一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂及其制备方法

摘要

本发明提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂及其制备方法，该制剂包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，所述原料主要由以下重量份数的成分制成：祖师麻提取物10‑60份、丹参提取物10‑50份、狗脊提取物10‑40份。本发明提供的第一注射剂能够直接用于面部整容手术中的填充材料，软骨细胞的注射能够重建软骨组织，有效降低排出率，适宜的生长环境为软骨细胞的分化和增殖提供了基础，提高了软骨细胞的植活率，降低患者在隆鼻或颅面修复过程中的痛苦，缩短了手术周期，可以广泛应用在诸如颅面损伤、软骨支架再造、修补模样缺损、耳鼻喉科喉成形、鼻整形等手术中。

权利要求

1.一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，其特征在于，包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述原料0.25-1.25mg、所述辅料I0.5-1.5mg、所述软骨细胞1×105-108个，所述原料主要由以下重量份数的成分制成：祖师麻提取物10-60份、丹参提取物10-50份、狗脊提取物10-40份；

所述辅料I主要由以下重量份数的成分制备而成：羟丙基甲基纤维素1-3份、蔗糖脂肪酸酯4-8份、乳酸2-4份。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，其特征在于，制备所述原料还包括以下重量份数的成分：布渣叶提取物3-8份、白茅根提取物10-15份、醉鱼草提取物8-

12份。

3.如权利要求1所述的间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，其特征在于，所述软骨细胞制剂还包括第二注射剂，所述第二注射剂主要由透明质酸、海藻多糖、磷脂酰胆碱、D-丙氨酸和辅料II通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述透明质酸0.5-1mL、所述海藻多糖0.8-1.25mg、所述磷脂酰胆碱0.2-0.5mg、所述D-丙氨酸0.2-0.4mg、所述辅料II0.5-1mg。

4.如权利要求3所述的间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，其特征在于，制备所述第二注射剂还包括免疫球蛋白、泡桐提取物、香青兰提取物、人参提取物，每mL所述注射用水中含有所述免疫球蛋白50-70U、泡桐提取物0.1-0.2mg、香青兰提取物0.1-0.3mg、人参提取物

0.1-0.3mg。

5.如权利要求3所述的间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，其特征在于，所述辅料II主要由以下重量份数的成分制成：十二烷基氨基丙酸钠3-8份、甲酸钙2-4份、脱氢醋酸钠1-4份。

6.一种权利要求1所述的间充质干细胞来源的软骨细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1、使用脂肪间充质干细胞诱导分化得到的软骨细胞；

S2、制备原料：按照重量份数分别称取10-60份的祖师麻提取物、10-50份的丹参提取物、10-40份的狗脊提取物，并将上述成分均匀混合，制备形成原料；

S3、同时称取辅料I和步骤S2中制备的所述原料，并取步骤S1中所述的软骨细胞，将所述辅料I、所述原料和所述软骨细胞加入至注射用水中，在60-70℃的环境下充分搅拌溶解；

S4、加入步骤S3中溶液总质量2％的活性炭，在60-70℃的环境下保温20-30min，过滤，过滤后调节pH至5.5-7.5，即得到注射液；

S5、将步骤S4中制得的所述注射液进行灌装、压塞、轧盖即得到间充质干细胞来源的软骨细胞制剂。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述使用脂肪间充质干细胞诱导分化得到的软骨细胞的方法包括以下步骤：将7×104/ml-1×107/ml的脂肪间充质干细胞接种至盛放有诱导转化培养液的培养板中，将所述培养板置于饱和湿度为60-80％、温度为37℃的培养箱中培养即得到软骨细胞。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述诱导转化培养液主要由转化生长因子-β、胰岛素、妥布霉素、胆钙化醇、转铁蛋白、纤维素通过细胞培养液配置而成，每mL所述细胞培养液含有转化生长因子-β10-15ng、胰岛素50-70U、妥布霉素45-65U、胆钙化醇10-25μg、转铁蛋白5-8mg、纤维素30-45ng。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述细胞培养液主要由葡萄糖酸-δ-内酯、纤粘连蛋白、羧甲基纤维素钠、维生素C通过MEM培养基水溶液配置而成，每mL所述MEM培养基水溶液含有葡萄糖酸-δ-内酯1-3mg、纤粘连蛋白5-8mg、羧甲基纤维素钠0.75-1.5mg、维生素C45-65μg，所述MEM培养基水溶液的浓度为8-12mg/mL。

说明书

一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及药物制剂技术领域，特别涉及一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂及其制备方法。

背景技术

[0002] 随着组织工程材料的发展，越来越多的组织工程材料代替天然生物材料应用于体内移植，同样的，软骨细胞组织工程材料的获取为软骨组织修复开辟了新的道路。目前，以软骨细胞作为移植材料被广泛应用于面部整形美容外科手术领域，例如矫正颅颌面缺损、隆鼻等。

