DntR突变体及其在邻苯二酚检测中的应用

摘要

本发明公开了DntR突变体及其在邻苯二酚检测中的应用。本发明通过定向改造DntR调控基因，构建较大容量的突变体文库，建立以绿色荧光蛋白为报告基因的生物效应器，并结合流式细胞仪分选的高通量筛选方法，得到邻苯二酚生物感应分子；该生物感应分子可用于检测工业污水处理的排放标准及环境中污染物残留量，还可推广到AP降解关键酶基因定向改造的高通量筛选。

权利要求

1.蛋白质，其氨基酸序列如序列4所示。

2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1）至A8）中的任一种：A1）编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；

A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；

A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1）所述核酸分子为序列3所示的DNA分子。

4.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：所述重组微生物为将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入宿主菌中得到的菌。

5.根据权利要求4所述的相关生物材料，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列3所示的DNA分子。

6.根据权利要求4或5所述的相关生物材料，其特征在于：所述蛋白质的编码基因是通过重组载体导入宿主菌的；

所述重组载体为将序列3所示的DNA分子插入到含有目的基因的表达载体中得到的。

7.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2-6中任一所述的相关生物材料在调节目的基因表达中的应用；所述调节为在邻苯二酚诱导下促进目的基因表达。

8.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2-6中任一所述的相关生物材料在检测待测样品中邻苯二酚含量中的应用。

说明书

DntR突变体及其在邻苯二酚检测中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及DntR突变体及其在邻苯二酚检测中的应用。

背景技术

[0002] 随着工农业生产的迅速发展，越来越多的有毒物质(如重金属和农药)进入水体，对水环境造成严重污染。芳香族污染物(aromatic pollution,AP)在自然界广泛存在，仅次于葡萄糖残基，是工业废水的主要有害成分，一直是环境污染防治领域的研究热点与难点。例如硝基类芳香化合物对人类健康具有非常严重的危害，然而人类的日常生活及生产活动向环境中排放了大量的芳香族化合物，此过程加剧了治理芳香族化合物的难度。芳香族类污水毒性大，环境中残留量多少不均，治理难度极大。利用生物转化处理工业含有芳香族化合物的污水，可以实现将污染物转化为邻苯二酚或水杨酸，从而实现污水的资源化再利用，符合绿色-低碳-循环经济的发展路线。残留的芳香族化合物在环境中经过复杂的物理、化学和生物转化过程，又会形成新的污染物，一些污染物还可能进人食物链并在生物体内蓄积，最终对生物产生各种各样的毒性效应，对生态环境有着破坏性的影响，因此找到一种可灵敏检测并且能消除污染物的代谢机制，对于治理人们担心的在密集使用与制造此类污染物的周围土壤及地下水的污染状况，显得尤为重要。

[0003] 微生物对环境中存在的芳香族类污染物的生物修复，由于投资少、占地小又不需特殊设备，并且安全、残留少已成为最有前途且应用前景十分广阔的治理方法。研究表明，微生物通过调整其自身的适应性，从而可利用具有不同化学结构，携带不同侧链或官能基团的化合物如苯、苯酚、苯胺、萘、蒽等作为细菌的碳源，目前已经报道分离出几种能降解硝基甲苯和硝基苯类芳香族化合物的细菌和真菌。在微生物的好氧降解过程中，几乎所有的芳香族化合物被不同程度地氧化为小分子化合物，一般是重要的化工中间体原料----邻苯二酚和水杨酸，其中邻苯二酚和水杨酸结构类似，并且可互相转化。

[0004] 在芳香族类化合物的微生物降解过程中，邻苯二酚和水杨酸是主要的代谢中间产物，也是重要的化工中间体原料；水杨酸在水杨酸羟化酶作用下会生成邻苯二酚。芳香族类污染物降解基因簇的诱导物一般是降解的底物或降解的中间产物。目前微生物降解芳香类污染物的研究中，在基因转录调控的方式及启动子序列的结构特点的研究上取得了很大进展。目前已有多种调控蛋白被改造后，其诱导物的种类和特异性可以改变。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

[0006] 本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质：

[0007] a)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；

[0008] b)在序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

[0009] c)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

[0010] 本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。

[0011] 本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

[0012] A1)编码上述蛋白质的核酸分子；

[0013] A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

[0014] A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

[0015] A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

[0016] A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

[0017] A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

[0018] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

[0019] A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

[0020] A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

[0021] A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

[0022] A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

[0023] A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

[0024] 上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：

[0025] 1)其编码序列是序列3所示的cDNA分子或DNA分子；

[0026] 2)其编码序列是序列7所示的cDNA分子或DNA分子；

[0027] 3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

[0028] 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

[0029] 上述相关生物材料中，所述重组微生物为将上述蛋白质的编码基因导入宿主菌中得到的菌。

[0030] 上述相关生物材料中，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列3所示的DNA分子或序列7所示的DNA分子。

[0031] 上述相关生物材料中，所述蛋白质的编码基因是通过重组载体导入宿主菌的；

[0032] 所述重组载体为将序列7所示的DNA分子插入到含有目的基因的表达载体中得到的.

