05、SEQ ID NO.9-10；InDel-06、SEQ ID NO.11-12；InDel-07、SEQ ID NO.13-14；InDel-08、SEQ ID NO.15-16；InDel-09、SEQ ID NO.17-18；InDel-10、SEQ ID NO.19-20；InDel-11、SEQ ID NO.21-22；InDel-12、SEQ ID NO.23-24；InDel-13、SEQ ID NO.25-26；InDel-14、SEQ ID NO.27-28；InDel-15、SEQ ID NO.29-30；InDel-16、SEQ ID NO.31-32；InDel-17、SEQ ID NO.33-34；InDel-18、SEQ ID NO.35-36；InDel-19、SEQ ID NO.37-38；InDel-20、SEQ ID NO.39-40；InDel-21、SEQ ID NO.41-42；InDel-22、SEQ ID NO.43-44；InDel-23、SEQ ID NO.45-46；InDel-24、SEQ ID NO.47-48；InDel-25、SEQ ID NO.49-50；InDel-26、SEQ ID NO.51-52；InDel-27、SEQ ID NO.53-54；InDel-28、SEQ ID NO.55-56；InDel-29、SEQ ID NO.57-58；InDel-30、SEQ ID NO.59-60；InDel-31、SEQ ID NO.61-62；InDel-32、SEQ ID NO.63-64；InDel-33、SEQ ID NO.65-66；InDel-34、SEQ ID NO.67-68；InDel-35、SEQ ID NO.69-70；InDel-36、SEQ ID NO.71-72；InDel-37、SEQ ID NO.73-74；InDel-38、SEQ ID NO.75-76；InDel-39、SEQ ID NO.77-78；InDel-40、SEQ ID NO.79-80；InDel-41、SEQ ID NO.81-82；InDel-42、SEQ ID NO.83-84；InDel-43、SEQ ID NO.85-86；InDel-44、SEQ ID NO.87-88；InDel-45、SEQ ID NO.89-90；InDel-46、SEQ ID NO.91-92；InDel-47、SEQ ID NO.93-94；InDel-48、SEQ ID NO.95-96；InDel-49、SEQ ID NO.97-98；Amelogenin、SEQ ID NO.99-100。
2.根据权利要求1所述的一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物的浓度如下：InDel-01、0.08μM；InDel-02、0.1μM；InDel-03、0.07μM；InDel-04、0.06μM；InDel-05、0.12μM；InDel-06、0.09μM；InDel-07、
0.07μM；InDel-08、0.07μM；InDel-09、0.11μM；InDel-10、0.09μM；InDel-11、0.08μM；InDel-
12、0.05μM；InDel-13、0.07μM；InDel-14、0.08μM；InDel-15、0.12μM；InDel-16、0.11μM；
InDel-17、0.1μM；InDel-18、0.06μM；InDel-19、0.07μM；InDel-20、0.11μM；InDel-21、0.08μM；InDel-22、0.06μM；InDel-23、0.07μM；InDel-24、0.12μM；InDel-25、0.11μM；InDel-26、
0.06μM；InDel-27、0.08μM；InDel-28、0.08μM；InDel-29、0.07μM；InDel-30、0.09μM；InDel-
31、0.05μM；InDel-32、0.06μM；InDel-33、0.12μM；InDel-34、0.08μM；InDel-35、0.09μM；
InDel-36、0.07μM；InDel-37、0.11μM；InDel-38、0.1μM；InDel-39、0.05μM；InDel-40、0.06μM；InDel-41、0.13μM；InDel-42、0.09μM；InDel-43、0.08μM；InDel-44、0.07μM；InDel-45、
0.05μM；InDel-46、0.06μM；InDel-47、0.1μM；InDel-48、0.11μM；InDel-49、0.09μM；
3.根据权利要求1所述的一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物的PCR扩增产物长度均小于200bp。
4.根据权利要求1所述的一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物分为五组：第一组，InDel-04、InDel-07、InDel-
12、InDel-18、InDel-22、InDel-23、InDel-27、InDel-31、InDel-36、InDel-40和InDel-46；
第二组，InDel-01、InDel-03、InDel-08、InDel-11、InDel-13、InDel-19、InDel-26、InDel-