[0003] 整形美容外科是医学科学的重要组成部分。随着物资生活的改善，人们对美的要求越来越高，无论是中国人还是外国人，鼻形不符合美学标准者为数不少。因此，以矫正鼻部不良外观形态的隆鼻术，便成为仅次于重脸术的热门手术，居整形美容手术的第二位。目前临床上所选用的隆鼻填充材料不论是自体或异体、活性或非活性、天然或化学合成，都有一定的优缺点。但对于隆鼻美容术，因排出率较高，远期效果尚难定论，故许多医生主张用自体软骨组织做隆鼻材料，但是受到软骨组织的吸收及取软骨增加受术者痛苦和疤痕等因素的影响，应用同样受到了限制。现有专利公开号CN104922730A公开了一种软骨细胞组织工程材料及其制备方法和用途，该专利中公开使用由软骨细胞及软骨细胞外基质构成的工程材料作为构建软骨组织的应用，该技术方案中有效证明软骨细胞能够用来作为面部整容的材料，但是这种材料不仅市场价格昂贵，而且软骨细胞存活率和增值率较低，移植效果差，培养时间漫长，不易被消费群体接收，为此，急需开发一种排出率低，存活率和增值率较高，能够有效用于面部整容整形手术的间充质干细胞来源的软骨细胞制剂及其制备方法。

发明内容

[0004] 为了解决现有的应用于面部整容材料存在的价格昂贵，排出率较高，使用的软骨组织的吸收及取软骨增加受术者痛苦和疤痕，应用软骨细胞存活率和增值率较低，移植效果差等问题，本发明提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂及其制备方法。

[0005] 本发明具体技术方案如下：

[0006] 本发明提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述原料0.25-1.25mg、所述辅料I0.5-1.5mg、所述软骨细胞1×105-108个，所述原料主要由以下重量份数的成分制成：祖师麻提取物10-60份、丹参提取物10-50份、狗脊提取物10-40份。

[0007] 本发明提供的第一注射剂能够作为填充材料用于美容整形治疗，第一注射剂的原料中含有由脂肪间充质干细胞分化得到的软骨细胞，软骨细胞能够快速建立软骨组织，与人体原位的软骨在组织学和生物学均又很大的相似，排出率较低，能够降低受术者的痛苦，此外，在原料中加入祖师麻提取物、丹参提取物、狗脊提取物，能够有效提高软骨细胞增殖，从而能够使人体软骨组织快速建立，有效降低患者痛苦，该针剂可以应用在诸如颅面损伤、软骨支架再造、修补模样缺损、耳鼻喉科喉成形、鼻整形等手术中。

[0008] 祖师麻提取物由以下方法制备而成：将祖师麻粉碎后用2-3倍重量的乙醇提取2-4次，每次1.5-2h，合并提取液，浓缩至完全干燥得粗提物；将粗提物加5-8倍重量的蒸馏水溶解，离心，取上清液，上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，弃去洗脱液；再用浓度为30-50％乙醇水溶液洗脱，回收洗脱液，浓缩，喷雾干燥，获得祖师麻提取物。

[0009] 丹参提取物和狗脊提取物的制备方法均与祖师麻提取物的制备方法相同。

[0010] 需要说明的是，祖师麻为瑞香科瑞香属植物黄瑞香的根皮及茎皮；丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎；狗脊为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz(L.)J.Sm.的干燥根茎。

[0011] 进一步的，制备所述原料还包括以下重量份数的成分：布渣叶提取物3-8份、白茅根提取物10-15份、醉鱼草提取物8-12份。第一注射剂的原料中加入布渣叶提取物、白茅根提取物、醉鱼草提取物不仅能够提高细胞增殖效率，而且能够起到消炎止痛的效果，显著降低隆鼻患者的痛苦，从而防止鼻整形患者出现空鼻症，此外，这三种成分的加入有效防止整容手术后伤口细菌滋生，起到消炎的作用。

[0012] 布渣叶提取物、白茅根提取物和醉鱼草提取物的制备方法均与祖师麻提取物的制备方法相同。

[0013] 需要说明的是，布渣叶是椴树科植物破布树的干燥叶；白茅根为禾本科植物白茅的根茎；醉鱼草为马钱科醉鱼草属植物，以带根的全草及叶、花入药。

[0014] 进一步的，所述辅料I主要由以下重量份数的成分制备而成：羟丙基甲基纤维素1-3份、蔗糖脂肪酸酯4-8份、乳酸2-4份。辅料中加入的羟丙基甲基纤维素、蔗糖脂肪酸酯、乳酸能够起到防腐杀菌的目的，能够保证第一注射剂的稳定性，延长注射剂的保质期限，防止注射剂在保存期间细菌滋生，有效提高稳定性。

[0015] 进一步的，所述软骨细胞制剂还包括第二注射剂，所述第二注射剂主要由透明质酸、海藻多糖、磷脂酰胆碱、D-丙氨酸和辅料II通过注射用水溶解而成，每mL所述注射用水中含有所述透明质酸0.5-1mL、所述海藻多糖0.8-1.25mg、所述磷脂酰胆碱0.2-0.5mg、所述D-丙氨酸0.2-0.4mg、所述辅料II0.5-1mg。第二注射剂用于手术后恢复期注射，透明质酸可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂，海藻多糖、磷脂酰胆碱和D-丙氨酸的加入，能够促进第一注射剂中软骨细胞的分化和分裂，有效调节细胞增长，辅助透明质酸的吸收，有效提高术后皮肤弹性，防止衰老。

