一种落叶松植物离体发生的方法

摘要

本发明提供了一种落叶松植物高效离体发生的方法，具体地，本发明首次发现对落叶松植物实生苗的下胚轴为起始外植体，进行离体繁殖，可诱导出含有许多胚性细胞的愈伤组织，并可进一步高效诱导不定芽的发生,并经过不定芽的伸长、生根及移栽成苗后，可获得大量再生植株表型一致性高、遗传稳定性好的落叶松植物，此外，还可以作为体细胞杂交的亲本之一，进行细胞杂交，可创造不同于原亲本的落叶松新种质。

权利要求

1.一种落叶松植物的繁殖方法，其特征在于，包括步骤：(a)对所述落叶松植物的种子进行萌发处理，从而获得经萌发的种苗；

(b)对所述经萌发的种苗培养n天，其中n为4-20，从而获得经培养的实生苗；

(c)对所述实生苗的下胚轴进行切取，获得下胚轴切段，所述下胚轴切段的长度为1-

6mm；和

(d)对所述的下胚轴切段进行再生，从而获得落叶松植物植株；

在步骤(d)中，包括以下一个或多个独立的子步骤：

(d1)对所述的下胚轴切段进行培养，获得愈伤组织；

(d2)将所述愈伤组织置于含0.05-10mg/l BA和0.01-5mg/l NAA的低氮和/或低NH4+培养基上，于23±1℃培养8-12周，获得原始不定芽，即芽原基；

(d3)将所述带有原始不定芽的愈伤组织置于含0.05-10mg/l BA，0-0.1mg/l TDZ和+

0.01-5mg/lNAA的低氮和/或低NH4培养基上培养6-8周，于23±1℃培养，诱导出形态清晰的不定芽；将所述清晰的不定芽置于含0-6mg/l BA、0-0.6mg/l NAA和0-6mg/l GA3的低氮和/或低NH4+培养基上，于23±1℃培养，4-6周后，得到伸长的不定芽；

(d4)将所述伸长不定芽置于含有0-6mg/l BA、0-0.6mg/l NAA和0-6mg/lGA3的低氮和/或低NH4+培养基上，于22±1℃进行暗培养2-8天；将所述暗培养后的不定芽，去除形态学下端叶片，用5-100mg/l IBA预处理0.2-36h；所述预处理后的不定芽，切除形态学下端茎段，在含0.01-5mg/l IBA的1/2MS培养基中继续培养；所述低氮和/或低NH4+的培养基基于MS培养基的配方，对KNO3、NH4NO3、NH4Cl、和Ca(NO3)2·2H2O的含量进行调整，其他成分不作调整；

所述的“低氮”指所述培养基或培养条件的氮含量NL与MS培养基中氮含量N0之比为

0.35-0.8；

所述的“低NH4+”指所述培养基或培养条件的NH4+含量ML与MS培养基中NH4+含量M0之比为

0.2-0.7。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(d4)中，在1/2MS培养基中继续培养

4-6周，于24±1℃培养诱导得到不定根。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，所述下胚轴切段的长度为1-

5mm。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低氮和/或低NH4+培养基选自下组：第一培养基：KNO3 800mg/l，NH4NO3 600mg/l，NH4Cl 500mg/l，Ca(NO3)2·2H2O 650mg/l；

第二培养基：KNO3 700mg/l，NH4NO3 500mg/l，NH4Cl 400mg/l，Ca(NO3)2·2H2O 450mg/l；

和

第三培养基：KNO3 900mg/l，NH4NO3 700mg/l，NH4Cl 600mg/l，Ca(NO3)2·2H2O 700mg/l。

+

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的“低NH4”指所述培养基或培养条件的NH4+含量ML与MS培养基中NH4+含量M0之比为0.25-0.6。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将步骤(d)获得的植株进行炼苗后，移植入栽培土中培养的步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述栽培土的基质包括泥炭、菜园土、和/或珍珠岩。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述落叶松植物选自下组：日本落叶松、华北落叶松、长白落叶松、云南落叶松、新疆落叶松、日本落叶松×长白落叶松、或其组合。

说明书

一种落叶松植物离体发生的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及落叶松植物栽培领域，具体涉及一种落叶松植物高效离体发生的方法。

背景技术

[0002] 落叶松(Larix Mill)属松科(Pinaceae)落叶松亚科(Laricoideae)，天然分布在北半球温带山区、寒温带的平原及高山气候区。落叶松具有分布广泛、适应性强、病虫害少、材质优良等特点，其早期速生性在所有的针叶树中位居前列，是国营林场和农民都非常重视的造林树种，人工造林面积目益扩大；也是我国东北、西北、华北及南方亚高山地区的重要纸浆材及建筑材树种。但落叶松生长周期较长，有性繁殖后代变异较大，且扦插繁殖生根率很低。组织培养作为落叶松快速无性繁殖的主要途径，存在着很大潜力。因此，开展落叶松的高效离体发生研究具有重要意义。