28、InDel-32、InDel-34和InDel-45；第三组，InDel-02、InDel-05、InDel-09、InDel-15、InDel-16、InDel-30、InDel-35、InDel-38、InDel-43、InDel-48；第四组，InDel-06、InDel-
14、InDel-20、InDel-25、InDel-33、InDel-39、InDel-42、InDel-47、Amelogenin；第五组：InDel-10、InDel-17、InDel-21、InDel-24、InDel-29、InDel-37、InDel-41、InDel-44、InDel-49；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。
5.根据权利要求4所述的一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为6-FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIG中任意一种，且每组采用的荧光标记不同。
6.根据权利要求1所述的一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括2.5×Reaction Mix，2mL；基因组DNA，10ng；5×引物混合物，1mL；5U/μL的热启动Taq酶，100μL；sdH2O，1.95mL；其中，所述的2.5×Reaction Mix成分为：7.5mM MgCl2，pH8.3的125mM Tris-HCl，125mM KCl, 7.5mM dNTPs, 2mg/mL BSA，
7.权利要求1所述的人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒在人类个体识别、亲权鉴定以及降解检材识别中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的程序为采用聚合酶链式反应扩增InDel位点，并通过毛细管电泳检测扩增产物。
一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增
试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及采用分子标记进行基因检测，具体为一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒及其应用。
背景技术
[0002] 亲权鉴定和个体识别是法医DNA鉴定的主要内容。短串联重复序列(short tandem repeat，STR)分型技术是目前普遍采用的技术手段。STR基因座是核心序列为2～6bp的短串联重复多态性遗传标记。20世纪90年代初，STR基因座首次作为一种重要的遗传标记在人类亲权鉴定中被使用。从此，法医物证鉴定进入了DNA鉴定时代。随着STR基因座在法医DNA分析中的广泛应用，其缺陷也日益受到关注，如STR基因座的高突变率不利于亲权鉴定的结果解释，PCR扩增子较长不易实现对降解检材的DNA分型，STR基因座的数量有限不利于复杂亲缘关系的鉴定等。而曾被学界提出有望作为STR替代标记的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)则因受到分型系统的限制而止步于更广泛的法医DNA鉴定的应用。
[0003] InDel多态性是人类基因组中一种特殊类型的二等位基因遗传标记，表现为基因组中插入或缺失了不同大小的小片段。InDel作为新一代的法医遗传学鉴定标记，兼具STR和SNP的优点。与STR相比，InDel突变频率较低，约为10-8，比STR小几个数量级，相对比较稳定。同时在结构上属于二等位基因多态性，等位基因都固定并且已知，能够通过很小的扩增子进行扩增，提高了扩增高度降解检材的成功率。与SNP相比，InDel本质上属于长度多态性，可以应用于目前法医DNA实验室普及的毛细管电泳技术平台上进行分析，分型技术易于掌握和普及。2006年，Mills等创建了第一个人类基因组InDel图谱。该图谱中包含有415000多个具有特异性的多态性位点，平均密度为每7.2kb一个InDel位点。2011年的随访研究又报道了在79种不同人群的基因组中发现了近200万个InDel多态性标记。这项工作被认为是InDel位点识别方面里程碑式的进展，大大促进了InDel在相关领域的研究，同时也引起了法医学领域的关注。2009年，Pereira等建立了一种用于人类个体识别的多重PCR体系，该体系包含有38个位于非编码区的常染色体InDel。目前法医学领域应用较多的InDel商品化试剂盒是QIAGEN公司的Investigator DIPplex Kit荧光标记复合扩增系统，该试剂盒包含了30个常染色体InDel位点，采用四色荧光标记技术，其优势在于能够通过一次PCR得到所有目标产物，产物通过毛细管电泳平台进行检测分型。但是由于InDel属于二等位基因，已有的报道显示30个InDel位点在国内外多个人群中的多态性表现不能完全达到司法鉴定案件中遗传标记的要求，且并非根据我国主要民族群体遗传学数据筛选得到的高多态性位点，因此一定程度上制约了该InDel试剂盒在个体识别和亲权鉴定上的应用。
[0004] 中国专利CN101956005A，公开了一种荧光标记的插入缺失遗传多态性位点复合扩增系统及其应用，具体为：该现有技术包含扩增35个InDel位点的特异性引物，所述引物由FAM、HEX、TAMRA、ROX四种荧光素标记，该试剂盒可以应用于三联体亲子鉴定、二联体亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定以及个体识别和人类学领域。本发明具有高灵敏度、多态性高、稳定性、重复性好、分型结果准确等优点。但是该现有技术存在以下不足：(1)采用四色荧光系统，鉴定效率较低；(2)部分PCR扩增产物大于200bp，对于降解的检材，检测效果不佳；(3)检测的位点较少，人群识别度不高。
