抑制Dcf1基因的表达在制备治疗肥胖药物中的应用

摘要

本发明涉及一种抑制Dcf1基因的表达在制备治疗肥胖药物中的应用。本发明主要是运用野生型（作为对照）和dcf1敲除两种小鼠，通过行为学检测到dcf1的缺失导致小鼠体重及饮食的减少。然后Western blotting和免疫组化检测到NPY蛋白的下调；之后证实了dcf1位于NPY的上游。最后ATP试剂盒检测到dcf1敲除后，小鼠下丘脑组织及原代细胞ATP水平身高。在293T细胞中分别过表达dcf1与NPY,都引起细胞ATP水平下降。因此，dcf1在能量平衡上有重要作用，它可以提供一种新颖的方法来治疗肥胖。

权利要求

1.Dcf1基因表达的抑制剂在制备治疗肥胖药物中的应用。

说明书

抑制Dcf1基因的表达在制备治疗肥胖药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抑制dcf1基因的表达在制备治疗肥胖药物中的应用。

背景技术

[0002] 肥胖对人体健康有显著和广泛的影响，目前它成为了医疗保健优先事项和本世纪挑战的首要任务。遗传学研究认为导致能量平衡失调是关键调节因子的影响，如神经肽Y（NPY）或阿黑皮素原基因（POMC）造成的影响。目前研究表明，NPY 能增加食物的摄入，降低产热效应等，而POMC行驶相反的作用，它能抑制食欲，增加能量消耗。肥胖是摄入的能量大于支出，以脂肪的形式储存并堆积导致的。目前市面上经过FDA批准的减肥药很少，主要是针对脂肪酶来起作用，但长期使用会引起脂肪泻，可造成脂溶性维生素缺乏。最近还有报道其可引起肝功能损害。

[0003] 树突状细胞因子（dendritic cell factor 1，dcf1），也称为跨膜蛋白59（transmembrane protein 59），属于一种单次跨膜蛋白。我们之前的研究发现dcf1在初级神经干细胞（NSCs）中的表达有差异，这暗示着dcf1在神经系统中行驶某角色。而神经系统中调节体重与饮食的为NPY与POMC，如果有物质能调节这两因子，就有成为减肥药的可能。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供本发明涉及一种抑制dcf1基因的表达在制备治疗肥胖药物中的应用。

[0005] 本发明主要是运用野生型（作为对照）和dcf1敲除两种小鼠，通过行为学检测到dcf1的缺失导致小鼠体重及饮食的减少。然后Western blotting和免疫组织化学检测到NPY蛋白的下调；之后证实了dcf1位于NPY的上游。最后ATP试剂盒检测到dcf1敲除后，小鼠下丘脑组织及原代细胞ATP水平身高。在293T细胞中分别过表达DCF1与NPY, 都引起细胞ATP水平下降。因此，dcf1在能量平衡上有重要作用，它可以提供一种新颖的方法来治疗肥胖。

附图说明

[0006] 图1为dcf1的敲除引小鼠体重与饮食量的下降。

[0007] 图2为western 证实dcf1的敲除引NPY的表达下调。

[0008] 图3为免疫组织化学证实dcf1的敲除引NPY的表达下调。

[0009] 图4为dcf1位于NPY的上游。

[0010] 图5为dcf1的敲除导致ATP水平的升高，过表达引起ATP水平下降。

具体实施方式

[0011] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

[0012] 实施例1：所有实验在雄性小鼠（保持在一个C57BL / 6J背景）中进行。动物出生后，dcf1-/- 和dcf1+/+小鼠在第三周时单独饲养并保持12小时光照（06：00-18：00）与12小时黑暗（18：00-06：00），控制温度（24±1℃）。食物和水可用自由采食并充足。所有的动物处理都按照神经科学学会准则进行。三月龄体型对比见（图1A），体重与饮食量结果见（图1B，1C）。(n=28，*P<0.05；**P<0.01；*P<0.001)。

[0013] 实施例2：将预冷的PBS中取出目标区域，下丘脑，海马，皮层。然后在加有Western 及 IP 细胞裂解液的匀浆器中进行匀浆，直至无明显组织块，成透明匀浆状即可。在冰上继续裂解30min，然后将裂解液收集于1.5ml EP管中。4℃，8000rpm离心10分钟收集上清。继续将上清于4℃，15000rpm离心20min，再次收集上清即为组织蛋白提取液，加入相应量的Loading buffer，加热变性备用。之后进行Western blotting。电泳条件为浓缩胶80V，30分钟；分离胶120V，90分钟。转膜条件25V，40分钟。一抗稀释比例1:1000，二抗稀释比例1:10000。（图2，B，C，D，，E，F都是对A的统计分析）为（ NPY,POMC/GAPDH）示意图。(n=4，*P<
0.05；**P<0.01；*P<0.001)。

[0014] 实施例3：免疫组织化学检测

[0015] 首先将实验小鼠用4%PFA灌流固定，蔗糖脱水，包埋。然后进行冰冻切片（20um）。最后进行免疫组化。0.01M PBS 洗 3 次，每次5分钟；0.1%TritonX-100-PBS 通透30分钟；0.01M PBS 洗3次，每次5分钟；2 % BSA-PBS 室温封闭 1 小时；吸干 2% BSA-PBS 后，直接滴加 PBS 稀释的一抗（MBP，1：500）。37℃孵育2小时，或 4℃孵育过夜；吸干一抗， 0.01M PBS 洗3次，每次5分钟。避光条件下，加入 PBS 稀释的二抗（稀释比例 1：500）。37℃孵育2小时；吸干二抗，加入 PBS 稀释的 DAPI（1：1000），室温孵育 10 分钟；吸干 DAPI， 0.01M PBS 洗 3 次，每次 5 分钟；荧光封片剂封片，Confocal 观察。（图3）免疫组织化学（NPY）示意图。其中（图3，A）是PVN区，（图3，C）是DMH区，（图3，E）是ARC 区，图3B，图3D，图3F，分别是对图3A，图3C，图3E，的统计分析。所有观察区域均显示，DCF1敲除小鼠的NPY 信号明显减少(n=4，*P<0.05；**P<0.01；*P<0.001)。

[0016] 实施例4：293T细胞在（DMEM+10％ FBS+1％双抗）的培养基中，37℃，5%CO2培养箱中培养。分别对细胞转染DCF1质粒、NPY质粒、空载、生理盐水。转染48小时后抽蛋白western。Western结果显示，DCF1过表达使NPY显著上调(对照组相比)（图4A，图4B），而NPY的过表达不能引起DCF1表达的变化（图4A，4C）。由此，可以推断出NPY位于DCF1的下游，DCF1通过调节NPY来介导下游。(n=3，*P<0.05；**P<0.01；*P<0.001)。

[0017] 实施例5：用ATP检测试剂盒对相应指标进行检测。结果表明，DCF1 - / - 小鼠下丘脑中ATP在一月龄与野生型鼠无差异，在3个月龄下丘脑组织ATP含量显著增加（图5A）， DCF1 - / - 鼠下丘脑原代细胞的ATP浓度也较野生型下丘脑原代细胞升高（图5B）。DCF1和NPY分别在293T细胞中过表达，使293T细胞ATP浓度降低（图5C）。这些结果表明，DCF1的缺失会引起ATP的上升，可能是机体耗能增多，需要一个高的ATP水平来维持生命活动(n=3，*P<0.05；**P<0.01；*P<0.001)。
综上所述，dcf1基因可以作治疗肥胖的药物。