[0033] 上述相关生物材料中，所述重组载体具体为将序列7所示的DNA分子插入pRk载体的NdeI和NcoI酶切位点间，且保持pRk载体的其他序列不变，得到的载体；

[0034] 所述宿主菌为BW25113菌株。

[0035] 本发明的另一个目的是提供上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。

[0036] 本发明提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在调节目的基因表达中的应用。

[0037] 上述应用中，所述调节为在邻苯二酚诱导下促进目的基因表达。

[0038] 上述应用中，所述目的基因为GFP基因。

[0039] 上述蛋白质或上述相关生物材料在检测待测样品中邻苯二酚含量中的应用也属于本发明的保护范围。

[0040] 本发明通过定向改造DntR调控基因，构建较大容量的突变体文库，建立以绿色荧光蛋白为报告基因的生物效应器，并结合流式细胞仪分选的高通量筛选方法，得到邻苯二酚生物感应分子；该生物感应分子可用于检测工业污水处理的排放标准及环境中污染物残留量，还可推广到AP降解关键酶基因定向改造的高通量筛选。

附图说明

[0041] 图1为DntR、Pdnt、dntR的PCR产物。1:阴性对照；2-4:OverLapPCR产物；M1:1kb Marker；5-8:dntR PCR；产物9-14:Pdnt。

[0042] 图2为重组质粒载体pDntR的构建。

[0043] 图3为重组质粒pDntR验证。1：pDntR(Pdnt4-1)重组质粒；2：Pdnt4-1PCR扩增；3：Pdnt4-1(NdeI+HindIII)双酶切；4：1kbMarker；5： 2KpLusMarker。

[0044] 图4为重组质粒pDntR不同处理下荧光信号值。

[0045] 图5为突变体预筛选荧光信号值。

[0046] 图6为突变体文库第五轮流式细胞仪分析结果。

[0047] 图7为突变体文库第五轮荧光信号值结果。

[0048] 图8为潜在突变体响应值及本底荧光值。图8A为样品潜在突变体与WT加入诱导剂邻苯二酚与不加诱导剂的的比值；图8B为本底荧光值是指潜在突变体不加诱导剂与WT不加诱导剂的比值。

[0049] 图9为突变体c5-5、WT和lib0对邻苯二酚的诱导倍数比较。

具体实施方式

[0050] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0051] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0052] 下述实施例中的BW25113菌株在文献“Grenier,F.,Matteau,D.,Baby,V.,and Rodrigue,S.Complete Genome Sequence of Escherichia coli BW25113.(2014)Genome announcements 2”中公开过，公众可从中国农业科学院研究生院获得。

[0053] 下述实施例中的DH10B菌株在文献“Durfee,T.,Nelson,R.,Baldwin,S.,Plunkett,G.,3rd,Burland,V.,Mau,B.,Petrosino,J.F.,Qin,X.,Muzny,D.M.,Ayele,M.,Gibbs,R.A.,Csorgo,B.,Posfai,G.,Weinstock,G.M.,and Blattner,F.R.The complete genome sequence of Escherichia coli DH10B:insights into the biology of a laboratory workhorse.(2008)Journal of bacteriology 190,2597-2606”中公开过，公众可从中国农业科学院研究生院获得。

[0054] 实施例1、DntR突变体DntR-c5-5的获得

[0055] 一、突变体文库的构建

[0056] 1、pDntR重组质粒的构建

[0057] (1)以pUC57-saLR为模板，采用带有限制酶切位点的引物dntR-for-NcoI和dntR-rev进行PCR扩增，得到PCR扩增产物1，即为dntR基因序列；

[0058] (2)以pUC57-saLR为模板，采用引物pdnt-for和pdnt-rev-NdeI进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2，即为Pdnt启动子；