[0016] 进一步的，制备所述第二注射剂还包括免疫球蛋白、泡桐提取物、香青兰提取物、人参提取物，每mL所述注射用水中含有所述免疫球蛋白50-70U、泡桐提取物0.1-0.2mg、香青兰提取物0.1-0.3mg、人参提取物0.1-0.3mg。第二注射剂中加入免疫球蛋白、泡桐提取物、香青兰提取物、人参提取物，能够提高软骨细胞的免疫力，降低细胞病死率，同时降低手术后病人的痛苦，起到消炎止痛的作用。

[0017] 进一步的，所述辅料II主要由以下重量份数的成分制成：十二烷基氨基丙酸钠3-8份、甲酸钙2-4份、脱氢醋酸钠1-4份。辅料II中加入十二烷基氨基丙酸钠、甲酸钙和脱氢醋酸钠能够起到灭菌效果，有效保证了第二注射剂的有效性，防止注射液细菌滋生，影响药效。

[0018] 本发明还提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

[0019] S1、使用脂肪间充质干细胞诱导分化得到的软骨细胞；

[0020] S2、制备原料：按照重量份数分别称取10-60份的祖师麻提取物、10-50份的丹参提取物、10-40份的狗脊提取物，并将上述成分均匀混合，制备形成原料；

[0021] S3、同时称取辅料I和步骤S2中制备的所述原料，并取步骤S1中所述的软骨细胞，将所述辅料I、所述原料和所述软骨细胞加入至注射用水中，在60-70℃的环境下充分搅拌溶解；

[0022] S4、加入步骤S3中溶液总质量2％的活性炭，在60-70℃的环境下保温20-30min，过滤，过滤后调节pH至5.5-7.5，即得到注射液；

[0023] S5、将步骤S4中制得的所述注射液进行灌装、压塞、轧盖即得到间充质干细胞来源的软骨细胞制剂。

[0024] 进一步的，步骤S1中，所述脂肪间充质干细胞分化得到的软骨细胞的方法包括以下步骤：将7×104/ml-1×107/ml的脂肪间充质干细胞接种至盛放有诱导转化培养液的培养板中，将所述培养板置于饱和湿度为60-80％、温度为37℃的培养箱中培养即得到软骨细胞。

[0025] 进一步的，所述诱导转化培养液主要由转化生长因子-β、胰岛素、妥布霉素、胆钙化醇、转铁蛋白、纤维素通过细胞培养液溶解而成，每mL所述细胞培养液含有所述转化生长因子-β10-15ng、所述胰岛素50-70U、所述妥布霉素45-65U、所述胆钙化醇10-25μg、所述转铁蛋白5-8mg、所述纤维素30-45ng。

[0026] 进一步的，所述细胞培养液主要由葡萄糖酸-δ-内酯、纤粘连蛋白、羧甲基纤维素钠、维生素C通过MEM培养基水溶液配置而成，每mL所述MEM培养基水溶液含有所述葡萄糖酸-δ-内酯1-3mg、所述纤粘连蛋白5-8mg、所述羧甲基纤维素钠0.75-1.5mg、所述维生素C45-65μg，所述MEM培养基水溶液的浓度为8-12mg/mL。

[0027] 通过诱导转化培养液能够有效诱导脂肪间充质干细胞分化成为软骨细胞，分化效率较高，且分化后的软骨细胞表型稳定，体外培养的成活率较高。

[0028] 本发明的有益效果如下：本发明提供的第一注射剂能够直接用于面部整容手术中的填充材料，软骨细胞的注射能够重建软骨组织，有效降低排出率，适宜的生长环境为软骨细胞的分化和增殖提供了基础，提高了软骨细胞的植活率，进而提高了手术的成功几率，手术过程更加安全，降低患者在隆鼻或颅面修复过程中的痛苦，与现有技术相比，缩短了手术周期，可以广泛应用在诸如颅面损伤、软骨支架再造、修补模样缺损、耳鼻喉科喉成形、鼻整形等手术中。

附图说明

[0029] 图1为软骨细胞制剂在加速试验中时间-细菌污染率的线条图；

[0030] 图2为软骨细胞制剂在长期试验中时间-细菌污染率的线条图。

具体实施方式

[0031] 下面结合附图和以下实施例对本发明作进一步详细说明。

[0032] 实施例1

[0033] 本发明实施例1提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述原料0.25mg、所述辅料I0.5mg、所述软骨细胞1×105个，所述原料主要由以下重量克数的成分制成：

[0034] 祖师麻提取物          0.075mg

[0035] 丹参提取物            0.0875mg

[0036] 狗脊提取物            0.0875mg。

[0037] 实施例2

[0038] 本发明实施例2提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述原料1.25mg、所述辅料I1.5mg、所述软骨细胞1×108个，所述原料主要由以下重量克数的成分制成：

[0039] 祖师麻提取物          0.125mg

[0040] 丹参提取物            0.625mg

[0041] 狗脊提取物            0.500mg。

[0042] 一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

[0043] S1、使用脂肪间充质干细胞诱导分化得到的软骨细胞；

[0044] S2、制备原料：按照重量克数分别称取0.125mg的祖师麻提取物、0.625mg的丹参提取物、0.500mg狗脊提取物，并将上述成分均匀混合，制备形成原料；

[0045] S3、同时称取辅料I和步骤S2中制备的所述原料，并取步骤S1中所述的软骨细胞，将所述辅料I、所述原料和所述软骨细胞加入至注射用水中，在60℃的环境下充分搅拌溶解；