[0003] 作为基本的技术操作平台，落叶松的离体再生系统具有以下主要用途：

[0004] (1)种苗提供常规方法生产落叶松种子耗时费力，单位时间内生产效率低下，种子园的种子产量受气候与栽培管理方式影响较大，年度间产量极不稳定，种子供应不足，种苗整齐度呈现正态分布。使用高效的离体再生系统，对优良母株进行无性扩繁，为无性系林业育种提供技术支撑。

[0005] (2)品种改良目前，我国主要通过人工引种、良种选育、种间杂交等传统育种方式对落叶松进行遗传改良。虽然在此领域已取得了令人瞩目的进展，然而从技术层面上来说，由于这些传统的育种方式人力、物力耗费较大、受自然条件影响、育种周期长、遗传操作难度大，落叶松育种进程不能满足现代林木遗传育种的需要。

[0006] 因此，本领域迫切需要开发一种新型的、可以实现落叶松植物的大规模种植的高效离体发生的方法。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种新型的、可以实现落叶松植物的大规模种植的高效离体发生的方法。

[0008] 本发明第一方面提供了一种落叶松植物的繁殖方法，包括步骤：

[0009] (a)对所述落叶松植物的种子进行萌发处理，从而获得经萌发的种苗；

[0010] (b)对所述经萌发的种苗培养n天，其中n为4-20，从而获得经培养的实生苗；

[0011] (c)对所述实生苗的下胚轴进行切取，获得下胚轴切段，所述下胚轴切段的长度为1-6mm；和

[0012] (d)对所述的下胚轴切段进行再生，从而获得落叶松植物植株。

[0013] 在另一优选例中，在步骤(b)中，从出苗日当天起培养4-20天。

[0014] 在另一优选例中，所述步骤(b)中，将所述种苗进行培养5-18天，较佳地， 6-16天。

[0015] 在另一优选例中，在步骤(d)中，包括以下一个或多个独立的子步骤：

[0016] (d1)对所述的下胚轴切段进行培养，获得愈伤组织；

[0017] (d2)对所述愈伤组织进行出芽处理，从而获得原始不定芽(即，芽原基)；

[0018] (d3)对所述原始不定芽进行培养，从而获得伸长的不定芽；

[0019] (d4)对所述伸长的不定芽进行生根处理，从而获得落叶松植物植株。

[0020] 在另一优选例中，所述步骤(c)中，所述下胚轴切段的长度为1-5mm，较佳地， 2-4mm。

[0021] 在另一优选例中，所述步骤(b)中，还包括对所述实生苗进行消毒的步骤。

[0022] 在另一优选例中，所述步骤(d)中，所述再生在低氮和/或低NH4+的培养基中进行。

[0023] 在另一优选例中，所述的低氮和/或低NH4+的培养基是基于MS培养基的低氮和/或低NH4+的培养基。

[0024] 在另一优选例中，在所述低氮和/或低NH4+的培养基中，除了氮和/或NH4+之外的其他成分和含量与MS培养基基本相同(例如对于任一其他成分而言，为标准 MS培养基中同一成分含量的约80-130％，较佳地90-120％)。

[0025] 在另一优选例中，所述子步骤(d1)、(d2)、(d3)和/或(d4)的一个或多个(或全部)中，所述再生在低氮、低NH4+的培养基中进行。

[0026] 在另一优选例中，所述的“低氮”指所述培养基或培养条件的氮含量NL与MS 培养基中氮含量N0之比(NL/N0)为0.3-0.9，较佳地0.35-0.8，更佳地0.3-0.6。

[0027] 在另一优选例中，所述的“低NH4+”指所述培养基或培养条件的NH4+含量ML与MS培养基中NH4+含量M0之比(ML/M0)为0.2-0.7，较佳地0.25-0.6，更佳地 0.3-0.5。

