发酵工艺制备溶菌酶的方法

摘要

本发明涉及发酵工艺制备溶菌酶的方法，包括以下步骤：取液体培养基置于三角瓶中，按1‑10％v/v的接种量接入菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为20‑40℃，150‑300r/min，发酵培养24h后，将发酵液离心去除菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得溶菌酶，所述液体培养基包含葡萄糖、蛋白胨和表面活性剂，所述表面活性剂为浓度比为1:2‑2:1的椰油脂肪酸二乙酰胺和吐温类表面活性剂的混合物。该发酵工艺方法通过优化培养基中表面活性剂的种类和浓度，获得了较高活性的溶菌酶。

权利要求

1.发酵工艺制备溶菌酶的方法，包括以下步骤：取液体培养基置于三角瓶中，按1-10％v/v的接种量接入菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为20-40℃，150-300r/min，发酵培养

24h后，将发酵液离心去除菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得溶菌酶，其特征在于，所述液体培养基包含葡萄糖、蛋白胨和表面活性剂，所述表面活性剂为浓度比为1:2-2:1的椰油脂肪酸二乙酰胺和吐温类表面活性剂的混合物，所述吐温类表面活性剂为吐温80。

2.根据权利要求1所述的制备溶菌酶的方法，其特征在于，所述葡萄糖的浓度为10g/L，所述蛋白胨的浓度为5g/L。

3.根据权利要求1所述的制备溶菌酶的方法，其特征在于，所述椰油脂肪酸二乙酰胺和吐温类表面活性剂的浓度范围均为0.5g/L-2g/L。

4.根据权利要求3所述的制备溶菌酶的方法，其特征在于，所述椰油脂肪酸二乙酰胺的浓度为1g/L，所述吐温类表面活性剂的浓度为0.5g/L。

5.根据权利要求1所述的制备溶菌酶的方法，其特征在于，所述菌体选自灰色链霉菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌或溶杆菌。

6.根据权利要求5所述的制备溶菌酶的方法，其特征在于，所述菌体选自灰色链霉菌S-

35、表皮葡萄球菌K-6-W1、枯草芽孢杆菌K-77或溶杆菌S2-6b。

7.根据权利要求1所述的制备溶菌酶的方法，其特征在于，所述发酵条件为30℃，200r/min。

8.根据权利要求1所述的制备溶菌酶的方法，其特征在于，所述接种量为液体培养基

4％v/v。

说明书

发酵工艺制备溶菌酶的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及发酵工艺制备溶菌酶的方法。

背景技术

[0002] 溶菌酶(Lysozyme)，又称细胞壁水解酶，能专一性地作用于细菌细胞壁肽聚糖分子，能使N-乙酰胞壁酸与乙酰葡萄糖氨之间的β-1,4糖苷键断裂，使细菌细胞壁变得松驰而达到溶解细菌的效果。溶菌酶广泛分布于高等动植物组织及其分泌物、原生动物、昆虫、植物以及各种微生物中。

[0003] 溶菌酶作为人体正常体液及组织中的非特异免疫因子之一，具有多种药理作用，参与机体多种免疫反应，有抗菌、抗病毒的功效，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。它可以改善和增强巨噬细胞吞噬和消化功能，激活白细胞吞噬功能，并能改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少，从而增强机体的抵抗力。溶菌酶能直接水解革兰氏阳性菌，在分泌型免疫球蛋白A、补体的参与下，还能水解革兰氏阴性菌如大肠杆菌等。对耐药性细菌同样具有溶菌作用，而且具有疗效显著和对人体副作用小的特点，因而是一种较为理想的药用酶。溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶作为酶类抗菌药，能参与粘多糖代谢，在配合内服和外用药的同时，可起到强力消炎作用，它还可与各种诱发炎症的酸性物质结合使其失活，并能够增强抗生素和其它药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎、修复组织的目的。