[0059] (3)将PCR扩增产物1和PCR扩增产物2按摩尔质量比1：1混合，并将其作为模板，采用上游引物dntR-for-NcoI和下游引物pdnt-rev-NdeI重叠交错延伸扩增，得到OverLapPCR产物，即为DntR调控基因的全长序列。图1为扩增产物的电泳图。

[0060] (4)用限制性内切酶NdeI和NcoI对OverLapPCR产物和pRk载体(pRk载体的核苷酸序列如序列5所示，该载体的多克隆位点区域内融合了增强型绿色荧光蛋白基因eGFP，受阿拉伯糖诱导)酶切，连接，构建pDntR重组质粒(图2)，并对其进行测序验证。

[0061] 测序结果表明：pDntR重组质粒为将序列6所示的DNA分子插入pRk载体的NdeI和NcoI酶切位点间，且保持pRk载体的其他序列不变，得到的载体。其中序列6的第1-906位为DntR基因序列。

[0062] (5)重组质粒pDntR验证

[0063] 将步骤(4)获得的重组质粒pDntR转化至BW25113菌株，涂布抗性(kan 50μg/mL)平板，挑取单克隆培养，提取质粒DNA，用限制性酶NdeI和NcoI进行双酶切鉴定。

[0064] 结果如图3所示：酶切后可得到一条大小约为1.0kb的小片段和一条4.8kb的长片段；以重组质粒为模板，利用引物dntR-for-NcoI和pdnt-rev-NdeI PCR扩增可得到1.05kb的DntR调控基因全长序列；双向测序验证DNA序列没有突变。结果证明pDntR构建成功。

[0065] 2、pDntR重组质粒荧光信号值的检测

[0066] 重组质粒pDntR是在报告基因eGFP上游插入DntR调控基因及其调控启动子Pdnt，进而形成由转录调控基因为主要元件，可受诱导剂诱导下游基因表达的生物效应器。当重组质粒pDntR受阿拉伯糖和诱导剂水杨酸同时处理，会形成级联放大体系使报告基因eGFP高效表达，其荧光信号可借助酶标仪被检测分析；当重组质粒pDntR没有诱导剂诱导，只有阿拉伯糖存在时，报告基因eGFP本底表达。

[0067] (1)菌液的制备

[0068] 将重组质粒pDntR导入BW25113菌株得到重组菌pDntR/BW25113，将其命名为WT，将WT按照体积比为1％的比例转接至新鲜LB液体培养基(Kan 50μg/mL)，再加入诱导剂，按照是否加入诱导剂分为如下三组进行处理：

[0069] 第一组(WT)：将WT和LB液体培养基混匀，得到反应体系；

[0070] 第二组(WT+阿拉伯糖)：将WT、阿拉伯糖和LB液体培养基混匀，得到反应体系，阿拉伯糖在反应体系中的浓度为1mM；

[0071] 第三组(WT+阿拉伯糖+水杨酸)：将WT、阿拉伯糖及水杨酸混匀，得到反应体系，阿拉伯糖在反应体系中的浓度为1mM，水杨酸在反应体系中的浓度为1mM。

[0072] (2)酶标仪荧光信号值检测

[0073] 分别将上述步骤(1)制备的各组反应体系37℃，220rpm培养10小时，离心收集菌体，用无菌PBS缓冲液重悬两次，各取200μL加入96微孔酶标板内，设PBS缓冲液作为双阴对照，其中将重组质粒pDntR设为野生型WT；用TECAN酶标仪分别检测菌液吸光值及绿色荧光蛋白信号值。

[0074] 结果如图4所示：(WT+阿拉伯糖+水杨酸)的荧光信号值明显高于(WT+阿拉伯糖)组和(WT)组。加入诱导剂水杨酸后，重组质粒pDntR的荧光信号强度远高于对照。证明重组质粒pDntR功能正确，可用于下一步试验。

[0075] 3、DntR突变体文库构建及突变丰度验证

[0076] (1)DntR突变体基因克隆

[0077] 参照简并引物的设计原则，设计带有突变位点且有互补末端的两对引物F1-for/F1-rev和F2-for/F2-rev，以重组质粒pDntR为模板，PCR扩增带有突变位点的DNA片段F1(218bp)和F2(100bp)。切胶回收F1和F2片段，以F3-for/F3-rev为引物采用重叠交错延伸的方法融合扩增F3片段(285bp)，最终得到DntR基因突变体全长序列。

