一种修饰的siRNA及其用途

摘要

本发明公开了一种修饰的siRNA及用途。本发明以吉西他滨为siRNA修饰单体为例，对靶向RRM1mRNA的siRNA进行特异性地有效修饰，获得一种新型的小分子靶向化合物Gem‑RRM1siRNA，不仅能有效抑制胰腺癌细胞增殖，还能增强RRM1siRNA逆转吉西他滨耐药胰腺癌细胞的作用，起到协同抑制肿瘤的效果。可以预见：具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物应当也可以作为siRNA修饰单体，对特定的siRNA进行特异性地有效修饰后，二者起到协同作用，可应用于疾病治疗药物开发和制备。

权利要求

1.一种修饰的siRNA，其特征在于：所述修饰为：初始siRNA末端偶联有至少一个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体；

初始siRNA的序列内插入有至少一个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体；

和初始siRNA的序列内的至少一个核苷酸被具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体替换中的至少一种；

初始siRNA正义链或反义链末端偶联有1～2个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体及3～4个核苷酸；

初始siRNA的序列内插入1～3个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体；

初始siRNA的序列内的1～3个核苷酸被具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体替换；

具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体 为吉西他滨；

所述初始siRNA是靶向RRM1 mRNA的siRNA，其双链核苷酸序列如下：正义链：5’-GGAAGAAGAUGAUAAAGAA-3’，反义链：5’-UUCUUUAUCAUCUUCUUCC-3’。

2.权利要求1所述的修饰的siRNA在制备胰腺癌治疗药物中的应用。

说明书

一种修饰的siRNA及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及siRNA领域，具体地涉及一种修饰的siRNA及其用途。

背景技术

[0002] siRNA是一种长度20到25个核苷酸的双链RNA，通过识别并结合与其序列互补的mRNA，促使靶mRNA降解而引起RNA干扰，最终使目的基因沉默。由于siRNA能直接在基因水平干扰关键靶点的功能，不需要依赖靶点蛋白的晶体结构确证的siRNA成为了小分子靶向药物的候选分子，已在各类疾病治疗中显示出巨大的潜力和应用前景。以肿瘤治疗为例，siRNA药物能稳定传递siRNA定向进入肿瘤组织，精确干扰细胞信号通路，达到治疗肿瘤的目的。

[0003] 然而，siRNA药物在应用中存在一些问题，如：siRNA容易被核酸酶降解，在体内的半衰期非常短，无法确保siRNA分子到达机体的正确部位，而且容易引起机体严重的免疫反应。近年来研究发现，对siRNA进行化学修饰，能使siRNA在体内的稳定性得到很大的提高，使其在细胞和血液中的半衰期从几分钟延长到几天，同时降低了机体对siRNA的免疫反应和siRNA本身脱靶效应。例如，Alnylam公司采用半乳糖胺共轭修饰的siRNA获得的药物ALN-AT3，能稳定有效传递特定的siRNA，于2013年8月被美FDA批准用于治疗A型血友病。

[0004] 目前，siRNA的化学修饰主要包括对糖基、主链和末端的修饰。对糖基的修饰常见甲基化、甲氧乙基化和氟基化等2-羟基修饰方式，可在提高siRNA稳定性的同时增强siRNA与互补mRNA的结合能力；主链修饰主要为P-S修饰，可在保持siRNA结合能力的同时增强其核酸酶抗性，但也有研究表明，过度修饰会引发严重的毒性反应；对siRNA末端的修饰包括聚乙二醇修饰和胆固醇修饰等：聚乙二醇因其具有降低细胞毒性、增强水溶性和屏蔽负电荷等特有的生物学性状；胆固醇修饰则利用胆固醇能结合低密度脂蛋白和高密度脂蛋白等体内转运载体的特性，在提高siRNA半衰期的同时，通过与肝脏表达的低密度脂蛋白受体相结合，促进肝细胞对siRNA的摄取，可应用于肝脏疾病的治疗。