[0046] S4、加入步骤S3中溶液总质量2％的活性炭，在60℃的环境下保温20min，过滤，过滤后调节pH至5.5，即得到注射液；

[0047] S5、将步骤S4中制得的所述注射液进行灌装、压塞、轧盖即得到间充质干细胞来源的软骨细胞制剂。

[0048] 所述脂肪间充质干细胞分化得到的软骨细胞的方法包括以下步骤：将7×104/ml的脂肪间充质干细胞接种至盛放有诱导转化培养液的培养板中，将所述培养板置于饱和湿度为60％、温度为37℃的培养箱中培养即得到软骨细胞。

[0049] 所述诱导转化培养液主要由转化生长因子-β、胰岛素、妥布霉素、胆钙化醇、转铁蛋白、纤维素通过细胞培养液配置而成，每mL所述细胞培养液含有转化生长因子-β10ng、胰岛素50U、妥布霉素45U、胆钙化醇10μg、转铁蛋白5mg、纤维素30ng。

[0050] 所述细胞培养液主要由葡萄糖酸-δ-内酯、纤粘连蛋白、羧甲基纤维素钠、维生素C通过MEM培养基水溶液配置而成，每mL所述MEM培养基水溶液含有葡萄糖酸-δ-内酯1mg、纤粘连蛋白5mg、羧甲基纤维素钠0.75mg、维生素C45μg，所述MEM培养基水溶液的浓度为8mg/mL。

[0051] 实施例3

[0052] 本发明实施例3提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述原料0.85mg、所述辅料I1.0mg、所述软骨细胞1×107个，所述原料主要由以下重量克数的成分制成：

[0053]

[0054] 该制剂的制备方法与实施例2相同。

[0055] 实施例4

[0056] 本发明实施例4提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述原料1.0mg、所述辅料I0.8mg、所述软骨细胞1×106个，所述原料主要由以下重量克数的成分制成：

[0057]

[0058] 一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

[0059] S1、使用脂肪间充质干细胞诱导分化得到的软骨细胞；

[0060] S2、制备原料：按照重量克数分别称取0.15mg的祖师麻提取物、0.10mg的丹参提取物、0.40mg的狗脊提取物、0.08mg的布渣叶提取物、0.15mg的白茅根提取物、0.12mg的醉鱼草提取物，并将上述成分均匀混合，制备形成原料；

[0061] S3、同时称取辅料I和步骤S2中制备的所述原料，并取步骤S1中所述的软骨细胞，将所述辅料I、所述原料和所述软骨细胞加入至注射用水中，在65℃的环境下充分搅拌溶解；

[0062] S4、加入步骤S3中溶液总质量2％的活性炭，在65℃的环境下保温25min，过滤，过滤后调节pH至6.0，即得到注射液；

[0063] S5、将步骤S4中制得的所述注射液进行灌装、压塞、轧盖即得到间充质干细胞来源的软骨细胞制剂。

[0064] 所述脂肪间充质干细胞分化得到的软骨细胞的方法包括以下步骤：将3×105/ml的脂肪间充质干细胞接种至盛放有诱导转化培养液的培养板中，将所述培养板置于饱和湿度为70％、温度为37℃的培养箱中培养即得到软骨细胞。

[0065] 所述诱导转化培养液主要由转化生长因子-β、胰岛素、妥布霉素、胆钙化醇、转铁蛋白、纤维素通过细胞培养液配置而成，每mL所述细胞培养液含有转化生长因子-β12ng、胰岛素60U、妥布霉素55U、胆钙化醇20μg、转铁蛋白6mg、纤维素40ng。

[0066] 所述细胞培养液主要由葡萄糖酸-δ-内酯、纤粘连蛋白、羧甲基纤维素钠、维生素C通过MEM培养基水溶液配置而成，每mL所述MEM培养基水溶液含有葡萄糖酸-δ-内酯2mg、纤粘连蛋白6mg、羧甲基纤维素钠1.0mg、维生素C55μg，所述MEM培养基水溶液的浓度为10mg/mL。

[0067] 实施例5

[0068] 本发明实施例5提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述原料1.2mg、所述辅料I1.5mg、所述软骨细胞1×105个，所述原料主要由以下重量克数的成分制成：

[0069]

[0070] 该制剂的制备方法与实施例4相同。

[0071] 实施例6

[0072] 本发明实施例6在实施例1的基础上进一步提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述原料0.25mg、所述辅料I0.5mg、所述软骨细胞1×105个，所述原料主要由以下重量克数的成分制成：

[0073] 祖师麻提取物          0.125mg

[0074] 丹参提取物            0.625mg

[0075] 狗脊提取物            0.500mg；

[0076] 所述辅料I主要由以下重量克数的成分制备而成：

[0077] 羟丙基甲基纤维素      0.05mg

[0078] 蔗糖脂肪酸酯          0.3mg

[0079] 乳酸                  0.15mg。

[0080] 该制剂的制备方法与实施例2相同。

[0081] 实施例7

[0082] 本发明实施例7在实施例2的基础上进一步提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述原料1.25mg、所述辅料I1.5mg、所述软骨细胞1×108个，所述原料主要由以下重量克数的成分制成：