[0078] (2)MegaWhop PCR扩增

[0079] 将重叠交错延伸PCR扩增得到的DntR突变全长基因进行琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收，核酸浓度定量，并以此作为大片段引物(megaprimer)，以重组质粒pDntR为模板，采用Megaprimer PCR of WhoLe pLasmid的方法构建DntR突变体文库，得到MegawhopPCR产物。并对Megawhop PCR产物甲基化处理，得到甲基化处理的Megawhop PCR产物。

[0080] (3)突变体文库丰度验证

[0081] 将甲基化处理的Megawhop PCR产物过柱纯化回收，42℃热激转化至甲基化感受态细胞(DMT ChmeicaLLy Comptent Cell)，随机挑选20个单克隆子，测序分析突变丰度，与野生型菌株相比，阳性率达80％，出现11种突变类型；因此构建成的DntR突变体文库可以进行后续实验。

[0082] (4)DntR突变体文库构建

[0083] A、将突变丰度达到理想的MegawhopPCR产物分别稀释至10ng/μL、20ng/μL、35ng/μL、50ng/μL、100ng/μL五个稀释度，以0.1ng/μL pUC18标准质粒作为模板，分别转化至感受态细胞DH10B菌株，比较转化效率确定最佳转化浓度。最佳浓度为20ng/μL。

[0084] B、按最佳浓度将Megawhop PCR产物进行电击转化。电击后，快速往电击杯中加入700μLLB液体培养基，稍混匀，吸入1.5mL离心管中，37℃150rpm复苏1小时。

[0085] C、取复苏好的培养物1μL、10μL加入100μLLB混匀，分别涂布相应抗性平板，37℃倒置过夜培养。第二天，计算转化效率并统计转化克隆子数目。

[0086] (5)突变体数量富集

[0087] A、构建突变体文库采用的方法是定点随机突变，根据目的基因的保守氨基酸序列，设计简并引物引入突变位点，简并度为NNS，则理论的突变体数目为106。因为每个克隆子内只含一个质粒DNA，为了筛选到理想突变体，突变体克隆子数目至少需达到106。

[0088] B、将数目达到预期的多代突变体克隆子活化，提取其质粒DNA，作好标记；分别取每一代的质粒DNA约20ng，混合到一个离心管内。

[0089] C、多次实验优化电击转化条件，终定为20ng质粒电击转化至BW25113感受态细胞，转化效率达到最好；

[0090] D、取出长满突变克隆子的平板，用灭菌的LB培养基，刮菌至离心管内，加入终浓度为20％的甘油。将克隆数目至106的富集突变体菌株命名为Lib0(突变体文库)，-70℃分装保存。待下一步突变体筛选使用。

[0091] 二、突变体文库的筛选

[0092] 1、突变体文库的预筛选

[0093] (1)菌液的处理

[0094] 分别将WT和Lib0按照体积比为1％的比例转接至新鲜LB液体培养基(50μg/mL Kan)，再加入诱导剂，按照是否加入诱导剂分为如下四组进行处理：

[0095] 第一组(Lib0-(阿拉伯糖))：将Lib0、阿拉伯糖和LB液体培养基混匀，得到反应体系；

[0096] 第二组(Lib0-(阿拉伯糖+水杨酸))：将Lib0、阿拉伯糖、水杨酸和LB液体培养基混匀，得到反应体系，阿拉伯糖在反应体系中的浓度为1mM；水杨酸在反应体系中的浓度为1mM；

[0097] 第三组(WT-(阿拉伯糖))：将WT、阿拉伯糖和LB液体培养基混匀，得到反应体系，阿拉伯糖在反应体系中的浓度为1mM；

[0098] 第四组(WT-(阿拉伯糖+水杨酸))：将WT、阿拉伯糖、水杨酸和LB液体培养基混匀，得到反应体系，阿拉伯糖在反应体系中的浓度为1mM，水杨酸在反应体系中的浓度为1mM。

[0099] (2)酶标仪荧光信号值检测

[0100] 将上述步骤(1)中的各组菌液12000rpm离心10min，弃上清，用2mL PBS缓冲液重悬菌体，各取200uL分别检测OD600和荧光信号值。

[0101] 结果如图5所示，从图5可看出：加入诱导剂水杨酸后，Lib0和WT的荧光信号值均高于对照；并且WT-(阿拉伯糖+水杨酸)高于Lib0-(阿拉伯糖+水杨酸)。