发明内容
[0005] 解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种针对中国人群，且适用于高度降解的检材的鉴定分析的试剂盒，本发明提供了一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒及其应用。
[0006] 技术方案：一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒，所述试剂盒包含47对常染色体InDel位点基因座的特异性扩增引物、2对Y染色体InDel位点基因座的特异性扩增引物以及1对性别鉴定基因的特异性扩增引物；所述InDel位点基因座为：InDel-01(rs3067397)、InDel-02(rs10607699)、InDel-03(rs71852971)、InDel-04(rs67487831)、InDel-05(rs140683187)、InDel-06(rs5787309)、InDel-07(rs34287950)、InDel-08(rs67100350)、InDel-09(rs769299)、InDel-10(rs3076465)、InDel-11(rs67939200)、InDel-12(rs145941537)、InDel-13(rs67264216)、InDel-14(rs35453727)、InDel-15(rs35065898)、InDel-16(rs60575667)、InDel-17(rs66911131)、InDel-18(rs61490765)、InDel-19(rs34419736)、InDel-20(rs34421865)、InDel-21(rs66739142)、InDel-22(rs3029189)、InDel-23(rs33971783)、InDel-24(rs72085595)、InDel-25(rs34529638)、InDel-26(rs11277697)、InDel-27(rs10558392)、InDel-28(rs538690481)、InDel-29(rs140323077)、InDel-30(rs66477007)、InDel-31(rs3834231)、InDel-32(rs145577149)、InDel-33(rs35309403)、InDel-34(rs66595817)、InDel-35(rs1160980)、InDel-36(rs79225518)、InDel-37(rs3217112)、InDel-38(rs67426579)、InDel-39(rs151335218)、InDel-40(rs142221201)、InDel-41(rs34209360)、InDel-42(rs67700747)、InDel-43(rs67365630)、InDel-44(rs35464887)、InDel-45(rs5897566)、InDel-46(rs35267904)、InDel-47(rs67405073)、InDel-48(rs199815934)、InDel-49(rs76041101)，性别鉴定基因为Amelogenin；其中括号中的rs号表示该位点在dbSNP数据库中的编号。
[0007] 上述InDel遗传多态性位点的筛选原则如下：应用VCFtools等生物信息分析软件，分析1000 Genomes Project和其它遗传信息数据库中的人类基因组遗传变异数据，筛选在东亚人群中多态性高的100个左右常染色体InDel、10个左右Y染色体InDel作为候选位点。建立单位点检测体系，使用候选InDel位点分别在10～20个汉族样本中进行分型，进一步筛选出单位点检验中多态性高、检验效果好的47个常染色体InDel位点、2个Y-InDel位点。其中最终筛选到的InDel位点必须符合：1、最低等位基因频率(MAF)0.3-0.5之间，对应的理论平均杂合度(HET)在0.4以上；2、Hardy—Weinberg平衡卡方检验p>0.05；3、intron区域的位点；4、InDel等位基因片段长度差异(插入或缺失的碱基)在3-6bp；5、分散在不同的染色体上且距离在5M以上；6、hg38版基因组以及DBsnp147-common中能找到的位点。
[0008] 优选的，所述特异性扩增引物的序列如下：InDel-01、SEQ ID NO.1-2；InDel-02、SEQ ID NO.3-4；InDel-03、SEQ ID NO.5-6；InDel-04、SEQ ID NO.7-8；InDel-05、SEQ ID NO.9-10；InDel-06、SEQ ID NO.11-12；InDel-07、SEQ ID NO.13-14；InDel-08、SEQ ID NO.15-16；InDel-09、SEQ ID NO.17-18；InDel-10、SEQ ID NO.19-20；InDel-11、SEQ ID NO.21-22；InDel-12、SEQ ID NO.23-24；InDel-13、SEQ ID NO.25-26；InDel-14、SEQ ID NO.27-28；InDel-15、SEQ ID NO.29-30；InDel-16、SEQ ID NO.31-32；InDel-17、SEQ ID NO.33-34；InDel-18、SEQ ID