一种甘蔗EST-SSR标记的制备方法及应用

摘要

本发明涉及EST‑SSR标记技术领域，特别涉及一种甘蔗EST‑SSR标记的制备方法及应用，该方法是通过筛选甘蔗转录组序列的SSR位点，然后利用SSR位点两侧的核苷酸序列设计引物得到EST‑SSR标记引物，再将EST‑SSR标记引物对相应的种质DNA进行标记，利用毛细管凝胶电泳验证标记结果；应用上述的方法对甘蔗种质资源进行标记能有效提高甘蔗种质资源多态性分析的效率，精确、完善的对甘蔗和/或甘蔗近缘种属种质资源的遗传多样性分析。

权利要求

1.一种甘蔗EST-SSR标记引物组，其特征在于，所述EST-SSR标记引物为下述引物：EST1-2：上游引物序列：5’-ACCCTCCAGCCACCCTT-3’；下游引物序列：5’-GCATACACCATCCATCCCT-3’；

EST1-5：上游引物序列：5’-AGGCGGGACCGAACAA-3’；下游引物序列：5’-GACCTCATCTGCCGGACTG-3’；

EST1-6：上游引物序列：5’-ATTAGTGGCTCTGCCGTTAT-3’；下游引物序列：5’-CAATGGTAGAGTGAAAGTGGG-3’；

EST1-7：上游引物序列：5’-TCTGCCCAAGACGGTAA-3’；下游引物序列：5’-GCTGCCTGAGTTGCTGA-3’；

EST1-9：上游引物序列：5’-AACCTTCCTTCCGCTCCC-3’；下游引物序列：5’-GAATCTTGACCGCCTTTGG-3’；

EST1-12：上游引物序列：5’-TGCGAGCTGCGATGGA-3’；下游引物序列：5’-GGTTGGGACCTGGGTTG-3’；

EST1-15：上游引物序列：5’-CCAAACCCAAGGCTCA-3’；下游引物序列：5’-ATGCGACTAAAGGTTGAAGA-3’；

EST1-16：上游引物序列：5’-GGAATCCAAGCCAACG-3’；下游引物序列：5’-CCACGGCTGCTCTTCT-3’；

EST1-17：上游引物序列：5’-CCTTCACCTGGAATCGT-3’；下游引物序列：5’-CAAGCCCAACTCCTCAA-3’；

EST1-18：上游引物序列：5’-CATAACCACTTGGACCACC-3’；下游引物序列：5’-CCGTTGACCTGCGAAT-3’；

EST1-19：上游引物序列：5’-GAAGTTGATGCCAGATGGG-3’；下游引物序列：5’-TCCCTTCCTGCCAACTCT-3’；

EST1-21：上游引物序列：5’-CTCGGCGTCACCGTCAT-3’；下游引物序列：5’-GAGGGCTTCTCATCATCACTAG-3’；

EST1-22：上游引物序列：5’-AATCCGCCAGCACCTACCC-3’；下游引物序列：5’-GATCTCGTCGGGCAGGTCC-3’；

EST1-23：上游引物序列：5’-ATTCACTTCACTGCCCAAGC-3’；下游引物序列：5’-TAGGGACGGAGGGAGTAGG-3’；

EST1-24：上游引物序列：5’-ATGGAGGAGGCAAAGAGA-3’；下游引物序列：5’-AATGCGAACAAACAGACG-3’；

EST1-26：上游引物序列：5’-AGGCAAGAACCCCAAGC-3’；下游引物序列：5’-ATTCCACAACCAAAACCC-3’；

EST2-1：上游引物序列：5’-AACCGAACCTGAACTCC-3’；下游引物序列：5’-AGATGCCGACGACCTG-3’；

EST2-2：上游引物序列：5’-TCATCCAACGCCACCG-3’；下游引物序列：5’-ACTGCCCGCACCACATC-3’；

EST2-4：上游引物序列：5’-GCAGCTTTCTCGATTCCC-3’；下游引物序列：5’-CTCCACCAAACCCTCCCT-3’；

EST2-7：上游引物序列：5’-CATTGCTACTCGCATTCACC-3’；下游引物序列：5’-ACCACCAACAGCCTTCTCAT-3’；

EST2-8：上游引物序列：5’-ATCCGGGACCATGAATC-3’；下游引物序列：5’-TTGCCAAACGAACACG-3’；