[0102] (3)流式细胞仪检测

[0103] 将上述步骤(1)中的各组菌液稀释至104cfu/mL，用流式细胞仪分析，比较诱导剂处理的样品与对照之间荧光信号值的差异，进而确定突变体文库的质量。

[0104] 结果如图6所示：当只有阿拉伯糖存在时，WT和Lib0本底荧光信号比例各占14.0％和14.2％，说明eGFP正常本底表达；当诱导剂水杨酸和阿拉伯糖均存在时，诱导产生的强荧光信号细胞在WT和Lib0中各占比例为96％和51.3％；诱导后突变体文库的荧光信号强度弱于WT，但相比未添加诱导剂水杨酸，Lib0诱导产生的强荧光信号细胞提高了37.1％，结果与酶标仪测定的荧光信号值结果一致。

[0105] 综上所述：突变体文库构建成功，可用于下一步邻苯二酚感应分子的研制。

[0106] 2、突变体文库筛选

[0107] (1)菌液的处理

[0108] 分别将WT和Lib0按照体积比为1％的比例转接至新鲜LB液体培养基(Kan50μg/mL)，再加入诱导剂，按照是否加入诱导剂分为如下三组进行处理：

[0109] 第一组(WT)：将WT、阿拉伯糖和LB液体培养基混匀，得到反应体系；阿拉伯糖在反应体系中的浓度为1mM；

[0110] 第二组(Lib0)：将Lib0、阿拉伯糖和LB液体培养基混匀，得到反应体系；阿拉伯糖在反应体系中的浓度为1mM；

[0111] 第三组(Lib0+邻苯二酚)：将Lib0、阿拉伯糖、邻苯二酚和LB液体培养基混匀，得到反应体系；阿拉伯糖在反应体系中的浓度为1mM，邻苯二酚在反应体系中的浓度为1mM。

[0112] (2)流式细胞仪筛选

[0113] 将上述各组菌液稀释至流式细胞仪可测范围104-105cfu/mL。首先调试流式细胞仪，再用校准好的仪器进行样品分析，分选实验。主要依据以下原则进行筛选：首先不加诱导剂，去除Lib0-本底表达产生的荧光信号较强的10％，分选得到的细胞作为Lib0+；再次转接处理，分选诱导产生的强荧光信号细胞部分的1％，标注为Lib1；此为一轮筛选。依次类推，进行五轮阴阳性筛选后，纯化出单克隆子进行潜在突变体功能验证。

[0114] 突变体文库第五轮荧光信号值结果如图7所示：其中，C-lib5-为第二组菌液经过5轮诱导后得到的菌株，C-lib5+为第三组菌液经过5轮诱导后得到的菌株，结果表明：邻苯二酚作为诱导物诱导突变体文库，随着诱导代数的递增，突变体文库中受诱导剂诱导的阳性细胞比例逐代提升。

[0115] 3、潜在正向突变体筛选

[0116] 将第五轮分选得到的细胞C-Lib5+抗性平板内涂布，纯化出邻苯二酚诱导单克隆子18株，将纯化得到的单克隆子转接处理，先进行荧光信号值初步筛选，选取相对荧光值高于WT的克隆子。

[0117] 克隆子的荧光值分析结果如图8所示：从图8A可看，样品C5-16、C5-18、C5-5及C5-15的荧光信号比值高于WT；从图8B可看，正向突变体只有C5-5和C5-15，但是C5-5的荧光信号比值及除去本底荧光信号值的荧光强度均好于C5-15。因此选取C5-5作为正向突变体，将其命名为突变体C5-5并对其进行测序。

[0118] 测序结果表明：突变体C5-5的DntR基因序列如序列表中序列3所示，将序列3所示的基因命名为DntR-c5-5基因，DntR-c5-5基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示，将其命名为DNTR-C5-5。DNTR-C5-5蛋白的氨基酸序列为将序列2所示的DNTR蛋白的第151位氨基酸由L突变为I，第153位氨基酸由L突变为P，第206位氨基酸由H突变为T，第230位氨基酸由I突变为T后得到的序列。

[0119] DntR-c5-5基因的核苷酸序列为将序列1所示的DntR基因的第451位由T突变为A，第453位由G突变为C，第457位由C突变为T，第459位由T突变为C，第575位由C突变为G，第616位由C突变为A，第617位由A突变为C，第618位由C突变为G，第689位由T突变为C，第690位由T突变为C后，且保持序列1的其他序列不变得到的序列。

