莲雾EST-SSR分子标记转让专利
申请号 : CN201710318661.2
文献号 : CN106916901B
文献日 : 2019-08-27
发明人 : 魏秀清 , 许家辉 , 章希娟 , 许玲 , 陈长忠
申请人 : 福建省农业科学院果树研究所
摘要 :
本发明提供了莲雾EST‑SSR分子标记，属于分子标记领域，利用莲雾转录组数据进行SSR标记开发能获得较高频率的SSR位点，确定了22对引物，且类型丰富，为莲雾遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富可靠的标记选择。
权利要求 :
1.莲雾EST-SSR分子标记，其特征在于：所述的莲雾EST-SSR分子标记编号为WASSR3、WASSR12、WASSR13、WASSR37、WASSR38、 WASSR39、WASSR41、WASSR42、WASSR44、WASSR50、WASSR55、WASSR60、WASSR63、WASSR70、WASSR72、WASSR74、WASSR80、WASSR85、WASSR87、WASSR88、WASSR91和WASSR92，各编号所对应的莲雾EST-SSR分子标记的引物对序列按顺序如SEQ ID NO.1-44所示。
2.如权利要求1所述的莲雾EST-SSR分子标记在莲雾遗传多样性分析和遗传图谱构建中的应用。
说明书 :
莲雾EST-SSR分子标记
技术领域
[0001] 本发明属于分子标记领域，具体涉及莲雾EST-SSR分子标记。
背景技术
[0002] 莲雾[Syzygium samarangense (Blume) Merri.et Perry] 原产于马来半岛及安达曼群岛，是桃金娘科（Myrtaceae）蒲桃属（Syzygium）的热带常绿果树，别名洋蒲桃、南洋蒲桃、爪哇蒲桃、甜雾、水石榴等。莲雾富含多种药用成分，如黄酮类、查耳酮类、己烷等，具有止泻、镇痛、抗菌、抗高血糖、抗胆碱酯酶、抗炎、提高免疫力等功效。莲雾果实色泽艳丽，形态独特，清甜爽口，口感佳，富含酚类物质，是极具保健价值的水果之一，受国内外消费者喜爱。在马来西亚、泰国、印度尼西亚等地均有广泛种植，是当地果业的重要组成部分，鲜果常销往欧美国家。我国最早开始商品化种植莲雾的地区是台湾，近年来，随着传统热区优势果树如荔枝、龙眼、柑桔等价格的回落，莲雾成为新兴的热带果树，栽培面积逐步扩增，主产区为台湾、海南、福建、广东和广西等地，据不完全统计，2014年我国莲雾种植面积6.87万亩，产量13.6万吨，每公斤售价30 50元，经济效益高，具发展潜力。~
[0003] 莲雾有具有丰富的遗传多样性，但相关研究报道比较少。台湾根据果实颜色将莲雾分为大（深）红种、淡红种、粉红种、青种和白种等五类（林正忠 等，2004）。王家保等(2004) 对海南的11份莲雾资源进行同工酶研究，结果表明11份资源根据颜色不同聚成红色果皮、白色果皮、绿色果皮3大类，红色果皮与白色果皮亲缘关系较绿色果皮近。但何桥等(2006)对12份莲雾资源和2个莲雾近缘种进行了ISSR分析，聚类分析结果显示莲雾并不以果皮颜色相同聚为一类，而以成熟期相近聚为一类，因此他指出成熟期可能在莲雾亲缘关系和分类地位中有重要作用。莲雾自从爪哇、马来西亚等国引入我国后，在长期的适应性栽培下产生了许多地方品种及资源，这些地方品种多以果实颜色命名，如‘大红莲雾’、‘粉红莲雾’、‘青莲雾’等，这极有可能造成同名异物和同物异名，不仅给莲雾种质资源收集、保存、鉴定及利用造成难度，也制约了优良品种的选育和推广应用。
[0004] DNA分子标记是鉴定种质资源遗传多样性的重要手段，其中微卫星序列（即简单重复序列Simple sequence repeat，SSR）分子标记因其位点特异、高多态性、高稳定性、重复性好、呈共显性等优点被广泛应用于遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱建立等方面。EST-SSR 标记来源于DNA序列的转录区，比基于基因组序列开发的SSR标记种间通用性更高，也更经济方便，近年来被广泛地应用于多种植物的SSR分子标记开发上，在刺梨、洋葱、蓝靛果忍冬、丝瓜等园艺植物上均有报道。本发明利用转录组测序获得的数据进行SSR标记搜索，分析其分布及组成特征，进行初步可用性评价，以期为莲雾的品种鉴定、种质资源多样性分析、建立核心种质和分子标记辅助育种奠定基础。