[0028] 在另一优选例中，所述步骤(d)中，所述培养基为以MS培养基为基础，且氮含量(浓度)为MS培养基中氮含量的1/4-1/2，较佳地，1/3-1/2。

[0029] 在另一优选例中，所述培养基含有NH4Cl、NH4NO3和KNO3。

[0030] 在另一优选例中，所述步骤(d)或其一个或多个子步骤中，所述培养基中， NH4Cl的浓度为300-650mg/l，较佳地，400-600mg/l。

[0031] 在另一优选例中，所述步骤(d)或其一个或多个子步骤中，所述培养基中， NH4NO3的浓度为400-700mg/l，较佳地，500-650mg/l。

[0032] 在另一优选例中，所述步骤(d)或其一个或多个子步骤中，所述培养基中， KNO3的浓度为600-1000mg/l，较佳地，700-900mg/l。

[0033] 在另一优选例中，所述步骤(d)或其一个或多个子步骤中，所述培养基中，以Ca(NO3)2·2H2O的质量计，Ca(NO3)2·2H2O的浓度为400-800mg/l，较佳地， 500-700mg/l。

[0034] 在另一优选例中，所述步骤(d1)中，将所述下胚轴切段置于含0.08-20 mg/l(较佳地，0.1-10mg/l，更佳地，0.3-8mg/l，最佳地，0.5-3mg/l)BA和0.01-5 mg/l(较佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l，最佳地，0.1-0.5mg/l)NAA的培养基上，于23±1℃培养，所述下胚轴的近子叶端开始膨大，获得愈伤组织。

[0035] 在另一优选例中，所述步骤(d2)中，将所述愈伤组织置于含0.05-10mg/l(较佳地，0.08-8mg/l，更佳地，0.1-5mg/l，)BA和0.01-5mg/l(较佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-
1mg/l)NAA的培养基上，于23±1℃培养8-12周，获得原始不定芽，即芽原基。

[0036] 在另一优选例中，所述步骤(d3)中，将所述带有原始不定芽(即芽原基)的愈伤组织置于含0.05-10mg/l(较佳地，0.08-8mg/l，更佳地，0.1-6mg/l)BA，0-0.1 mg/l(较佳地，0.001-0.08mg/l，更佳地，0.005-0.05mg/l)TDZ和0.01-5mg/l(较佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l)NAA的培养基上培养6-8周，于23 ±1℃培养，诱导出形态清晰的不定芽。

[0037] 在另一优选例中，所述步骤(d4)中，将所述伸长的不定芽置于含有0-6mg/l (较佳地，0.01-3mg/l，更佳地，0.05-1mg/l，最佳地，0.1-0.6mg/l)BA、0-0.6 mg/l(较佳地，0.01-0.5mg/l，更佳地，0.001-0.4mg/l，最佳地，0.002-0.2mg/l) NAA和0-6mg/l(较佳地，0.01-
4mg/l，更佳地，0.05-3mg/l，最佳地，0.1-2mg/l) GA3的培养基上，于22±1℃进行暗培养2-
8天(较佳地3-7天)。

[0038] 在另一优选例中，所述步骤(d4)中，将所述暗培养后的不定芽(较佳地，分离的单株不定芽)，去除形态学下端叶片，用5-100mg/l(较佳地，10-80mg/l，更佳地，20-60mg/l)IBA预处理0.2-36h(较佳地0.5-24h)。

[0039] 在另一优选例中，所述步骤(d4)中，所述预处理后的不定芽(较佳地，分离的单株不定芽)，切除形态学下端茎段，在含0.01-5mg/l(较佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l，最佳地，0.1-0.5mg/l)IBA的1/2MS培养基(其中氮含量和NH4含量减为MS培养基的约1/5至1/4)中继续培养。

[0040] 在另一优选例中，所述步骤(d4)中，所述切除的下端茎段的长度为0.3-5mm，较佳地，0.5-4mm，更佳地，0.6-2mm。

[0041] 在另一优选例中，所述步骤(d4)中，在1/2MS培养基(其中氮含量和NH4含量减为MS培养基的约1/5至1/4)中继续培养4-6周，于24±1℃培养诱导得到不定根。

[0042] 在另一优选例中，所述步骤(d4)中，将获得的不定根培养于25±2℃，培养 1-2周后得到离体再生的落叶松植物植株。

[0043] 在另一优选例中，所述方法还包括将步骤(d)获得的植株进行炼苗后，移植入栽培土中培养的步骤。

[0044] 在另一优选例中，所述栽培土中培养的温度为25±2℃。

[0045] 在另一优选例中，所述栽培土的基质包括泥炭、菜园土、和/或珍珠岩。

[0046] 在另一优选例中，所述泥炭、菜园土、珍珠岩的比例为3:6:1。

[0047] 在另一优选例中，所述落叶松植物选自下组的属：松科属、落叶松属、或其组合。

[0048] 在另一优选例中，所述落叶松植物选自下组：日本落叶松、华北落叶松、长白落叶松、云南落叶松、新疆落叶松、日本落叶松×长白落叶松(杂交落叶松)、或其组合。

