本发明公开了一株高产4‑乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的异常毕氏酵母菌及其应用，其中异常毕氏酵母菌的分类命名为Pichia anomala GJYL08，已于2015年3月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015109。本发明的异常毕氏酵母菌能在高粱糖化液培养基中大量生长，28℃、120rpm条件下摇瓶培养72h可获得12.48mg/L的4‑乙烯基愈创木酚、3.6g/L乙酸乙酯。
1.一株高产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的异常毕氏酵母菌，其特征是：所述异常毕氏酵母菌的分类命名为异常毕氏酵母(Pichia anomala)GJYL08，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2015109，保藏日期为2015年3月13日；
所述异常毕氏酵母菌来源于安徽古井贡酒股份有限公司的中高温大曲。
2.根据权利要求1所述的高产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的异常毕氏酵母菌，其特征是：所述异常毕氏酵母的形态学特征是：形态为球状，直径2.0～4.0μm，利用龙胆二糖、α-D-葡萄糖、D-半乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、D-松三糖、6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖、蔗糖、松二糖、D-木糖、D-脯氨酸、γ-氨基丁酸、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、丙三醇、麦芽糖醇、水杨苷、甲基-β-D-葡糖苷或熊果苷作为碳源。
3.根据权利要求1所述的高产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的异常毕氏酵母菌，其特征是：所述异常毕氏酵母菌在YT板中培养72h时，与标准菌株库中的毕氏酵母菌相似性为
4.根据权利要求1所述的高产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的异常毕氏酵母菌，其特征是：所述异常毕氏酵母菌在45℃下生长，在乙醇浓度10％的YPD液态培养基中生长。
5.一种权利要求1～4中任意一项所述的高产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的异常毕氏酵母菌的应用，其特征在于：所述异常毕氏酵母菌用于液态发酵法生产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯；具体是按如下步骤进行：(1)菌种活化
挑取保藏于YPD斜面试管中的异常毕氏酵母菌单菌落，并接种于含有YPD培养基的培养皿中，26～30℃培养24～48h，获得活化的单菌落；
用接种环挑取所述活化的单菌落1～2环接种于高粱糖化液培养基中，26～30℃、100～
所述高粱糖化液培养基的制备方法为：将高粱粉碎，与水按质量比1:4～8混合后，90～
120℃蒸煮糊化60～90min，待温度降到60～100℃时加入占高粱质量的0.5％～4％的淀粉酶，保温水解1～3h，待温度降到40～70℃时加入占高粱质量的0.5％～4％的糖化酶，保温糖化1～2h，用纱布过滤，调整滤液糖度为10～16°BX，即获得高粱糖化液培养基；
以所述菌悬液作为菌种，按接种量1％～10％接种于高粱糖化液培养基中，26～30℃、
100～200rpm摇床震荡培养72h～120h，得到成熟的发酵液，在所述发酵液中富含4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯。
一株高产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的异常毕氏酵母菌及
其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的异常毕氏酵母菌。
背景技术
[0002] 4-乙烯基愈创木酚又名乙烯基愈创木酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、对乙烯基愈创木酚，分子式为C9H10O2，分子量150Da，无色或淡黄色油状液体，呈发酵香气，略带甜味，微带酚的气息，是决定白酒、葡萄酒、酱油、茶叶、咖啡、干酪等食品品位及质量的一个主要香味成分，同时还是日化、医药、香精合成等行业不可多得的高档香料之一。目前化学合成法是生产4-乙烯基愈创木酚的常用方法，随着人们对绿色产品要求的日益提高，利用生物技术生产4-乙烯基愈创木酚的方法因具有产品绿色天然、安全可靠、反应条件温和、环境污染小等优点而受到人们的重视。中国专利关于4-乙烯基愈创木酚的生物制备法均是以芽孢杆菌为实验菌株，以酵母菌特别是以毕氏酵母菌为菌株进行4-乙烯基愈创木酚的发酵法生产未见报道。如CN201310413429.9中是以一种环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚。
[0003] 产酯酵母，也称生香酵母，具有较强的氧化性能和产酯能力，是白酒产香的主要菌种之一。白酒是一种含有丰富香味物质的蒸馏酒，酯类在白酒的香味形成中有特别重要的作用。目前，国家严禁在成品酒中添加香味成分以丰富酒体，鼓励酒厂通过发酵过程的调控来增加酒体香味成分，因此如何提高白酒中酯类的含量，是白酒生产者普遍关注的问题。
[0004] 我国是白酒生产大国，随着菌种筛选、诱变等技术的成熟，我国各地区先后筛选出了上千种产酯量较高的菌株或产酒精量较高的菌株。中国专利CN201310102392.8中公开了一株异常威克汉姆酵母HJY-006在最佳工艺条件下培养65h乙酸乙酯含量达到50.2mg/100mL；中国专利CN201310191489.0公布了一种高耐受性产酯酵母菌株，该菌株以小麦糖化液作为产酯培养基静止培养后乙酸乙酯含量可达3.903g/L。这是目前专利报道的较高产酯水平。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一株可同时高产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的异常毕氏酵母菌，同时提供利用该异常毕氏酵母菌以高粱糖化液为培养基液态发酵生产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的方法。
[0006] 本发明涉及的毕氏酵母菌的分类命名为异常毕氏酵母(Pichia anomala)GJYL08，已于2015年3月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2015109，保藏地址是中国.武汉.武汉大学。