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供莲雾EST-SSR分子标记，利用莲雾转录组数据进行SSR标记开发能获得较高频率的SSR位点，且类型丰富，为莲雾遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富可靠的标记选择。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 莲雾EST-SSR分子标记编号为WASSR3、WASSR12-13、WASSR37-39、WASSR41-42、WASSR44、WASSR50、WASSR55、WASSR60、WASSR63、WASSR70、WASSR72、WASSR74、WASSR80、WASSR85、WASSR87-88、WASSR91-92，各编号所对应的莲雾EST-SSR分子标记的引物序列如SEQ ID NO.1-44所示。
[0008] 所述的莲雾EST-SSR分子标记在莲雾遗传多样性分析和遗传图谱构建中的应用。
[0009] 本发明的具体方法是：
[0010] （1）采用CTAB法提取莲雾基因组DNA；
[0011] （2）使用MISA程序（http://pgrc.ikp-gatersleben.de/misa）进行SSR位点搜索，以二至六核苷酸最少重复次数分别为6、5、5、5、和5次为标准进行搜索。用Primer 3.0软件对SSR重复单元前后的序列进行引物设计及评价，每条SSR产生3条引物。引物序列长度18~27bp，GC含量40% 60%，退火温度57 63℃，上、下游引物的Tm值相差≤2℃，预期扩增产物长~ ~
度100 280 bp；且无二级结构和二聚体；
~
度100 280 bp；且无二级结构和二聚体；
~
[0012] （3）EST-SSR引物筛选：PCR反应体系为20ul，其中2.5mmol/L dNTP 4 μl，5U Taq酶 0.3 μl，100 ng DNA 1.5 μl，10 μmol/L 的上下游引物各1 μl，10×Buffer（Mg2+）2.5 μl，加ddH2O补至 20 μl。PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；然后进行35个循环，每个循环包括
94℃变性30 s，56℃退火30 s（退火温度因不同引物而异），72℃延伸1 min；最后72 ℃延伸
7 min。
94℃变性30 s，56℃退火30 s（退火温度因不同引物而异），72℃延伸1 min；最后72 ℃延伸
7 min。
[0013] 本发明的优点在于：
[0014] 本发明对来自3个莲雾品种果实的21 153条Unigene（4.75Mb）序列进行EST-SSR搜索，得到11 641个SSR位点，出现频率为55.03%，高于蓝靛果忍冬（32.51%）、刺梨（20.37%）、荔枝（16.35%）、柑橘（21.74%，5.2kb）、梨（7.1%，7.2%）等木本果树，也高于萝卜（23.79%）、丝瓜（14.97%）、辣椒（7.84%）、欧薄荷（9.88%）等草本植物。从前人对植物的研究结果来看，大多数植物的EST-SSR以二、三核苷酸重复类型为主，而主导重复基序因物种而异。本发明发现莲雾以单核苷酸重复类型（43.44%）为主，其次是二核苷酸重复类型（30.98%）和三核苷酸重复类型（24.38%），四、五和六核苷酸重复类型虽有出现，但所占比例很小（1.21%），这与芙蓉李、杜仲和连翘的研究结果相似，不同于荔枝、枇杷和蓝靛果忍冬。莲雾的单核苷酸重复基序中，以A/T最为丰富，这与柑橘和芙蓉李等果树研究结果一致；二核苷酸重复基序中AG/CT最多，与已有报道的多数果树相同，不同于荔枝（GA/TC）；三核苷酸重复基序以CCG/CGG为主，与猕猴桃、柑橘和草莓等以AAG/CTT为主不同，也不同于荔枝（GAA/TTC）和梨（ACC/GGT）。
[0015] 本发明随机从25734对引物种中选择14 25bp的SSR引物100对进行合成，其中67对~引物能扩增出理想PCR产物，有效扩增率为67.00%。其中，30对引物中22对SSR引物呈现多态性，占有效引物的73.33%。这个比率高于刺梨（52.17%）、芙蓉李（42.5%）、蓝靛果忍冬（62.5%）、荔枝（66.67%）等多种果树。这说明莲雾EST序列中的SSR位点较多，引物扩增效率较高，且其多态性也相对较高。22对多态性差异引物对30份莲雾材料进行UPGMA聚类，被分为2大类，以遗传距离0.68为阈值，第1类可分为4小类，以果皮颜色或来源地相近聚为一类，第2类可分为2小类，以果皮颜色不同来区分，比较准确的反映了30份莲雾材料之间的差异。