[0049] 在另一优选例中，所述步骤(a)中，所述萌发温度为25±1℃。

[0050] 在另一优选例中，所述步骤(a)中，所述萌发时间为5-30天，较佳地，8-20 天，更佳地，7-15天。

[0051] 本发明第二方面提供了一种落叶松植物的繁殖方法，包括步骤：

[0052] (a)将所述落叶松植物的种子进行萌发处理，从而获得经萌发的种苗；

[0053] (b)将所述种苗进行培养4-20天，获得经培养的实生苗；

[0054] (c)对所述实生苗的下胚轴进行切取，获得下胚轴切段，所述下胚轴切段为 1-6mm；

[0055] (d)对所述的下胚轴切段进行培养，获得愈伤组织；

[0056] (e)对所述的愈伤组织进行诱导培养，获得带有不定芽的愈伤组织；和

[0057] (f)将步骤(e)获得的不定芽进行培养，生根获得落叶松植物植株。

[0058] 在另一优选例中，所述步骤(c)中，所述下胚轴切段的长度为1-5mm，较佳地， 2-4mm。

[0059] 在另一优选例中，所述步骤(b)中，还包括对所述实生苗进行消毒的步骤。

[0060] 在另一优选例中，所述步骤(b)中，对所述种苗进行培养5-18天，较佳地， 6-16天。

[0061] 在另一优选例中，所述步骤(d)-(f)的一个或多个(或全部)步骤中，在低氮和 /或低NH4+的培养基中进行培养。

[0062] 在另一优选例中，所述步骤(d)中，将所述下胚轴切段置于含0.08-20mg/l(较佳地，0.1-10mg/l，更佳地，0.3-8mg/l，最佳地，0.5-3mg/l)BA和0.01-5mg/l (较佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l，最佳地，0.1-0.5mg/l)NAA的培养基上，于23±1℃培养，所述下胚轴的近子叶端开始膨大，获得愈伤组织。

[0063] 在另一优选例中，所述步骤(e)包括步骤：

[0064] (e1)将步骤(d)获得的愈伤组织进行培养，获得带有原始不定芽(即芽原基) 的愈伤组织；

[0065] (e2)对步骤(e1)获得的带有原始不定芽(即芽原基)的愈伤组织进行诱导培养，获得不定芽。

[0066] 在另一优选例中，所述步骤(e1)中，将所述愈伤组织置于含0.05-10mg/l(较佳地，0.08-8mg/l，更佳地，0.1-5mg/l，)BA和0.01-5mg/l(较佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-
1mg/l)NAA的培养基上，于23±1℃培养8-12周，获得原始不定芽，即芽原基。

[0067] 在另一优选例中，所述步骤(e2)中，将所述带有原始不定芽(即芽原基)的愈伤组织置于含0.05-10mg/l(较佳地，0.08-8mg/l，更佳地，0.1-6mg/l)BA，0-0.1 mg/l(较佳地，0.001-0.08mg/l，更佳地，0.005-0.05mg/l)TDZ和0.01-5mg/l(较佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l)NAA的培养基上培养6-8周，于23 ±1℃培养，诱导出形态清晰的不定芽。

[0068] 在另一优选例中，所述步骤(f)包括步骤：

[0069] (f1)对所述不定芽进行培养，获得伸长的不定芽；

[0070] (f2)分离步骤(f1)获得的伸长的不定芽，继续培养至生根获得落叶松植物植株。

[0071] 在另一优选例中，所述步骤(f1)中，将所述不定芽置于含有0-6mg/l(较佳地，0.01-3mg/l，更佳地，0.05-1mg/l，最佳地，0.1-0.6mg/l)BA、0-0.6mg/l(较佳地，0.01-
0.5mg/l，更佳地，0.001-0.4mg/l，最佳地，0.002-0.2mg/l)NAA 和0-6mg/l(较佳地，0.01-
4mg/l，更佳地，0.05-3mg/l，最佳地，0.1-2mg/l) GA3的培养基上，于23±1℃培养，4-6周后，得到伸长的不定芽。

[0072] 在另一优选例中，所述步骤(f2)中，将伸长的不定芽置于含有0-6mg/l(较佳地，0.01-3mg/l，更佳地，0.05-1mg/l，最佳地，0.1-0.6mg/l)BA、0-0.6mg/l(较佳地，0.01-
0.5mg/l，更佳地，0.001-0.4mg/l，最佳地，0.002-0.2mg/l)NAA 和0-6mg/l(较佳地，0.01-
4mg/l，更佳地，0.05-3mg/l，最佳地，0.1-2mg/l) GA3的培养基上，于22±1℃进行暗培养，
3-7天。