[0004] 溶菌酶是婴儿生长发育必须的抗菌蛋白，在婴儿体内可以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接促进婴儿肠道细菌双歧杆菌增殖，从而促进婴儿胃肠内乳酪蛋白形成微细的凝乳，有利于婴儿消化吸收。溶菌酶还可以促进人工喂养婴儿肠道细菌群的正常化；能够加强对血清灭菌蛋白、γ-球蛋白等体内防疫因子以增加对感染的抵抗力，特别对早产婴儿，有预防体重减轻、预防消化器官疾病、增进体重等功效，所以溶菌酶是婴儿食品、婴儿配方奶粉等的良好添加剂。近年来，我国液态乳制品发展很快，溶菌酶可应用于乳制品中起到防腐的效果，尤其适用于巴氏杀菌奶，有效地延长保存期。由于溶菌酶具有一定的耐高温性能，也可适用于超高温瞬间杀菌奶，添加剂量为300-600ppm。其方法为包装前添加，超高温瞬间杀菌奶也可以在杀菌前添加。新鲜牛乳中有13mg/100mL的溶菌酶，人乳中含量为40mg/mL，在鲜乳或奶粉中加入一定量的溶菌酶，可以起到防腐作用。

[0005] 溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶。在国外，溶菌酶多用于菌体内物质的提取。只要把对敏感的菌体悬液在适当缓冲液中，用溶菌酶处理，再结合使用超声波、冷冻离心等手段就可得到无细胞提取液，进一步精制可得到所需的菌体物质如蛋白质、核酸、酶及活性多肽等，因此生物工业的发展对溶菌酶制剂的需求将与日俱增。

[0006] 目前，市场上见到最多的溶菌酶是蛋清溶菌酶。随着人们生活水平的提高，对溶菌酶的需求量越来越大，单靠从鸡蛋清中提取溶菌酶，很难解决市场供需矛盾。然而，利用微生物生产溶菌酶，成本较低，节省材料，对环境污染较小，容易实现规模化生产，因而开发潜力巨大。另外，由于微生物来源的溶菌酶有明显的溶菌特异性，根据其底物的不同来研究微生物细胞壁结构，溶菌酶又是一种非常有用的生物工具酶。多数微生物溶菌酶对金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌和真菌有溶解作用，而蛋清溶菌酶对以上菌株无明显溶菌作用，近年来，国内外对多种微生物来源的溶菌酶进行了广泛而深入地研究。

[0007] 尽管溶菌酶的来源不同，酶的化学性质差异很大，但是产酶菌的生产最适条件基本相似。在培养基组分中，一般有机氮源优于无机氮源，在培养基中没有有机氮源，会直接影响到溶菌酶的产量。如金黄色葡萄球菌菌株，不可缺少酵母浸膏，否则酶活便显著下降。又如枯草芽孢杆菌菌株，用肉浸膏可提高其酶活。另外，在培养基中添加糖类物质，对酶活性影响很大。有报道表明，在培养金黄色葡萄球菌菌株时，用葡萄糖代替β-甘油磷酸作为碳源，当酶活达到最高峰时，其活性降低非常迅速。在培养枯草芽孢杆菌菌株，葡萄糖有抑制产酶的作用。在培养球孢链霉菌菌株时，最适碳源是糊精和可溶性淀粉。

[0008] 现有技术目前对于发酵工艺制备溶菌酶过程使用的培养基研究主要限于氮源、碳源等成分的选择，针对表面活性剂的种类和浓度如何影响溶菌酶的活性研究较少，且现有培养基发酵产生溶菌酶活性有限，导致该类溶菌酶的方法在实际工业化大生产上应用有限。

发明内容

[0009] 本发明针对现有技术不足，提供一种通过优化发酵工艺中的培养基处方获得高活性溶菌酶的方法。

[0010] 本发明的技术方案是：发酵工艺制备溶菌酶的方法，包括以下步骤：取液体培养基置于三角瓶中，按1-10％v/v的接种量接入菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为20-40℃，150-300r/min，发酵培养24h后，将发酵液离心去除菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得溶菌酶；所述液体培养基包含葡萄糖、蛋白胨和表面活性剂，所述表面活性剂为浓度比为
1:2-2:1的椰油脂肪酸二乙酰胺和吐温类表面活性剂的混合物。

[0011] 优选的，所述葡萄糖的浓度为10g/L，所述蛋白胨的浓度为5g/L。

[0012] 优选的，所述椰油脂肪酸二乙酰胺和吐温类表面活性剂的浓度范围均为0.5g/L-2g/L。

[0013] 更优选的，所述椰油脂肪酸二乙酰胺的浓度为1g/L，所述吐温类表面活性剂的浓度为0.5g/L。

[0014] 优选的，所述吐温类表面活性剂为吐温80。

[0015] 优选的，所述菌体选自灰色链霉菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌或溶杆菌。