[0083] 祖师麻提取物          0.125mg

[0084] 丹参提取物            0.625mg

[0085] 狗脊提取物            0.500mg；

[0086] 所述辅料I主要由以下重量克数的成分制备而成：

[0087] 羟丙基甲基纤维素      0.3mg

[0088] 蔗糖脂肪酸酯          0.6mg

[0089] 乳酸                  0.6mg。

[0090] 一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

[0091] S1、使用脂肪间充质干细胞诱导分化得到的软骨细胞；

[0092] S2、制备原料：按照重量克数分别称取0.125mg的祖师麻提取物、0.625mg的丹参提取物、0.500mg的狗脊提取物，并将上述成分均匀混合，制备形成原料；

[0093] S3、同时称取辅料I和步骤S2中制备的所述原料，并取步骤S1中所述的软骨细胞，将所述辅料I、所述原料和所述软骨细胞加入至注射用水中，在70℃的环境下充分搅拌溶解；

[0094] S4、加入步骤S3中溶液总质量2％的活性炭，在70℃的环境下保温30min，过滤，过滤后调节pH至7.5，即得到注射液；

[0095] S5、将步骤S4中制得的所述注射液进行灌装、压塞、轧盖即得到间充质干细胞来源的软骨细胞制剂。

[0096] 所述脂肪间充质干细胞分化得到的软骨细胞的方法包括以下步骤：将1×107/ml的脂肪间充质干细胞接种至盛放有诱导转化培养液的培养板中，将所述培养板置于饱和湿度为80％、温度为37℃的培养箱中培养即得到软骨细胞。

[0097] 所述诱导转化培养液主要由转化生长因子-β、胰岛素、妥布霉素、胆钙化醇、转铁蛋白、纤维素通过细胞培养液配置而成，每mL所述细胞培养液含有转化生长因子-β15ng、胰岛素70U、妥布霉素65U、胆钙化醇25μg、转铁蛋白8mg、纤维素45ng。

[0098] 所述细胞培养液主要由葡萄糖酸-δ-内酯、纤粘连蛋白、羧甲基纤维素钠、维生素C通过MEM培养基水溶液配置而成，每mL所述MEM培养基水溶液含有葡萄糖酸-δ-内酯3mg、纤粘连蛋白8mg、羧甲基纤维素钠1.5mg、维生素C65μg，所述MEM培养基水溶液的浓度为12mg/mL。

[0099] 实施例8

[0100] 本发明实施例8提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述原料1.25mg、所述辅料I1.0mg、所述软骨细胞1×108个，所述原料主要由以下重量克数的成分制成：

[0101] 祖师麻提取物          0.125mg

[0102] 丹参提取物            0.625mg

[0103] 狗脊提取物            0.500mg；

[0104] 所述辅料I主要由以下重量克数的成分制备而成：

[0105] 羟丙基甲基纤维素       0.3mg

[0106] 蔗糖脂肪酸酯           0.5mg

[0107] 乳酸                   0.2mg。

[0108] 该制剂的制备方法与实施例7相同。

[0109] 实施例9

[0110] 本发明实施例9在实施例1的基础上进一步限定了所述软骨细胞制剂还包括第二注射剂，所述第二注射剂主要由透明质酸、海藻多糖、磷脂酰胆碱、D-丙氨酸和辅料II通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述透明质酸0.5mL、所述海藻多糖0.8mg、所述磷脂酰胆碱0.2mg、所述D-丙氨酸0.2mg、所述辅料II0.5mg。

[0111] 实施例10

[0112] 本发明实施例10在实施例1的基础上进一步限定了所述软骨细胞制剂还包括第二注射剂，所述第二注射剂主要由透明质酸、海藻多糖、磷脂酰胆碱、D-丙氨酸和辅料II通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述透明质酸1mL、所述海藻多糖1.25mg、所述磷脂酰胆碱0.5mg、所述D-丙氨酸0.4mg、所述辅料II1mg。

[0113] 实施例11

[0114] 本发明实施例11在实施例1的基础上进一步限定了所述软骨细胞制剂还包括第二注射剂，所述第二注射剂主要由透明质酸、海藻多糖、磷脂酰胆碱、D-丙氨酸、辅料II、泡桐提取物、香青兰提取物和人参提取物通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述透明质酸0.8mL、所述海藻多糖1.0mg、所述磷脂酰胆碱0.3mg、所述D-丙氨酸0.3mg、所述辅料II0.8mg、所述免疫球蛋白50U、泡桐提取物0.1mg、香青兰提取物0.1mg、人参提取物0.1mg。

[0115] 实施例12

[0116] 本发明实施例12在实施例10的基础上进一步限定了所述软骨细胞制剂还包括第二注射剂，所述第二注射剂主要由透明质酸、海藻多糖、磷脂酰胆碱、D-丙氨酸、辅料II、泡桐提取物、香青兰提取物和人参提取物通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述透明质酸1mL、所述海藻多糖1.25mg、所述磷脂酰胆碱0.5mg、所述D-丙氨酸0.4mg、所述辅料II1mg、所述免疫球蛋白70U、泡桐提取物0.2mg、香青兰提取物0.3mg、人参提取物0.3mg。