本发明利用莲雾转录组数据开发出的SSR标记可用性较高，为莲雾种质资源遗传多样性研究、遗传图谱构建、基因定位及克隆及分子标记辅助育种等奠定了基础。
本发明利用莲雾转录组数据开发出的SSR标记可用性较高，为莲雾种质资源遗传多样性研究、遗传图谱构建、基因定位及克隆及分子标记辅助育种等奠定了基础。
附图说明
[0016] 图1引物63在30个莲雾材料中的多态性。品种编号名称见表1。
[0017] 图2 供试莲雾材料的UPGMA聚类图，品种编号名称见表1。
具体实施方式
[0018] 1 材料与方法
[0019] 1.1转录组数据来源
[0020] 莲雾转录组数据来源于本课题组2016年对果实进行Illumina高通量深度测序的结果。测序时采集‘紫红’、‘黑珍珠’、‘青钻’3个莲雾品种果实，每个品种均取来自3个不同单株的莲雾果实各20个，液氮速冻，-80℃保存。测序时，每个单株构建1个文库。测序委托北京百迈客生物科技有限公司采用Illumina HiSeqTM 2500 PE125 系统进行RNA-Seq 转录组测序（无参），采用Trinity进行序列组装，经过滤获得7.80G的有效数据。
[0021] 1.2材料及其DNA提取
[0022] 用于SSR引物筛选和可用性评价的材料为福建省农业科学院果树研究所莲雾种质资源圃的30份种质资源（表1）。基因组DNA提取采用CTAB法进行。
[0023] 表1 莲雾SSR多态性分析材料
[0024]
[0025] 1.3转录组SSR位点鉴别及SSR引物设计
[0026] 使用MISA程序（http://pgrc.ikp-gatersleben.de/misa）进行SSR位点搜索，以二至六核苷酸最少重复次数分别为6、5、5、5、和5次为标准进行搜索。用Primer 3.0软件对SSR重复单元前后的序列进行引物设计及评价，每条SSR产生3条引物。引物序列长度18 27bp，~GC含量40% 60%，退火温度57 63℃，上、下游引物的Tm值相差≤2℃，预期扩增产物长度100~ ~ ~
280 bp；且无二级结构和二聚体。
280 bp；且无二级结构和二聚体。
[0027] 1.4 EST-SSR引物筛选
[0028] PCR反应体系为20ul，其中2.5mmol/L dNTP 4 μl，5U Taq酶 0.3 μl，100 ng DNA 1.5 μl，10 μmol/L 的上下游引物各1 μl，10×Buffer（Mg2+）2.5 μl，加ddH2O补至20 μl。
PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30 s，56℃退火30 s（退火温度因不同引物而异），72℃延伸1 min；最后72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物用2%琼脂糖检测，6%变性聚丙烯酰胺凝胶检测，160V电压，3h，银染显色后观察拍照。
PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30 s，56℃退火30 s（退火温度因不同引物而异），72℃延伸1 min；最后72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物用2%琼脂糖检测，6%变性聚丙烯酰胺凝胶检测，160V电压，3h，银染显色后观察拍照。
[0029] 1.5 数据统计
[0030] SSR发生频率为SSR的Unigene数量与总Unigene数量之比，SSR的出现频率为SSR的个数与总Unigene的数量比，SSR平均分布距离为1kb以上的Unigene的碱基数与SSR数量之比。采用人工读带的方法，将电泳图上可重复的清晰条带记为“1”，同一位置无带或不易分辨的弱带记为“0”，建立原始数据矩阵。利用软件NTsys2.10按系统聚类进行聚类绘图。
[0031] 2 结果与分析
[0032] 2.1 转录组中SSR的分布及结构特点
[0033] 莲雾转录组经组装后共获得87 538条Unigene（序列总长约75 156 717 bp），用MISA软件对1kb以上的Unigene（21 153条，序列全长为47 491 726 bp）进行搜索，发现其中8 115条Unigene序列中含有11 641个SSR位点，其中2 773条Unigene含有两个或两个以上的EST-SSR位点。SSR发生频率为38.36%，出现频率为55.03%，平均4.08kb出现1个SSR，其中复合SSR有1432个，占12.3%。SSR重复类型6种均有，即单核苷酸至六核苷酸重复。其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复出现频率占优势，分别占总SSR的43.44%、30.98%和24.38%；