[0016] 更优选的，所述菌体选自灰色链霉菌S-35、表皮葡萄球菌K-6-W1、枯草芽孢杆菌K-77或溶杆菌S2-6b。

[0017] 优选的，所述发酵条件为30℃，200r/min。

[0018] 优选的，所述接种量为液体培养基4％v/v。

[0019] 本发明的有益效果：

[0020] 发明人通过筛选培养基的成分，确定葡萄糖、蛋白胨和表面活性剂的处方组成，同时优化培养基中表面活性剂的种类和浓度，最终确定浓度比为1:2-2:1的椰油脂肪酸二乙酰胺和吐温类表面活性剂的混合物作为培养基的表面活性剂可获得生产较高活性的溶菌酶，对发酵工艺生产溶菌酶的产业化具有一定指导意义。

具体实施方式

[0021] 一、发酵工艺制备溶菌酶

[0022] 实施例1：

[0023] 制备液体培养基，其中葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，椰油脂肪酸二乙酰胺1g/L，吐温80 0.5g/L。取25mL液体培养基置于三角瓶中，按4％(v/v)的接种量接入枯草芽孢杆菌K-77的菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为30℃，200r/min，发酵培养24h后，即得溶菌酶L1。

[0024] 实施例2：

[0025] 制备液体培养基，其中葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，椰油脂肪酸二乙酰胺0.75g/L，吐温80 0.75g/L。取25mL液体培养基置于三角瓶中，按4％(v/v)的接种量接入枯草芽孢杆菌K-77的菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为30℃，200r/min，发酵培养24h后，即得溶菌酶L2。

[0026] 实施例3：

[0027] 制备液体培养基，其中葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，椰油脂肪酸二乙酰胺0.5g/L，吐温80 1g/L。取25mL液体培养基置于三角瓶中，按4％(v/v)的接种量接入枯草芽孢杆菌K-77的菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为30℃，200r/min，发酵培养24h后，即得溶菌酶L3。

[0028] 实施例4：

[0029] 制备液体培养基，其中葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，椰油脂肪酸二乙酰胺1.5g/L。取25mL液体培养基置于三角瓶中，按4％(v/v)的接种量接入枯草芽孢杆菌K-77的菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为30℃，200r/min，发酵培养24h后，即得溶菌酶L4。

[0030] 实施例5：

[0031] 制备液体培养基，其中葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，吐温80 1.5g/L。取25mL液体培养基置于三角瓶中，按4％(v/v)的接种量接入枯草芽孢杆菌K-77的菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为30℃，200r/min，发酵培养24h后，即得溶菌酶L5。

[0032] 实施例6：

[0033] 制备液体培养基，其中葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L。取25mL液体培养基置于三角瓶中，按4％(v/v)的接种量接入枯草芽孢杆菌K-77的菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为30℃，200r/min，发酵培养24h后，即得溶菌酶L6。

[0034] 二、溶菌酶活性的测定

[0035] 在冷凝琼脂平板上(内径为90mm的平板内盛有20mL含有0.01％溶壁微球菌)，采用打孔法测定。打空器的内径为7mm，每孔加入上述实施例1-6制备的溶菌酶L1-L6待测样品20μl，每个实施例的溶菌酶重复5次，30℃恒温培养24h，观察记录溶菌圈的直径，并通过标准溶菌酶样品的标准曲线，换算出待测样品的活力单位(U/mL)。

[0036] 表1不同表面活性剂种类和浓度对溶菌酶活性的影响

[0037]

[0038] 试验结果表明，与不含表面活性剂的培养基相比，使用含有表面活性剂椰油脂肪酸二乙酰胺或吐温80的培养基发酵生产的溶菌酶的酶活性明显提升，证实椰油脂肪酸二乙酰胺或吐温对产生高活性溶菌酶具有促进作用。此外，使用同时包含椰油脂肪酸二乙酰胺和吐温80的培养基对溶菌酶的酶活性促进作用更加明显，特别是浓度比为2:1的椰油脂肪酸二乙酰胺和吐温80的培养基产生了难以预期的优异效果。

[0039] 上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以做若干改进，这些也应视为本发明的保护范围之内。