[0117] 实施例13

[0118] 本发明实施例13在实施例9的基础上进一步限定了所述软骨细胞制剂还包括第二注射剂，所述第二注射剂主要由透明质酸、海藻多糖、磷脂酰胆碱、D-丙氨酸、辅料II、泡桐提取物、香青兰提取物和人参提取物通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述透明质酸0.5mL、所述海藻多糖0.8mg、所述磷脂酰胆碱0.2mg、所述D-丙氨酸0.2mg、所述辅料II0.5mg、所述免疫球蛋白60U、泡桐提取物0.15mg、香青兰提取物0.2mg、人参提取物0.2mg。

[0119] 实施例14

[0120] 本发明实施例14在实施例9的基础上进一步限定了所述软骨细胞制剂还包括第二注射剂，所述第二注射剂主要由透明质酸、海藻多糖、磷脂酰胆碱、D-丙氨酸和辅料II通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述透明质酸0.5mL、所述海藻多糖0.8mg、所述磷脂酰胆碱0.2mg、所述D-丙氨酸0.2mg、所述辅料II0.5mg；

[0121] 所述辅料II主要由以下重量克数的成分制成：

[0122] 十二烷基氨基丙酸钠        0.15mg

[0123] 甲酸钙                    0.2mg

[0124] 脱氢醋酸钠                0.15mg。

[0125] 实施例15

[0126] 本发明实施例15在实施例10的基础上进一步限定了所述软骨细胞制剂还包括第二注射剂，所述第二注射剂主要由透明质酸、海藻多糖、磷脂酰胆碱、D-丙氨酸和辅料II通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述透明质酸1mL、所述海藻多糖1.25mg、所述磷脂酰胆碱0.5mg、所述D-丙氨酸0.4mg、所述辅料II1mg。

[0127] 所述辅料II主要由以下重量克数的成分制成：

[0128] 十二烷基氨基丙酸钠        0.7mg

[0129] 甲酸钙                    0.2mg

[0130] 脱氢醋酸钠                0.1mg。

[0131] 实施例16

[0132] 本发明实施例16限定了所述软骨细胞制剂还包括第二注射剂，所述第二注射剂主要由透明质酸、海藻多糖、磷脂酰胆碱、D-丙氨酸和辅料II通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述透明质酸1mL、所述海藻多糖1.25mg、所述磷脂酰胆碱0.5mg、所述D-丙氨酸0.4mg、所述辅料II0.8mg。

[0133] 所述辅料II主要由以下重量克数的成分制成：

[0134] 十二烷基氨基丙酸钠        0.24mg

[0135] 甲酸钙                    0.24mg

[0136] 脱氢醋酸钠                0.32mg。

[0137] 对照例1

[0138] 本发明对照例1提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述原料0.25mg、所述辅料I0.5mg、所述软骨细胞1×105个，所述原料主要由以下重量克数的成分制成：

[0139] 祖师麻提取物          0.15mg

[0140] 狗脊提取物            0.10mg。

[0141] 对照例2

[0142] 本发明对照例2提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述原料0.85mg、所述辅料I1.0mg、所述软骨细胞1×107个，所述原料主要由以下重量克数的成分制成：

[0143]

[0144] 该制剂的制备方法与实施例2相同。

[0145] 对照例3

[0146] 本发明对照例3在实施例1的基础上进一步提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述原料0.25mg、所述辅料I0.5mg、所述软骨细胞1×105个，所述原料主要由以下重量克数的成分制成：

[0147] 祖师麻提取物          0.125mg

[0148] 丹参提取物            0.625mg

[0149] 狗脊提取物            0.500mg；

[0150] 所述辅料I主要由以下重量克数的成分制备而成：

[0151] 蔗糖脂肪酸酯          0.3mg

[0152] 乳酸                  0.2mg。

[0153] 该制剂的制备方法与实施例2相同。

[0154] 对照例4

[0155] 本发明对照例4在实施例1的基础上进一步限定了所述软骨细胞制剂还包括第二注射剂，所述第二注射剂主要由透明质酸、海藻多糖和辅料II通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述透明质酸0.5mL、所述海藻多糖0.8mg、所述辅料II0.5mg。

[0156] 对照例5

[0157] 本发明对照例5在实施例1的基础上进一步限定了所述软骨细胞制剂还包括第二注射剂，所述第二注射剂主要由透明质酸、海藻多糖、磷脂酰胆碱、D-丙氨酸、辅料II和人参提取物通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述透明质酸0.8mL、所述海藻多糖1.0mg、所述磷脂酰胆碱0.3mg、所述D-丙氨酸0.3mg、所述辅料II0.8mg、所述免疫球蛋白50U、人参提取物0.1mg。

[0158] 对照例6

[0159] 本发明对照例6在实施例9的基础上进一步限定了所述软骨细胞制剂还包括第二注射剂，所述第二注射剂主要由透明质酸、海藻多糖、磷脂酰胆碱、D-丙氨酸和辅料II通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述透明质酸0.5mL、所述海藻多糖0.8mg、所述磷脂酰胆碱0.2mg、所述D-丙氨酸0.2mg、所述辅料II0.5mg；

[0160] 所述辅料II主要由以下重量克数的成分制成：

[0161] 十二烷基氨基丙酸钠        0.35mg

[0162] 脱氢醋酸钠                0.15mg。

[0163] 对照例7

[0164] 本发明对照例7提供了一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂，包括第一注射剂，所述第一注射剂主要由原料、辅料I、软骨细胞通过注射用水配置而成，每mL所述注射用水中含有所述原料1.25mg、所述辅料I1.5mg、所述软骨细胞1×108个，所述原料主要由以下重量克数的成分制成：