四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型数量较少，分别占总数的0.92%、0.14%和0.15%（表
2）。
四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型数量较少，分别占总数的0.92%、0.14%和0.15%（表
2）。
[0034] 莲雾转录组SSR重复单元的重复次数分布在5 23次之间，其中5 10次的SSR共有~ ~8753个，占总数的75.19%；其次为11 20次的SSR，共有2880个，占总数的24.74%；20次重复以~
上的仅有8个，仅占0.07%。莲雾转录组SSR的长度主要集中在10 256bp，其中长度小于12bp~
的SSR有2873个（24.68%），长度在12 20bp的SSR达7094个，占总数的60.94%，长度在20bp以~
上的SSR有920个，只占7.90%。
上的仅有8个，仅占0.07%。莲雾转录组SSR的长度主要集中在10 256bp，其中长度小于12bp~
的SSR有2873个（24.68%），长度在12 20bp的SSR达7094个，占总数的60.94%，长度在20bp以~
上的SSR有920个，只占7.90%。
[0035] 表2 莲雾SSR的类型、数量及分布频率
[0036]
[0037] 2.2转录组中SSR基序重复类型和频率特征
[0038] 莲雾转录组中11 641个SSR位点共含72种重复基序，单核苷酸至六核苷酸重复分别有2、4、10、24、15和17种。从分布频率来看（表3），以单核苷酸重复类型A/T出现最多，占总SSR的40.15%，占单核苷酸重复基序的总数的92.43%。其次是二核苷酸重复类型AG/CT，占总SSR的26.99%，占二核苷酸总数的87.13%。此外，三核苷酸重复基序中以CCG/CGG、AGG/CCT 和AAG/CTT占优势，分别占三核苷酸总数的33.62%、20.05%和16.98%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复基序分布较为分散，出现的频率较低。
[0039] 表3 莲雾转录中不同微卫星重复基序(motif)出现的频率
[0040]
[0041]
[0042] 2.3莲雾转录组SSR引物设计与筛选
[0043] 利用Primer3.0对含SSR位点的8 115条Unigene序列进行引物设计，共设计出引物25 734对。随机挑选100对不同重复单元（二、三、四、五、六核苷酸）的引物对莲雾‘粉红种’DNA进行SSR-PCR扩增以验证其有效性。结果表明76对引物实现有效扩增，占100对SSR引物的76%。在76对有效扩增引物中，67对（88.12%）PCR扩增产物与预期大小相符，有9对（13.43%）扩增产物长度超过预期。
[0044] 2.4多态性分析
[0045] 选取30份莲雾，利用30对有效的EST-SSR引物进行扩增及多态性评价。其中22对引物存在多态性差异（表4），占有效扩增引物的73.33%。每对引物产生的多态性片段数在2 6~之间，23对引物共得到63条条带，其中多态性片段52个，每对引物平均产生2.36个多态性片段，图1为引物63的扩增情况。
[0046] 表4 22对莲雾SSR引物信息
[0047]
[0048]
[0049] 利用22对多态性SSR引物对30份莲雾材料进行聚类分析，在遗传距离0.60处，供试材料被分成2大类（图2）。第1类包含26份材料，以遗传距离0.68为阈值，该类被分为4小类，其中以‘印尼大叶’、‘黑钻石’和‘紫红’为代表的红色果皮莲雾聚为一类，以‘翡翠’、‘泰国青种’和‘Peth Jinda’为代表的绿色果皮莲雾聚在一起，‘龙文实生’和‘印度红’归为一类，来源于同一果园的‘长泰青种’、‘青钻’和‘长泰粉红种’聚为一类。第2类包含4份材料，其中红色果皮莲雾（‘红宝石’、‘香水’、‘农科4号’）归为一类，‘白莲雾’果皮为白色，自成一类。
[0050] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。