NO.35-36；InDel-19、SEQ ID NO.37-38；InDel-20、SEQ ID NO.39-40；InDel-21、SEQ ID NO.41-42；InDel-22、SEQ ID NO.43-44；InDel-23、SEQ ID NO.45-46；InDel-24、SEQ ID NO.47-48；InDel-25、SEQ ID NO.49-50；InDel-26、SEQ ID NO.51-52；InDel-27、SEQ ID NO.53-54；InDel-28、SEQ ID NO.55-56；InDel-29、SEQ ID NO.57-58；InDel-30、SEQ ID NO.59-60；InDel-31、SEQ ID NO.61-62；InDel-32、SEQ ID NO.63-64；InDel-33、SEQ ID NO.65-66；InDel-34、SEQ ID NO.67-68；InDel-35、SEQ ID NO.69-70；InDel-36、SEQ ID NO.71-72；InDel-37、SEQ ID NO.73-74；InDel-38、SEQ ID NO.75-76；InDel-39、SEQ ID NO.77-78；InDel-40、SEQ ID NO.79-80；InDel-41、SEQ ID NO.81-82；InDel-42、SEQ ID NO.83-84；InDel-43、SEQ ID NO.85-86；InDel-44、SEQ ID NO.87-88；InDel-45、SEQ ID NO.89-90；InDel-46、SEQ ID NO.91-92；InDel-47、SEQ ID NO.93-94；InDel-48、SEQ ID NO.95-96；InDel-49、SEQ ID NO.97-98；Amelogenin、SEQ ID NO.99～100。
[0009] 优选的，所述特异性扩增引物的浓度如下：InDel-01、0.08μM；InDel-02、0.1μM；InDel-03、0.07μM；InDel-04、0.06μM；InDel-05、0.12μM；InDel-06、0.09μM；InDel-07、0.07μM；InDel-08、0.07μM；InDel-09、0.11μM；InDel-10、0.09μM；InDel-11、0.08μM；InDel-12、
0.05μM；InDel-13、0.07μM；InDel-14、0.08μM；InDel-15、0.12μM；InDel-16、0.11μM；InDel-
17、0.1μM；InDel-18、0.06μM；InDel-19、0.07μM；InDel-20、0.11μM；InDel-21、0.08μM；
InDel-22、0.06μM；InDel-23、0.07μM；InDel-24、0.12μM；InDel-25、0.11μM；InDel-26、0.06μM；InDel-27、0.08μM；InDel-28、0.08μM；InDel-29、0.07μM；InDel-30、0.09μM；InDel-31、
0.05μM；InDel-32、0.06μM；InDel-33、0.12μM；InDel-34、0.08μM；InDel-35、0.09μM；InDel-
36、0.07μM；InDel-37、0.11μM；InDel-38、0.1μM；InDel-39、0.05μM；InDel-40、0.06μM；
InDel-41、0.13μM；InDel-42、0.09μM；InDel-43、0.08μM；InDel-44、0.07μM；InDel-45、0.05μM；InDel-46、0.06μM；InDel-47、0.1μM；InDel-48、0.11μM；InDel-49、0.09μM；Amelogenin、
0.13μM。
[0010] 所述试剂盒中的引物及其序列和浓度如下表所示：
[0011]
[0012]
[0013]
[0014]
[0015] 优选的，所述特异性扩增引物的PCR扩增产物长度均小于200bp。
[0016] 优选的，所述特异性扩增引物分为五组：第一组，InDel-04、InDel-07、InDel-12、InDel-18、InDel-22、InDel-23、InDel-27、InDel-31、InDel-36、InDel-40和InDel-46；第二组，InDel-01、InDel-03、InDel-08、InDel-11、InDel-13、InDel-19、InDel-26、InDel-28、InDel-32、InDel-34和InDel-45；第三组，InDel-02、InDel-05、InDel-09、InDel-15、InDel-16、InDel-30、InDel-35、InDel-38、InDel-43、InDel-48；第四组，InDel-06、InDel-14、InDel-20、InDel-25、InDel-33、InDel-39、InDel-42、InDel-47、Amelogenin；第五组：
InDel-10、InDel-17、InDel-21、InDel-24、InDel-29、InDel-37、InDel-41、InDel-44、InDel-49；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。
[0017] 优选的，所述荧光染料为6-FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIG中任意一种，且每组采用的荧光标记不同。