[0005] 部分核苷类似物具有抗肿瘤作用，例如治疗结肠癌的一线药物5-FU，治疗血液病的5-氮杂胞苷，治疗胰腺癌的吉西他滨(Gemcitabine，简称Gem)等。吉西他滨是目前临床上常用的核苷类抗肿瘤药物，已广泛应用于临床治疗各种肿瘤和血液病，目前是治疗胰腺癌的唯一有效药物。遗憾的是，病人在使用吉西他滨几周之内就会产生耐药性，因此吉西他滨治疗胰腺癌的效果非常有限。核糖核酸还原酶M1(ribonucleotide reductase M1 subunit,RRM1)过表达是吉西他滨产生耐药的主要机制之一。临床和基础的研究表明RRM1的水平和病人的生存率相关，高水平的RRM1的病人生存率较低；研究表明抑制了RRM1的表达，细胞对吉西他滨的敏感性增高。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种修饰的siRNA，是用具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物对siRNA进行修饰而成，具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物优选为吉西他滨或吉西他滨结构类似物。

[0007] 本发明的另一目的在于提供修饰的siRNA在制备肿瘤治疗药物中的应用，特别是吉西他滨修饰的RRM1 siRNA在制备肿瘤治疗药物中的应用。

[0008] 本发明所采取的技术方案是：

[0009] 一种修饰的siRNA，所述修饰为：

[0010] 初始siRNA末端偶联有至少一个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体；

[0011] 初始siRNA的序列内插入有至少一个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体；

[0012] 和初始siRNA的序列内的至少一个核苷酸被具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体替换中的至少一种。

[0013] 作为上述方案进一步的，初始siRNA末端还偶联有至少一个核苷酸。

[0014] 优选的，初始siRNA正义链或反义链末端偶联有1～5个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体。

[0015] 优选的，初始siRNA正义链或反义链末端还偶联有3～6核苷酸。

[0016] 优选的，初始siRNA正义链或反义链末端偶联有1～2个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体及3～4个核苷酸。

[0017] 优选的，初始siRNA的序列内插入1～3个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体。

[0018] 优选的，初始siRNA的序列内的1～3个核苷酸被具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体替换。

[0019] 优选的，具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物为吉西他滨或吉西他滨结构类似物。

[0020] 优选的，所述初始siRNA是靶向RRM1 mRNA的siRNA，其双链核苷酸序列如下：

[0021] 正义链：5’-GGAAGAAGAUGAUAAAGAA-3’，

[0022] 反义链：5’-UUCUUUAUCAUCUUCUUCC-3’。

[0023] 上述的修饰的siRNA在制备肿瘤治疗药物中的应用。

[0024] 本发明的有益效果是：

[0025] 本发明以吉西他滨修饰靶向RRM1mRNA的siRNA为例，通过特异性地有效修饰，获得一种新型的小分子靶向化合物Gem-RRM1siRNA，不仅能有效抑制胰腺癌细胞增殖，还能增强RRM1siRNA逆转吉西他滨耐药胰腺癌细胞的作用，起到协同抑制肿瘤的效果。

[0026] 可以预见：具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物应当也可以作为siRNA修饰单体，对特定的siRNA进行特异性地有效修饰后，二者起到协同作用，可应用于疾病治疗药物的制备与开发。

附图说明

[0027] 图1：western blot和qPCR的方法检测4种siRNA的特异性，(A)检测0nM和10nM的siRNA对细胞内RRM1蛋白水平的抑制作用；(B)检测10nM的siRNA对细胞RRM1mRNA水平的抑制作用。

具体实施方式

[0028] 以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0029] 实施例1一种吉西他滨修饰的RRM1 siRNA

[0030] 一、siRNA的设计与优选

[0031] 根据RRM1 mRNA序列(Gene ID:6240)的不同作用位点，经过反复试验和筛选，优选出一条特异性好的靶向RRM1 mRNA的siRNA(以下简称RM2)，其双链核苷酸序列如下：

[0032] 正义链：5’-GGAAGAAGAUGAUAAAGAA-3’(SEQ ID NO：1)