EST2-9：上游引物序列：5’-GAACCACATCACCCTATACCA-3’；下游引物序列：5’-CAGCAGCTTCCAGTCATCAA-3’；

EST2-10：上游引物序列：5’-CAGGACTCGCTTCTCCG-3’；下游引物序列：5’-CATCATCTTCTTCGGCAAC-3’；

EST2-11：上游引物序列：5’-TAATCTGCTCTGCGTCTCC-3’；下游引物序列：5’-GGTGATCCAGGGCGTGT-3’；

EST2-13：上游引物序列：5’-AAGCATAATCAGGCAAAGG-3’；下游引物序列：5’-GCCAACTCCGTCTCCAC-3’；

EST2-14：上游引物序列：5’-GTGGGCGTGGTAGGGAT-3’；下游引物序列：5’-CTGCTCGTGCTCTTGCTC-3’；

EST2-15：上游引物序列：5’-ACGAGTAGGAGTAGGACGACG-3’；下游引物序列：5’-CCCATAGCCTGCCTGATAG-3’；

EST2-18：上游引物序列：5’-CTGAGAACGAAATGGGTG-3’；下游引物序列：5’-CCACCTTGCTTGGGAC-3’；

EST2-19：上游引物序列：5’-CGTGCTGGAACCGTAA-3’；下游引物序列：5’-GCCGCAGAAACAATCA-3’；

EST2-20：上游引物序列：5’-ATAAGATCCGTGGTAGGGTAA-3’；下游引物序列：5’-AGGGACGAAGGGAGTGC-3’；

EST2-21：上游引物序列：5’-GCGGAGGAGGGAGGACAA-3’；下游引物序列：5’-ATGAGTAGCGACTGTGCGAGTG-3’；

EST2-22：上游引物序列：5’-GTCATTTGAAGCATCAGCATTG-3’；下游引物序列：5’-TGAGGGTGGGAAAGAGCAG-3’；

EST2-23：上游引物序列：5’-CACCAACCCTAGATCCACCC-3’；下游引物序列：5’-ACGGCCCGAGGCAAGT-3’；

EST2-27：上游引物序列：5’-GCCGCAAACCATGCTGAAC-3’；下游引物序列：5’-GAGCATCATCCCTCCATTCACA-3’；

EST2-28：上游引物序列：5’-GCCAGCAAATCTCCCAC-3’；下游引物序列：5’-AAGGCTGAGTTAATAAGATGCA-3’；

EST2-32：上游引物序列：5’-GCGTAACATCTTCTTGCTG-3’；下游引物序列：5’-CGTTGTCGTCCCCACT-3’；

EST2-34：上游引物序列：5’-GCCGCACATCCGTTGG-3’；下游引物序列：5’-GAGGAAGAGGAGTTCGAGGG-3’；

EST2-35：上游引物序列：5’-GGTGATGGTGTCGCTTGTG-3’；下游引物序列：5’-ACCGTGCTGTCCCTGCT-3’；

EST3-3：上游引物序列：5’-ACCGAGTGGAGTAGTAGGC-3’；下游引物序列：5’-GGGTTGGAAGGAGGAAG-3’；

EST4-2：上游引物序列：5’-TCCTTCCCCGACTCTTCTCC-3’；下游引物序列：5’-GCATGAGCTGGCCACGC-3’；

EST4-3：上游引物序列：5’-GGCTTCCAGATTTCCTCTACTT-3’；下游引物序列：5’-GCAACGCAGCATTTCCA-3’；

EST4-5：上游引物序列：5’-GGTCGTTGCTCTTCAGTTGC-3’；下游引物序列：5’-CCTCTTCCGATTCTTTCCTTT-3’；

EST4-6：上游引物序列：5’-CGAATGGCAGGAACGA-3’；下游引物序列：5’-CGCCAGTTGAGGGAGA-3’；

EST4-8：上游引物序列：5’-TGTTCAGCTTGGCTACTGC-3’；下游引物序列：5’-TCCTGATTCCTTCCGTTG-3’；

EST4-9：上游引物序列：5’-CTGGATGACCGCCGTAT-3’；下游引物序列：5’-AGAACAAGTGGCAACAAGC-3’；