[0018] 进一步的，所述特异性扩增引物分组及标记如下：荧光染料为6-FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIG；其中6-FAM标记InDel-04、InDel-07、InDel-12、InDel-18、InDel-22、InDel-23、InDel-27、InDel-31、InDel-36、InDel-40和InDel-46；HEX标记InDel-01、InDel-03、InDel-08、InDel-11、InDel-13、InDel-19、InDel-26、InDel-28、InDel-32、InDel-34和InDel-45；
TAMRA标记InDel-02、InDel-05、InDel-09、InDel-15、InDel-16、InDel-30、InDel-35、InDel-38、InDel-43、InDel-48；ROX标记InDel-06、InDel-14、InDel-20、InDel-25、InDel-
33、InDel-39、InDel-42、InDel-47、Amelogenin；VIG标记InDel-10、InDel-17、InDel-21、InDel-24、InDel-29、InDel-37、InDel-41、InDel-44、InDel-49。
[0019] 所述试剂盒中含有分子量内标，且分子量内标由橙色荧光SIZ标记。
[0020] 优选的，所述试剂盒包括2.5×Reaction Mix，2mL；基因组DNA，10ng；5×引物混合物，1mL；5U/μL的热启动Taq酶，100μL；sdH2O，1.95mL；其中，所述的2.5×Reaction Mix成分为：7.5mM MgCl2，125mM Tris-HCl(pH8.3)，125mM KCl,7.5mM dNTPs,2mg/mL BSA，1％PCR增强剂。
[0021] 所述的人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒在人类个体识别、亲权鉴定以及降解检材识别中的应用。
[0022] 优选的，所述应用的程序为采用聚合酶链式反应扩增InDel位点，并通过毛细管电泳检测扩增产物。
[0023] 有益效果：(1)本发明包含49个分型较均衡的InDel位点和1个性别鉴定基因，采用六色STR荧光检测系统，高于目前已经公开的法医InDel检测试剂盒；(2)本发明包含的49个InDel位点筛选自我国主要民族群体遗传学数据，适用于中国人群的检测；(3)本发明建立的50个位点的扩增体系，扩增片段短，扩增子控制在200bp，适用于高度降解检材的InDel分型；(4)本发明建立的50个位点的扩增体系，提高了降解检材中位点的检出数目；(5)本发明所述的体系中引入的2个Y-InDel位点，能够对性别鉴定基因Amelogenin起到辅助判定的作用。
附图说明
[0024] 图1是由血液滤纸收集的血液样本InDel位点分型图；
[0025] 图2是陈旧骨骼样本InDel位点分型图。
具体实施方式
[0026] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0027] 实施例1
[0028] 一种人类常染色体和Y染色体InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒，所述试剂盒包含47对常染色体InDel位点基因座的特异性扩增引物、2对Y染色体InDel位点基因座的特异性扩增引物以及1对性别鉴定基因的特异性扩增引物；所述InDel位点基因座为：InDel-01(rs3067397)、InDel-02(rs10607699)、InDel-03(rs71852971)、InDel-04(rs67487831)、InDel-05(rs140683187)、InDel-06(rs5787309)、InDel-07(rs34287950)、InDel-08(rs67100350)、InDel-09(rs769299)、InDel-10(rs3076465)、InDel-11(rs67939200)、InDel-12(rs145941537)、InDel-13(rs67264216)、InDel-14(rs35453727)、InDel-15(rs35065898)、InDel-16(rs60575667)、InDel-17(rs66911131)、InDel-18(rs61490765)、InDel-19(rs34419736)、InDel-20(rs34421865)、InDel-21(rs66739142)、InDel-22(rs3029189)、InDel-23(rs33971783)、InDel-24(rs72085595)、InDel-25(rs34529638)、InDel-26(rs11277697)、InDel-27(rs10558392)、InDel-28(rs538690481)、InDel-29(rs140323077)、InDel-30(rs66477007)、InDel-31(rs3834231)、InDel-32(rs145577149)、InDel-33(rs35309403)、InDel-34(rs66595817)、InDel-35(rs1160980)、InDel-36(rs79225518)、InDel-37(rs3217112)、InDel-38(rs67426579)、InDel-39(rs151335218)、InDel-40(rs142221201)、InDel-41(rs34209360)、InDel-42(rs67700747)、InDel-43(rs67365630)、InDel-44(rs35464887)、InDel-45(rs5897566)、InDel-46(rs35267904)、InDel-47(rs67405073)、InDel-48(rs199815934)、InDel-49(rs76041101)，性别鉴定基因为Amelogenin；其中括号中的rs号表示该位点在dbSNP数据库中的编号。