[0033] 反义链：5’-UUCUUUAUCAUCUUCUUCC-3’(SEQ ID NO：2)

[0034] 对RM2进行常规的化学修饰，即RM2正义链的3’端偶联2个dT，反义链的3’端偶联dAdT，获得常规修饰的RM2，取10nM用Lipofectamin  2000(Invitrogen)转染，按Lipofectamin 2000与siRNA质量比为3∶1转染进细胞后，Western blot检测siRNA对RRM1蛋白表达的影响，用qRT-PCR检测siRNA对RRM1mRNA水平的影响，设置阴性对照(mismatch RNA)及阳性对照(control)。

[0035] 结果如图1A所示，常规修饰的RM2在10nM剂量对细胞内RRM1蛋白具有明显的抑制作用；如图1B所示，和对照相比，RM2能降低RRM1 mRNA表达85％。说明：RM2具有高度的特异性，能很好的和RRM1的mRNA结合，降解mRNA，从而抑制蛋白的表达。

[0036] 二、吉西他滨修饰RRM1 siRNA

[0037] 以RM2为待修饰的初始siRNA，用吉西他滨进行如下修饰，获得Gem-RRM1 siRNA。

[0038] 修饰策略为：在初始RRM1 siRNA正义链或反义链的3’末端偶联3～4个核苷酸，再偶联1～2个吉西他滨单体(如编号1～6Gem-RRM1siRNA)；在初始RRM1 siRNA正义链或反义链的3’末端偶联5个吉西他滨单体(如编号7～8Gem-RRM1siRNA)；在初始RRM1 siRNA的序列内插入或/和替换1～3个吉西他滨单体(如编号9～11Gem-RRM1siRNA)，以仅用核苷酸修饰的siRNA为对照(如编号12)，以吉西他滨修饰的mismatch siRNA为对照(如编号13)。

[0039] 对于siRNA修饰用单体并非越多就修饰越好，每种修饰产物都是具有特异性的，需用荧光素酶实验检测修饰后的siRNA生物学有效性。根据上述方案，提供修饰的RRM1 siRNA序列，如表1所示。

[0040] 表1吉西他滨修饰的siRNA序列

[0041]

[0042] 注：表中X代表吉西他滨，“—”右侧为修饰单体组成的特殊序列。

[0043] 三、WST-1实验评价Gem-RRM1 siRNA对耐药胰腺癌细胞PANC1/Gem增殖的抑制作用[0044] 吉西他滨耐药胰腺癌细胞PANC1/Gem接种到96孔板过夜培养后，将上述13种修饰的siRNA用Lipofectamin 2000(Invitrogen)转染，按Lipofectamin 2000与siRNA质量比为3∶1转染进细胞内，72h后用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测IC50。

[0045] 表2、Gem-RRM1siRNA对耐药胰腺癌细胞PANC1/Gem增殖的作用

[0046]

[0047] 结果如表2所示，与以吉西他滨修饰的mismatch siRNA对照(编号13)相比，编号1～11的Gem-RRM1 siRNA对耐药胰腺癌细胞PANC1/Gem的抑制效果非常显著，说明RRM1 siRNA能逆转吉西他滨的耐药作用。与以常规siRNA修饰单体修饰的siRNA对照(编号12)相比，编号1～7，10～11的Gem-RRM1 siRNA对耐药肿瘤细胞PANC1/Gem的抑制效果更显著，说明吉西他滨对siRNA的修饰不仅能有效抑制胰腺癌细胞增殖，还增强了RRM1 siRNA逆转耐药的作用，起到协同抑制肿瘤的效果。修饰的siRNA中，RM2-2×G(2.3)-dU/dA的作用最强，RM2-2GdU/dA次之，这些能有效逆转耐药并协同抑癌的修饰的siRNA有望用于肿瘤基因治疗药物的开发。

[0048] 由此，我们可以预见：具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物应当也可以作为siRNA修饰物，对特定的siRNA进行特异性地有效修饰后，应用于疾病治疗药物开发和制备中。