[0007] 上述Pichia anomala GJYL08菌株，其形态学特征是：形态为球状，直径2.0～4.0μm，可利用龙胆二糖、α-D-葡萄糖、D-半乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、D-松三糖、6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖、蔗糖、松二糖、D-木糖、D-脯氨酸、γ-氨基丁酸、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、丙三醇、麦芽糖醇、水杨苷、甲基-β-D-葡糖苷或熊果苷作为碳源。
[0008] 上述Pichia anomala GJYL08菌株在YT板中培养72h时，与Biolog数据库中的Pichia anomala菌株的相似性为0.928，位距为1.028。
[0009] 上述Pichia anomala GJYL08菌株的26S rDNA序列与其它多株异常毕氏酵母菌(Wickerhamomyces anomalus P42B001、Pichia anomala Y92205、Pichia anomala Y92203)(的26S rDNA序列有98％的相似性。
[0010] 上述Pichia anomala GJYL08菌株来源于安徽古井贡酒股份有限公司的中高温大曲，可在45℃YPD高粱糖化液培养基中生长，可在乙醇浓度10％的YPD液态培养基中生长。
[0011] 上述Pichia anomala GJYL08菌株可用于液态发酵法生产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯。所用培养基为高粱糖化液培养基，其制备方法为：将高粱粉碎，与水按质量比1:4～8混合后，90～120℃蒸煮糊化60～90min，待温度降到60～100℃时加入占高粱质量的0.5％～4％的淀粉酶，保温水解1～3h，待温度降到40～70℃时加入占高粱质量的0.5％～4％的糖化酶，保温糖化1～2h，用纱布过滤，调整滤液糖度为10～16°BX，即获得高粱糖化液培养基。
[0012] 上述Pichia anomala GJYL08菌，用于生产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的具体步骤为：
[0013] (1)菌种活化
[0014] 挑取保藏于YPD斜面试管中的异常毕氏酵母菌单菌落，并接种于含有YPD培养基的培养皿中，26～30℃培养24～48h，获得活化的单菌落；
[0015] (2)菌悬液制备
[0016] 用接种环挑取所述活化的单菌落1～2环接种于高粱糖化液培养基中，26～30℃、100～200rpm培养12～48h，获得菌悬液；
[0017] (3)发酵液制备
[0018] 以所述菌悬液作为菌种，接种量为1％～10％，接种于高粱糖化液培养基中，26～30℃、100～200rpm摇床震荡培养72h～120h，得到成熟的发酵液，在所述发酵液中富含4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯。
[0019] 本发明的有益效果体现在:
[0020] 本发明提供了一株新的可同时用于发酵产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的毕氏酵母菌，为规模化利用微生物发酵法生产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯提供了新的菌株资源和研究方向。
附图说明
[0021] 图1为Pichia anomala GJYL08菌株在YPD培养基中培养48h的菌落形态；
[0022] 图2为Pichia anomala GJYL08菌株放大400倍显微镜下照片。
具体实施方式
[0023] 以下实施例用于进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0024] 实施例1Pichia anomala GJYL08菌株的筛选
[0025] 1)取一定量的安徽古井贡酒股份有限公司的中高温大曲，粉碎后过40目筛，加入盛有玻璃珠的适量无菌生理盐水中，在30℃、120rpm摇床上震荡30min，制成菌悬液；将此菌悬液梯度稀释后涂布于孟加拉红培养基中，在28℃条件下培养48h。
[0026] 2)挑取平板上长出的典型酵母菌菌落进行描述性记录，并同时制片镜检，从中选择不同类型的酵母菌菌落分别接种于灭菌后的YPD培养基(葡萄糖2g，胰蛋白胨2g，酵母膏1g，蒸馏水100mL，pH5.0～5.5，115℃灭菌20min)中，于28℃培养48h。纯化直至得到该菌株的单菌落，作为初筛菌株。
[0027] 3)取不同类型的酵母菌株，分别于25℃高粱糖化液培养基中培养72h，测定其发酵液中4-乙烯基愈创木酚、乙酸乙酯含量，筛选高产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的菌株。
[0028] 4)将得到的最佳菌株保藏于YPD斜面试管中。
[0029] 由生理生化鉴定实验表明，通过上述实验得到的最佳菌株形态为球状，直径2.0～4.0μm，可利用龙胆二糖、α-D-葡萄糖、D-半乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、D-松三糖、6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖、蔗糖、松二糖、D-木糖、D-脯氨酸、γ-氨基丁酸、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、丙三醇、麦芽糖醇、水杨苷、甲基-β-D-葡糖苷或熊果苷，在YT板中培养72h时与Biolog数据库中的Pichia anomala菌株的相似性为0.928，位距为1.028。
[0030] 该菌株命名为Pichia anomala GJYL08，已于2015年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2015109。
[0031] 实施例2Pichia anomala GJYL08菌株的液态发酵
[0032] 1)菌种活化：挑取保藏于YPD斜面试管中的Pichia anomala GJYL08单菌落，接种于含有YPD培养基的培养皿中，26℃培养32h，获得活化的单菌落；
[0033] 2)菌悬液制备：挑取以上活化的单菌落2环接种于糖度为10°BX的高粱糖化液培养基中，26℃、120rpm培养24h，获得菌悬液；
[0034] 3)发酵液制备：将上述菌悬液作为菌种，按接种量5％，接种于糖度为12°BX的高粱糖化液培养基中，28℃、120rpm培养72h得到成熟的发酵液。经测试，所得发酵液中4-乙烯基愈创木酚浓度达到13.48mg/L、乙酸乙酯浓度达到3.6g/L。
[0035] 实施例3Pichia anomala GJYL08菌株的液态发酵
[0036] 按实施例2相同的方式进行发酵，区别仅在于步骤3)是在28℃、120rpm下培养120h得到成熟的发酵液。经测试，所得发酵液中4-乙烯基愈创木酚浓度达到16.48mg/L、乙酸乙酯浓度达到4.2g/L。