[0029] 上述InDel遗传多态性位点的筛选原则如下：应用VCFtools等生物信息分析软件，分析1000 Genomes Project和其它遗传信息数据库中的人类基因组遗传变异数据，筛选在东亚人群中多态性高的100个左右常染色体InDel、10个左右Y染色体InDel作为候选位点。建立单位点检测体系，使用候选InDel位点分别在10～20个汉族样本中进行分型，进一步筛选出单位点检验中多态性高、检验效果好的47个常染色体InDel位点、2个Y-InDel位点。其中最终筛选到的InDel位点必须符合：1、最低等位基因频率(MAF)0.3-0.5之间，对应的理论平均杂合度(HET)在0.4以上；2、Hardy—Weinberg平衡卡方检验p>0.05；3、intron区域的位点；4、InDel等位基因片段长度差异(插入或缺失的碱基)在3-6bp；5、分散在不同的染色体上且距离在5M以上；6、hg38版基因组以及DBsnp147-common中能找到的位点。
[0030] 所述特异性扩增引物的序列如下：InDel-01、SEQ ID NO.1-2；InDel-02、SEQ ID NO.3-4；InDel-03、SEQ ID NO.5-6；InDel-04、SEQ ID NO.7-8；InDel-05、SEQ ID NO.9-10；InDel-06、SEQ ID NO.11-12；InDel-07、SEQ ID NO.13-14；InDel-08、SEQ ID NO.15-16；
InDel-09、SEQ ID NO.17-18；InDel-10、SEQ ID NO.19-20；InDel-11、SEQ ID NO.21-22；
InDel-12、SEQ ID NO.23-24；InDel-13、SEQ ID NO.25-26；InDel-14、SEQ ID NO.27-28；
InDel-15、SEQ ID NO.29-30；InDel-16、SEQ ID NO.31-32；InDel-17、SEQ ID NO.33-34；
InDel-18、SEQ ID NO.35-36；InDel-19、SEQ ID NO.37-38；InDel-20、SEQ ID NO.39-40；
InDel-21、SEQ ID NO.41-42；InDel-22、SEQ ID NO.43-44；InDel-23、SEQ ID NO.45-46；
InDel-24、SEQ ID NO.47-48；InDel-25、SEQ ID NO.49-50；InDel-26、SEQ ID NO.51-52；
InDel-27、SEQ ID NO.53-54；InDel-28、SEQ ID NO.55-56；InDel-29、SEQ ID NO.57-58；
InDel-30、SEQ ID NO.59-60；InDel-31、SEQ ID NO.61-62；InDel-32、SEQ ID NO.63-64；
InDel-33、SEQ ID NO.65-66；InDel-34、SEQ ID NO.67-68；InDel-35、SEQ ID NO.69-70；
InDel-36、SEQ ID NO.71-72；InDel-37、SEQ ID NO.73-74；InDel-38、SEQ ID NO.75-76；
InDel-39、SEQ ID NO.77-78；InDel-40、SEQ ID NO.79-80；InDel-41、SEQ ID NO.81-82；
InDel-42、SEQ ID NO.83-84；InDel-43、SEQ ID NO.85-86；InDel-44、SEQ ID NO.87-88；
InDel-45、SEQ ID NO.89-90；InDel-46、SEQ ID NO.91-92；InDel-47、SEQ ID NO.93-94；
InDel-48、SEQ ID NO.95-96；InDel-49、SEQ ID NO.97-98；Amelogenin、SEQ ID NO.99～
100。
[0031] 所述特异性扩增引物的浓度如下：InDel-01、0.08μM；InDel-02、0.1μM；InDel-03、0.07μM；InDel-04、0.06μM；InDel-05、0.12μM；InDel-06、0.09μM；InDel-07、0.07μM；InDel-
08、0.07μM；InDel-09、0.11μM；InDel-10、0.09μM；InDel-11、0.08μM；InDel-12、0.05μM；
InDel-13、0.07μM；InDel-14、0.08μM；InDel-15、0.12μM；InDel-16、0.11μM；InDel-17、0.1μM；InDel-18、0.06μM；InDel-19、0.07μM；InDel-20、0.11μM；InDel-21、0.08μM；InDel-22、
0.06μM；InDel-23、0.07μM；InDel-24、0.12μM；InDel-25、0.11μM；InDel-26、0.06μM；InDel-
27、0.08μM；InDel-28、0.08μM；InDel-29、0.07μM；InDel-30、0.09μM；InDel-31、0.05μM；