[0073] 在另一优选例中，所述步骤(f2)中，将所述暗培养后的不定芽(较佳地，分离的单株不定芽)，去除形态学下端叶片，用5-100mg/l(较佳地，10-80mg/l，更佳地，20-60mg/l)IBA预处理0-36h(较佳地0.5-24h)。

[0074] 在另一优选例中，所述步骤(f2)中，所述预处理后的不定芽(较佳地，分离的单株不定芽)，切除形态学下端茎段，在含0.01-5mg/l(较佳地，0.05-3mg/l，更佳地，0.08-1mg/l，最佳地，0.1-0.5mg/l)IBA的1/2MS培养基(其中氮含量和NH4含量减为约1/5至1/4)中继续培养。

[0075] 在另一优选例中，所述步骤(f2)中，所述切除的下端茎段的长度为0.3-5mm，较佳地，0.5-4mm，更佳地，0.6-2mm。

[0076] 在另一优选例中，所述步骤(f2)中，在1/2MS培养基(其中氮含量和NH4含量减为约1/5至1/4)中继续培养4-6周，于24±1℃培养诱导得到不定根。

[0077] 在另一优选例中，所述步骤(f2)中，将获得的不定根培养于25±2℃，培养 1-2周后得到离体再生的完整小植株(即落叶松植物植株)。

[0078] 在另一优选例中，所述方法还包括将步骤(f)获得的植株进行炼苗后，移植入栽培土中培养的步骤。

[0079] 在另一优选例中，所述栽培土中培养的温度为25±2℃。

[0080] 在另一优选例中，所述栽培土的基质包括泥炭、菜园土、和/或珍珠岩。

[0081] 在另一优选例中，所述泥炭、菜园土、珍珠岩的比例为3:6:1。

[0082] 在另一优选例中，所述落叶松植物选自下组的属：松科属、落叶松属、或其组合。

[0083] 在另一优选例中，所述落叶松植物选自下组：日本落叶松、华北落叶松、长白落叶松、云南落叶松、、新疆落叶松、日本落叶松×长白落叶松(杂交落叶松)、或其组合。

[0084] 在另一优选例中，所述步骤(a)中，所述萌发温度为25±1℃。

[0085] 在另一优选例中，所述步骤(a)中，所述萌发时间为5-30天，较佳地，8-20 天，更佳地，7-15天。

[0086] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

[0087] 图1显示了落叶松下胚轴再生体系，其中图A：膨大的下胚轴切断，bar:2 mm。图B：初级胚性愈伤组织，bar:4mm。图C：富含大量芽原基的愈伤组织，bar:6mm。图D：高频同步化丛芽，bar:8mm。图E：伸长的芽苗，bar: 1cm。图F：离体生根的小植株，bar:4cm。

具体实施方式

[0088] 本发明人经过广泛而深入地研究，经过大量筛选，首次以采用特定工艺制备的落叶松植物实生苗的下胚轴切段作为起始外植体，在特定的低氮、低NH4+含量的培养条件下培养，可诱导出含有许多胚性细胞的愈伤组织，并可进一步高效诱导不定芽的发生,并经过不定芽的伸长、生根及移栽成苗后，可获得大量再生植株表型一致性高、遗传稳定性好的落叶松植物。用本发明的培育方法获得的落叶松植物植株，可作为体细胞杂交的亲本之一，进行细胞杂交，从而可高效快速地开发不同于原亲本的落叶松新种质。在此基础上，完成了本发明。

[0089] 培养基

[0090] 本文所用的MS培养基是本领域目前使用最普遍的培养基，Murashige和 Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基(Murashige and Skoog A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant, 1962.15(3):473.)。除非另有说明，采用本领域已知的配方配制MS培养基或MS固体培养基即可。

[0091] 在本发明中，所采用的培养基可在本领域的落叶松植物的常规培养基的基础上进行构建，并同时对常规培养基中的总氮含量进行调节，使得培养基中的总氮含量(浓度)低于常规培养基。

[0092] 优选地，本发明的一类优选的培养基(即落叶松培养基)为低氮和/或低NH4+的培养基。

[0093] 如本文所用，“低氮”指所述培养基或培养条件的氮含量NL与MS培养基中氮含量N0之比(Nl/N0)为0.3-0.9，较佳地0.35-0.8，更佳地0.3-0.6。

[0094] 如本文所用，“低NH4+”指所述培养基或培养条件的NH4+含量ML与MS培养基中NH4+含量M0之比(Ml/M0)为0.2-0.7，较佳地0.25-0.6，更佳地0.3-0.5。