[0165] 祖师麻提取物          0.125mg

[0166] 丹参提取物            0.625mg

[0167] 狗脊提取物            0.500mg。

[0168] 一种间充质干细胞来源的软骨细胞制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

[0169] S1、使用脂肪间充质干细胞诱导分化得到的软骨细胞；

[0170] S2、制备原料：按照重量克数分别称取0.125mg的祖师麻提取物、0.625mg的丹参提取物、0.500mg狗脊提取物，并将上述成分均匀混合，制备形成原料；

[0171] S3、同时称取辅料I和步骤S2中制备的所述原料，并取步骤S1中所述的软骨细胞，将所述辅料I、所述原料和所述软骨细胞加入至注射用水中，在60℃的环境下充分搅拌溶解；

[0172] S4、加入步骤S3中溶液总质量2％的活性炭，在60℃的环境下保温20min，过滤，过滤后调节pH至5.5，即得到注射液；

[0173] S5、将步骤S4中制得的所述注射液进行灌装、压塞、轧盖即得到间充质干细胞来源的软骨细胞制剂。

[0174] 所述脂肪间充质干细胞分化得到的软骨细胞的方法包括以下步骤：将7×104/ml的脂肪间充质干细胞接种至盛放有诱导转化培养液的培养板中，将所述培养板置于饱和湿度为60％、温度为37℃的培养箱中培养即得到软骨细胞。

[0175] 所述诱导转化培养液主要由转化生长因子-β、胰岛素、妥布霉素、纤维素通过细胞培养液溶解而成，每mL所述细胞培养液含有转化生长因子-β10ng、胰岛素50U、妥布霉素45U、纤维素30ng。

[0176] 所述细胞培养液主要由葡萄糖酸-δ-内酯、纤粘连蛋白、羧甲基纤维素钠、维生素C通过MEM培养基水溶液配置而成，每mL所述MEM培养基水溶液含有葡萄糖酸-δ-内酯1mg、纤粘连蛋白5mg、羧甲基纤维素钠0.75mg、维生素C45μg，所述MEM培养基水溶液的浓度为8mg/mL。

[0177] 本发明提供的软骨细胞制剂的临床验证

[0178] 1、检测样品：

[0179] 取本发明实施例1、实施例3、对照例1、对照例2提供的第一注射剂作为试验组，同时取实施例9、实施例11、、对照例4和对照例5提供的第二注射剂作为试验组，选用注射用水为阴性对照组。

[0180] 2、选取27只6周龄雄性胸腺裸鼠，并分为9个试验组，每组3只，试验组1和试验组2均将实施例1提供的第一注射剂注射到小鼠的背部皮下组织中；试验组3和试验组4均将实施例3提供的第一注射剂注射到小鼠的背部皮下组织中；试验组5和试验组6均将对照例1提供的第一注射剂注射到小鼠的背部皮下组织中；试验组7和试验组8均将对照例2提供的第一注射剂注射到小鼠的背部皮下组织中；另外一组作为阴性对照组，将注射用水注射到小鼠的背部皮下组织中，小鼠注射试验注射剂两个小时后，计算30分钟内试验1组、实验3组、实验5组、试验7组和阴性对照组中小鼠的平均扭动次数，根据扭动的次数，使用下列公式计算疼痛抑制率(％)，计算结果如表2所示。

[0181] 公式一：疼痛抑制率(％)＝【(阴性对照组的扭动次数-试验组的扭动次数)/阴性对照组的扭动次数】×100％。

[0182] 3、9个试验组分别注射第一注射剂和注射用水后，48小时注射后，将实施例9、实施例11、、对照例4和对照例5提供的第二注射剂分别注射到试验组2、试验组4、试验组6、试验组8的小鼠的背部皮下组织中，将注射用水注射到阴性对照组的小鼠的背部皮下组织中。

[0183] 4、9个试验组的小鼠均在体外培养38周并不断观察，查看软骨组织的生成情况估算新生软骨组织生成体积，计算结果如表1所示；同时观察小鼠皮肤情况，如表3所示。

[0184] 5、培养38周后，取出软骨组织，切成1-2毫米大小，然后在0.05％的透明质酸酶中消化30分钟。去除上清液，然后使用磷酸盐缓冲夜，内含1％青霉素+链霉素生理盐水溶液清洗。然后在使用0.5％的胶原酶和0.5％胰蛋白酶浸泡2-3小，用流式细胞仪计数检测细胞感染支原体或其他细菌的数量，并计算细胞受到支原体或细菌感染率；结果如下表4所示。

[0185] 表1新生软骨组织生成体积(cm2)

[0186]

[0187] 表2小鼠注射第一注射剂的疼痛抑制率(％)

[0188]