[0120] 三、突变菌株C5-5

[0121] 本实施例中的突变体C5-5也可将DntR-c5-5基因和GFP基因导入BW25113菌株中，且保持BW25113菌株基因组的其他序列不变获得。

[0122] DntR-c5-5基因和GFP基因是通过重组载体pDntR’导入BW25113菌株；

[0123] 重组质粒pDntR’为将序列7所示的DNA分子插入含有GFP基因的pRk载体的NdeI和NcoI酶切位点间，且保持pRk载体的其他序列不变，得到的载体。

[0124] 重组质粒pDntR’为将重组质粒pDntR中的DntR基因的第451位由T突变为A，第453位由G突变为C，第457位由C突变为T，第459位由T突变为C，第575位由C突变为G，第616位由C突变为A，第617位由A突变为C，第618位由C突变为G，第689位由T突变为C，第690位由T突变为C，且保持其他序列不变得到的质粒。

[0125] 野生型菌株WT为将DntR基因和GFP基因导入BW25113菌株得到重组菌。

[0126] DntR基因和GFP基因是通过重组载体pDntR导入BW25113菌株；

[0127] 重组质粒pDntR为将序列6所示的DNA分子插入含有GFP基因的pRk载体的NdeI和NcoI酶切位点间，且保持pRk载体的其他序列不变，得到的载体。

[0128] 实施例2、DntR-c5-5基因在邻苯二酚诱导下促进目的基因表达中的应用[0129] 本实施例中的突变体C5-5为实施例1的三中获得的突变体。

[0130] 本实施例中的Lib0为实施例1中的步骤一的3中的(5)制备的克隆数目至106的富集突变体文库。

[0131] 本实施例中的WT为实施例1的三中获得的野生型菌株WT。

[0132] 1、分组

[0133] 将突变体C5-5、WT和Lib0分别于抗性培养基(50μg/mL Kan)中进行活化，然后分别将活化后的突变体C5-5、WT和Lib0按照体积比为1％的比例转接至新鲜LB液体培养基(50μg/mL Kan)，再加入诱导剂，按照诱导剂的不同分为如下6组：

[0134] A、将突变体C5-5、邻苯二酚、阿拉伯糖和LB液体培养基混匀，得到反应体系；

[0135] B、将WT、邻苯二酚、阿拉伯糖和LB液体培养基混匀，得到反应体系；

[0136] C、将Lib0、邻苯二酚、阿拉伯糖和LB液体培养基混匀，得到反应体系；

[0137] D、将突变体C5-5、水杨酸、阿拉伯糖和LB液体培养基混匀，得到反应体系；

[0138] E、将WT、水杨酸、阿拉伯糖和LB液体培养基混匀，得到反应体系；

[0139] F、将Lib0、水杨酸、阿拉伯糖和LB液体培养基混匀，得到反应体系；

[0140] 上述各反应体系均以无水乙醇为对照处理；其中诱导剂浓度为0、10μM、200μM、500μM、1000μM五个梯度，阿拉伯糖在反应体系中的浓度均为1μM。一式三个平行，37℃，220rpm培养10小时，分别得到培养物。

[0141] 2、荧光信号值检测

[0142] 分别取出培养物，各取200μL菌液检测OD600下吸光值，保证菌液浓度一致的原则下，取OD600值等同的菌液，12000rpm离心10min，去干净上清，取1mLPBS重悬菌体，再次离心，去上清，加入2mL已过滤的PBS，待检测荧光强度。将不同处理的样品，各取200μL加入荧光酶标板内，激发波长488nm，发射波长530nm，Gain值60的条件下，使用TECAN酶标仪检测荧光信号值并计算诱导倍数。诱导倍数＝添加诱导物的荧光信号值/未添加诱导物的荧光信号值。

[0143] 荧光信号值的检测结果如图9所示：在邻苯二酚诱导下，与导入未突变蛋白DNTR的野生型菌(WT)相比，导入突变蛋白DNTR-C5-5蛋白的突变体C5-5中GFP表达量提高，表明突变体C5-5对邻苯二酚的诱导倍数明显高于WT和Lib0，因此，与未突变蛋白DNTR相比，突变蛋白DNTR-C5-5蛋白在邻苯二酚诱导可以促进下游基因GFP的表达。

[0144] 从图9来看，诱导剂为邻苯二酚，浓度低至10μM时，样品WT、Lib0和C5-5的灵敏度接近1.0，其中突变体C5-5略高于WT及Lib0，由此可见突变体C5-5响应邻苯二酚的最低浓度为10μM；当邻苯二酚浓度为500μM时，诱导倍数达到最大，且高于WT将近1.6倍。