[0095] 在本发明中，所述的低氮和/或低NH4+的培养基可以基于本领域常规的培养基 (如MS培养基、ML培养基)进行配制。

[0096] 典型地，一类特别优选的落叶松培养基是基于MS培养基的低氮和/或低NH4+的培养基。在另一优选例中，在所述低氮和/或低NH4+的培养基中，除了氮和/或 NH4+之外的其他成分和含量与MS培养基基本相同(例如对于任一其他成分而言，为标准MS培养基中同一成分含量的约80-130％，较佳地90-120％)。

[0097] 在本发明中，所述子步骤(d1)、(d2)、(d3)和/或(d4)的一个或多个或全部子步骤中，在低氮、低NH4+的培养基中进行再生。

[0098] 通常，在本发明的培养基中，总氮含量(浓度)为MS培养基中氮含量(浓度) 的1/4-1/2，较佳地，1/3-1/2。此外，K+、Ca2+的浓度与MS培养基中的K+、Ca2+的浓度基本相同，较佳地，以培养基的总重计，K+、Ca2+的浓度为80-120％。

[0099] 在一优选实施方式中，在本发明的培养基中，NH4Cl的浓度为300-650 mg/l，较佳地，400-600mg/l。

[0100] 在一优选实施方式中，在本发明的培养基中，NH4NO3的浓度为400-700 mg/l，较佳地，500-650mg/l。

[0101] 在一优选实施方式中，在本发明的培养基中，KNO3的浓度为600-1000 mg/l，较佳地，700-900mg/l。

[0102] 在一优选实施方式中，在本发明的培养基中，以Ca(NO3)2·2H2O的质量计， Ca(NO3)2·2H2O的浓度为400-800mg/l，较佳地，500-700mg/l。

[0103] 6-苄基腺嘌呤

[0104] 如本文所用，术语“6-苄基腺嘌呤”、“6-苄腺嘌呤”、“6-苯甲基腺嘌呤”、“6-BA”、“苄基腺嘌呤”、“BA”等均可以与互换使用。

[0105] 6-苄基腺嘌呤是一种广谱性植物生长调节剂，可促进植物细胞生长，抑制植物叶绿素、核酸、蛋白质的分解，提高氨基酸的含量，延缓叶片衰老，将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，广泛用在农业、果树和园艺作物的从发芽到收获的各个阶段。

[0106] 本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得6-苄基腺嘌呤，如市场购买或用常规方法制取。

[0107] 赤霉素

[0108] 如本文所用，术语“赤霉素”可以与“GA”、“GA3”互换使用。

[0109] 赤霉素是一类广泛存在的植物激素，化学结构比较复杂，属于二萜类酸，由四环骨架衍生而得。赤霉素都含有赤霉素烷骨架。在高等植物中赤霉素的最近前体一般认为是贝壳杉烯。赤霉素的基本结构是赤霉素烷，有4个环。在赤霉素烷上，由于双键、羟基数目和位置不同，形成了各种赤霉素，已知的赤霉素类至少有38种。不同的赤霉素生物活性不同，赤霉酸(GA3)的活性最高。活性高的化合物必须有一个赤霉环系统(环ABCD)，在C-7上有羧基，在A环上有一个内酯环。

[0110] 赤霉素目前广泛应用于农业生产，如提高葡萄产量，或在杂交水稻制种中调节花期以使父母本花期相遇等；对水稻、棉花、蔬菜、瓜果、绿肥等有显著的增产效果。

[0111] 本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得各种赤霉素，如市场购买或用常规方法制取。一种常规制取赤霉素的方法为用甲醇提取。不同的赤霉素可以用各种色谱分析技术分开。

[0112] 萘乙酸

[0113] 如本文所用，术语“萘乙酸”可以与“NAA”互换使用。

[0114] 萘乙酸是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等。可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。

[0115] 本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得萘乙酸，如市场购买或用常规方法制取。

[0116] IBA

[0117] 如本文所用，术语“IBA”、“吲哚丁酸”可互换使用。

[0118] 吲哚丁酸(IBA)是专性生根激素，并且是一种广谱的吲哚类植物生长调节剂，是良好的生根剂，可促进草本和木本观赏植物插枝的生根。还可用于瓜果的座果，提高座果率。

[0119] 在本发明中，添加IBA的目的与效果是为了促进生根，加快植物的生殖转换。

[0120] 本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得IBA，如市场购买或用常规方法制取。

[0121] TDZ

[0122] 如本文所用，术语“TDZ”、“噻苯隆(thidiazuron)”可互换使用。

[0123] TDZ是一种新型植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性(CTK)，它的 CTK活性要比一般CTK高几十倍至几百倍，研究表明，它可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等。