[0189] 由上述表1可知，通过阴性对照例和对照例1相比，本发明实施例1提供的第一注射剂能够促进软骨组织再生，而且能够形成稳定的形态结构，由此可以说明，本发明提供的祖师麻提取物、丹参提取物、狗脊提取物能够促进软骨细胞增殖，从而能够使软骨组织快速建立，三种成分缺少一种将不能达到上述效果；实施例3和对照例3提供的注射剂在实施例1的基础上能够提高软骨组织再生效率，但是注射实施例3的注射剂形成的软骨组织面积大于对照例3，由此可以说明，布渣叶提取物、白茅根提取物、醉鱼草提取物的加入可以进一步提高软骨细胞增殖效率，三种缺少任意一种将达不到上述效果。

[0190] 有上述表2可知，本发明在第一注射剂的原料中加入布渣叶提取物、白茅根提取物、醉鱼草提取物除了能够促进软骨细胞增殖外，还能够有效抑制手术疼痛，且具有消炎的效果，三种成分任意缺少一种将达不到效果。

[0191] 表3小鼠注射第二注射剂后皮肤状况

[0192]

[0193] 由表3可以得出，本发明提供的第二注射剂中加入透明质酸、海藻多糖、磷脂酰胆碱、D-丙氨酸能够改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂，这几种成分中任意缺少一种将达不到上述效果。

[0194] 表4小鼠注射第二注射剂后软骨细胞免疫测试

[0195] 组别 细胞总数量 未感染的细胞数量 感染率试验2组 7.9×105 2.4×105 70％
试验4组 3.2×105 3.0×105 6％
试验8组 4.9×105 3.7×105 25％

[0196] 由表4可以得出，由试验2组和试验8组与试验4组对比可知，本发明实施例11中提供的第二注射剂中加入泡桐提取物、香青兰提取物和人参提取物，能够有效提高软骨细胞的免疫力，三种成分任意缺少一种，将达不到上述效果，细胞感染较高，细胞致死率较高。

[0197] 本发明提供的软骨细胞制剂的稳定性和安全性试验

[0198] 1.加速试验

[0199] 取实施例1、实施例6和对照例3提供的第一注射剂，同时取实施例9、实施例14、和对照例6提供第二注射剂，均在温度20℃-30℃下，相对湿度为75％±5％的条件下放置30天，在试验期间多次取样，检测注射剂的性状、色泽、细菌污染率，结果发现，实施例1与实施例9提供的第一注射剂和第二注射剂均具有沉淀物，颜色明显变深，对照例3和对照例6提供的第一注射剂和第二注射剂均出现浑浊，但没有沉淀物，颜色略有加深，实施例6和实施例14提供的第一注射剂和第二注射剂均无变化，此外，6中注射剂的细菌污染率检测如图1所示，实施例1和实施例9提供的注射剂的细菌污染率在存储15天时，细菌不断滋生且细菌污染率达到了80％以上，对照例3和对照例6提供的注射剂在存储30天时均达到了100％，而实施例6和实施例14提供的注射剂在存储30天时，细菌污染率仅50％。

[0200] 2.长期试验

[0201] 取实施例1、实施例6和对照例3提供的第一注射剂，同时取实施例9、实施例14、和对照例6提供第二注射剂，均在温度2℃-8℃下，相对湿度为30％±10％的条件下放置700天，在试验期间多次取样，检测注射剂的性状、色泽、细菌污染率，结果发现，实施例1与实施例9提供的第一注射剂和第二注射剂随时间的延长均不断出现沉淀物，且颜色随时间的延长逐渐变深，对照例3和对照例6提供的第一注射剂和第二注射剂随时间的延长均出现浑浊，但没有沉淀物，颜色略有加深，实施例6和实施例14提供的第一注射剂和第二注射剂在30天内无任何变化，此外，6中注射剂的细菌污染率检测如图2所示，实施例1和实施例9提供的注射剂的细菌污染率在存储600天时，细菌不断滋生且细菌污染率已达到了100％，对照例3和对照例6提供的注射剂在存储600天时均达到了80％，而实施例6和实施例14提供的注射剂在存储700天时，细菌污染率仅60％。

[0202] 从加速试验和长期试验中可以看出，第一注射剂中含有的羟丙基甲基纤维素、蔗糖脂肪酸酯和乳酸，及第二注射剂中含有的十二烷基氨基丙酸钠、甲酸钙和脱氢醋酸钠，均能够有效提高注射剂的稳定性，且能够有效防止细菌滋生，降低细菌污染率，延长注射剂的保质期，三种成分缺少任意一种均不能达到上述效果。

[0203] 脂肪间充质干细胞分化得到的软骨细胞的分化效率分析

[0204] 1)分组

[0205] 试验组：本发明实施例2和对照例7中提供的诱导转化培养液制成的培养基；

[0206] 对照组：常规添加剂制成的培养基；

[0207] 2)试验方法

[0208] 将等数量的脂肪间充质干细胞分别植入至上述培养基中，根据实施例2和对照例7提供的软骨细胞的诱导分化方法进行软骨细胞的分化培养，培养5、10、15、20天后，采用台盼蓝经典染色法对细胞进行计数，计算分化效率如表5所示。

[0209] 表5软骨细胞体外培养

[0210]

[0211]

[0212] 由表5可以看出，本发明实施例2提供的诱导转化培养液中加入转化生长因子-β、胰岛素、妥布霉素、胆钙化醇、转铁蛋白、纤维素，能够有效提高软骨细胞分化效率，上述几种成分中任意缺少一种均不能达到较高的分化效率。

[0213] 本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。