InDel-32、0.06μM；InDel-33、0.12μM；InDel-34、0.08μM；InDel-35、0.09μM；InDel-36、0.07μM；InDel-37、0.11μM；InDel-38、0.1μM；InDel-39、0.05μM；InDel-40、0.06μM；InDel-41、
0.13μM；InDel-42、0.09μM；InDel-43、0.08μM；InDel-44、0.07μM；InDel-45、0.05μM；InDel-
46、0.06μM；InDel-47、0.1μM；InDel-48、0.11μM；InDel-49、0.09μM；Amelogenin、0.13μM。
[0032] 所述试剂盒中的引物及其序列和浓度如下表所示：
[0033]
[0034]
[0035]
[0036]
[0037] 所述特异性扩增引物的PCR扩增产物长度均小于200bp。
[0038] 所述特异性扩增引物分组及标记如下：荧光染料为6-FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIG；其中6-FAM标记InDel-04、InDel-07、InDel-12、InDel-18、InDel-22、InDel-23、InDel-27、InDel-31、InDel-36、InDel-40和InDel-46；HEX标记InDel-01、InDel-03、InDel-08、InDel-11、InDel-13、InDel-19、InDel-26、InDel-28、InDel-32、InDel-34和InDel-45；TAMRA标记InDel-02、InDel-05、InDel-09、InDel-15、InDel-16、InDel-30、InDel-35、InDel-38、InDel-43、InDel-48；ROX标记InDel-06、InDel-14、InDel-20、InDel-25、InDel-33、InDel-
39、InDel-42、InDel-47、Amelogenin；VIG标记InDel-10、InDel-17、InDel-21、InDel-24、InDel-29、InDel-37、InDel-41、InDel-44、InDel-49。
[0039] 所述试剂盒中含有分子量内标，且分子量内标由橙色荧光SIZ标记。
[0040] 所述试剂盒包括2.5×Reaction Mix，2mL；基因组DNA，10ng；5×引物混合物，1mL；5U/μL的热启动Taq酶，100μL；sdH2O，1.95mL；其中，所述的2.5×Reaction Mix成分为：
7.5mM MgCl2，125mM Tris-HCl(pH8.3)，125mM KCl,7.5mM dNTPs,2mg/mL BSA，1％PCR增强剂。PCR增强剂为海藻糖、浓度低于5％的聚乙二醇、二甲压砜、NP40中的一种。
[0041] 将上述试剂盒用于检测由血液滤纸收集的血迹样本，操作步骤如下：
[0042] 扩增体系：
[0043]组分 体积
Reaction Mix 4.0μL
1.0mm孔径纸片 1片
引物 2.0μL
热启动Taq酶 0.4μL
sdH2O 补足至10.0μL
[0044] 扩增程序：
[0045]
[0046] 扩增产物在遗传分析仪上荧光检测：
[0047] 由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔(0.5μl AGCU Marker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司))×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与本试剂盒中1μl扩增产物混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
[0048] 分型分析：用片段分析软件GeneMapper IDX分析遗传分析仪检测收集的数据。
[0049] 结论：应用本实施例所述试剂盒对常用建库检材样本共计50份。试剂盒的检出率是100％。如图1所示的某血滤纸收集的血迹样本InDel位点分型。
[0050] 实施例2
[0051] 采用实施例1所述的试剂盒检测陈旧骨骼样本。
[0052] 扩增体系：
[0053]
[0054]
[0055] 其中，DNA样本的提取参考《GA/T 383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行，此类样本均由磁珠法提取。
[0056] 扩增程序：
[0057]
[0058] 扩增产物在遗传分析仪上荧光检测：
[0059] 由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔(0.5μl AGCU Marker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司))×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与本试剂盒中1μl扩增产物混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
[0060] 分型分析：用片段分析软件GeneMapper IDX分析遗传分析仪检测收集的数据。
[0061] 结论：应用本发明所述试剂盒对实际案件降解检材样本共计13份。试剂盒的检出率是61.5％。本发明所述试剂盒由于扩增片段更短，在降解的检材中表现较好，如图2所示的陈旧骨骼样本。