[0124] 在本发明中，添加TDZ的目的是促进不定芽分化。

[0125] 本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得TDZ，如市场购买或用常规方法制取。

[0126] 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

[0127] 本发明的主要优点包括：

[0128] (1)本发明首次对落叶松植物的直接不定芽离体发生进行了研究，并获得了较高频率的再生植株。

[0129] (2)本发明首次以落叶松植物的实生苗下胚轴为起始外植体，可诱导出含有许多胚性细胞的愈伤组织，并可进一步高效诱导不定芽的发生,并经过不定芽的伸长、生根及移栽成苗后，可获得大量再生植株表型一致性高、遗传稳定性好、遗传保守性高的落叶松植物。

[0130] (3)本发明首次发现本发明的落叶松下胚轴再生体系还可以作为体细胞杂交的亲本之一，进行细胞杂交，可创造不同于原亲本的落叶松新种质。

[0131] (4)本发明的方法可离体快速大量繁殖落叶松植物，重复性好。

[0132] (5)本发明的方法能够在短时间内生产大量的落叶松优质种苗，而且这种种苗的发生不受季节限制，可以常年生产。

[0133] (6)本发明首次使落叶松下胚轴培养成功再生成植株。按本发明的方法重复三次试验，平均每个下胚轴切断能产生再生植株约20-30株，且与亲本表型一致性高，并且不定芽诱导率高(约90％或更高)，生根率高(约95％)，移栽存活率高(约90％或更高)[0134] (7)本发明的落叶松下胚轴再生体系可以用来拯救濒临灭绝的落叶松种质资源。

[0135] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0136] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0137] 除非另有说明，否则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。

[0138] 实施例1

[0139] 落叶松培养基No.1-3的制备

[0140] 配制落叶松植物培养基，基于MS培养基的配方，对KNO3、NH4NO3、NH4Cl、和Ca(NO3)2·2H2O的含量进行调整(如表1所示)，其他成分不作调整。调节pH 值至5.8，121℃灭+菌15-25分钟。从而得到低氮/低NH4的培养基No.1、No.2 和No.3。不定芽的诱导和伸长均使用所述的低氮/低NH4+的培养基(可简称为“落叶松培养基”)。

[0141] 同时将市售的MS培养基作为对照培养基。

[0142] 表1

[0143]

[0144] 实施例2再生植株的制备

[0145] 在本实施例中，对于实施例1中制备的落叶松培养基No.1-3以及对照的 MS培养基，对经特定工艺制备的下胚轴切段(或对照切段材料)进行再生处理。其中，各实验条件下重复三次。具体实验方法如下：

[0146] 实验方法：

[0147] (1)将长白落叶松种子(由东北林业大学提供)用自来水浸泡1周，去除坏死病变的种子。将种子置于湿润的脱脂棉上，种子上覆盖湿透的纱布，28℃温室萌发，注意保湿，10-15天后出苗。

[0148] (2)将出苗7-15天的落叶松实生苗用自来水洗净，吸干表面水珠，在超净工作台上用70％的乙醇消毒30-90秒，0.1％的升汞浸泡5-8分钟，无菌水冲洗 5-8次，无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，将下胚轴切成2-4毫米的切段以备用。(对照材料为10mm的下胚轴切段)[0149] (3)将下胚轴切段接种于附含0.5-3mg/l BA和0.1-0.5mg/l NAA的实施例1所述的培养基中培养7-15天后，下胚轴切断的近子叶端开始膨大(图1，图A)，在此培养基上培养4-6周后，起始外植体基本上被致密的愈伤组织包裹 (图1，图B)。培养条件：光照(60μmol.m-
2.s-1)16h/d培养，培养温度为23 ±1℃。

[0150] (4)将步骤(3)所得的致密的愈伤组织在附含0.5-3mg/l BA和0.1-0.5 mg/l NAA的实施例1所述的培养基上培养8-12周后，基开出现形态模糊的原始不定芽，即芽原基(图1，图C)。光照(60μmol.m-2.s-1)16h/d培养，培养温度为23±1℃，4周继代一次，培养基不变。
继代频次，4周/代。

[0151] (5)将附带原始不定芽的愈伤组织在附含0.5-3mg/l BA，0-0.01mg/l TDZ 和0.1-0.5mg/l NAA的实施例1所述的培养基上培养6-8周后，诱导出形态清晰的不定芽(图1，图D)。光照培养(60μmol.m-2.s-1)16h/d，培养温度为 23±1℃。

[0152] (6)将不定芽转入附含0-0.6mg/l BA、0-0.06mg/l NAA和0-0.6mg/l GA3的实施例1所述的培养基培养4-6周后，不定芽得到有效伸长(图1，图E)，光照(60μmol.m-2.s-1)16h/d，培养温度22±1℃。

[0153] (7)将伸长的芽苗在步骤(5)的培养基中暗培养(22±1℃)3-7天。

[0154] (8)将暗培养后的芽苗分离成单株，剥去小苗形态学下端叶片，用50mg/l IBA预处理0-36h，切除形态学下端1mm茎段后，转入附含0.1-0.5mg/l IBA 的1/2实施例1所述的落叶松培养基(减半的落叶松培养基)中培养4-6周后不定根被诱导出来(图1，图F)。生根培养基附加蔗糖2％，且用0.25％结冷胶 (gelrite)固化。培养条件：光照(80μmol.m-2.s-1)16h/d，培养温度24±1 ℃。

[0155] (9)将步骤(7)所得生根苗连同培养基、培养瓶等一起转入28±2℃、光照  (80μmol.m-2.s-1)16h/d的培养条件下进行耐受培养1-2周后，打开培养瓶盖子，注入10-20ml无菌水或去离子水，炼苗5-8天。

[0156] (10)将生根小苗移栽到泥炭、菜园土和珍珠岩(3∶6∶1)的基质中，在28 ±2℃、自然光照的大棚中生长良好，成为与自然生长小苗一致的落叶松再生植株。

[0157] 实验结果：

[0158] 采用常规的MS培养基(对照培养基)时，采用10mm的下胚轴切段作为植物材料时，无法获得再生的落叶松植株。采用常规的MS培养基(对照培养基)时，即使采用经特定工艺制备的下胚轴切段并分阶段统计，所得到的落叶松的不定芽诱导率仅为20％，生根率仅为10％，移栽存活率为75％。平均每个下胚轴切断仅能产生再生植株≤0.3株。

[0159] 与此相反，采用本发明特定的特定工艺制备的落叶松下胚轴切段并在特定的低氮/低NH4+的培养基(实施例1中的培养基No.1、2或3)，均可大幅提高再生植株的产率。

[0160] 采用2-4mm的下胚轴切段并采用实施例1制备的落叶松培养基No.1、2或 3时，各个培养基中的结果基本相同。对于落叶松植物来说，平均每个下胚轴切断能产生再生植株20-30株(与采用MS培养基对照组相比，提高了约60-90 倍)，且与亲本表型一致性高，并且不定芽诱导率90-92％，生根率约94-96％，移栽存活率90％。与采用MS培养基对照组相比，落叶松培养基组的再生植株形态更优。

[0161] 实施例3

[0162] 本实施例的步骤与实施例2基本相同，不同之处采用华北落叶松种子替换长白落叶松种子。

[0163] 与采用常规的MS培养基(对照培养基)的对照组(平均每个下胚轴切断仅能产生再生植株≤0.3株)相比，采用本发明特定的特定工艺制备的落叶松下胚轴切段并在特定的低氮/低NH4+的培养基(实施例1中的培养基No.1、2或3)，均可大幅提高再生植株的产率。

[0164] 采用2-4mm的下胚轴切段并采用实施例1制备的落叶松培养基No.1、2或 3时，各个培养基中的结果基本相同。对于落叶松植物来说，平均每个下胚轴切断能产生再生植株22-32株(与采用MS培养基对照组相比，提高了约70-96 倍)，且与亲本表型一致性高，并且不定芽诱导率89-92％，生根率约90-95％，移栽存活率约90％。

[0165] 实施例3

[0166] 本实施例的步骤与实施例2基本相同，不同之处采用云南落叶松种子替换长白落叶松种子。

[0167] 与采用常规的MS培养基(对照培养基)的对照组(平均每个下胚轴切断仅能产生再生植株≤0.32株)相比，采用本发明特定的特定工艺制备的落叶松下胚轴切段并在特定的低氮/低NH4+的培养基(实施例1中的培养基No.1、2或3)，均可大幅提高再生植株的产率。

[0168] 采用2-4mm的下胚轴切段并采用实施例1制备的落叶松培养基No.1、2或 3时，各个培养基中的结果基本相同。对于落叶松植物来说，平均每个下胚轴切断能产生再生植株22-28株(与采用MS培养基对照组相比，提高了至少约60 倍)，且与亲本表型一致性高，并且不定芽诱导率约91％，生根率约94％，移栽存活率＞90％。

[0169] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。