EST4-12：上游引物序列：5’-AGTCGTTCTCGGAGCTGTCG-3’；下游引物序列：5’-CCCTGGCGGCAGTTGTT-3’；

EST4-14：上游引物序列：5’-CAGTAGCAGCAACAGTAGTAAC-3’；下游引物序列：5’-TGCTACTACCAACCTCGTC-3’；

EST4-17：上游引物序列：5’-CCCTCGAACTCCTCTTCCTC-3’；下游引物序列：5’-AGGGGTTAGAATAGAACCCATG-3’；

EST4-19：上游引物序列：5’-CAGCCTCTTCTTTCCGTTCA-3’；下游引物序列：5’-TCAAACAGGAGCAGCAGAAAG-3’；

EST4-21：上游引物序列：5’-CTGGCTAACAAACAAGGGAC-3’；下游引物序列：5’-CACCGTCATTGAGACCAGATA-3’。

2.根据权利要求1所述的一种甘蔗EST-SSR标记引物组的应用，其特征在于，所述EST-SSR标记引物组应用于甘蔗和/或甘蔗近缘种属种质资源的遗传多样性分析。

3.根据权利要求1所述的一种甘蔗EST-SSR标记引物组的应用，其特征在于，所述EST-SSR标记引物组应用于甘蔗种质资源的可转移性分析和聚类分析。

4.根据权利要求3所述的一种甘蔗EST-SSR标记引物组的应用，其特征在于，所述甘蔗种质资源优选为桂糖35号。

说明书

一种甘蔗EST-SSR标记的制备方法及应用

【技术领域】

[0001] 本发明涉及EST-SSR标记技术领域，特别涉及一种甘蔗EST-SSR标记的制备方法及应用。【背景技术】

[0002] 甘蔗是主要的糖料经济作物，产糖量占世界的三分之二，其杂种后代染色体的高度杂合性、异源多倍性和非整倍性为甘蔗杂交育种工作增加了许多不可控因素，育成一个甘蔗新品种往往需要长达10年或更长时间也成为甘蔗育种程序的主要不利因素，而随着分子生物学的发展，分子遗传标记已成为研究复杂基因组物种的重要工具，利用分子标记技术对复杂基因组进行遗传分析，能快速找出甘蔗育种工作的父本、母本，同时能科学、合理的对子代性状进行预测，有效提高了育种工作的效率。

[0003] 目前，常使用SSR分子标记对甘蔗分子标记分析，例如：中国专利CN 103911435 A公布的利用SSR标记与毛细管电泳鉴定甘蔗杂交种子纯度的方法；中国专利CN 10401759 A公布的一种基于SSR与毛细管电泳技术鉴定甘蔗种质资源的方法，上述两种方法都是利用SSR(Simple Sequenc Repeat)标记方法来对甘蔗的种质资源进行分析验证的，SSR标记方法是利用在染色体上呈随机分布的重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联序列来设计引物，但是，SSR标记的引物开发首先是要从该物种中获取重复序列两侧的序列信息并设计引物，而后才能被利用；而且甘蔗的DNA序列数据有限，目前仅开发了几千条SSR引物，与其它禾本科植物相比较而言，甘蔗基因组较大，目前开发的甘蔗SSR引物数量还远远不够。而EST-SSR分子标记方法，是通过从互补DNA(cDNA)分子中测序得到表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)，然后再从转录出来的标签序列中筛选鉴别SSR位点，通过SSR位点设计引物，再用PCR进行验证。随着各种作物EST的迅速发展及数据库中EST序列的不断增加，通过数据库搜寻法获得EST-SSR标记的报道越来越多，如棉花、大麦、玉米、水稻、黑麦、高粱、小麦、大豆、葡萄、松树、牧草、向日葵和柑橘等中已见报道。但是，目前，还未见甘蔗EST-SSR开发和应用的相关报道。【发明内容】

[0004] 鉴于上述内容，有必要提供一种甘蔗EST-SSR标记的制备方法及应用，能有效提高甘蔗种质资源多态性分析的效率。

[0005] 为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

[0006] 一种甘蔗EST-SSR标记的制备方法，所述方法包括利用甘蔗转录组序列通过筛选鉴别相应种质的SSR位点，然后利用SSR位点两侧的核苷酸序列设计引物得到EST-SSR标记引物，再将EST-SSR标记引物对相应的种质DNA进行标记，利用毛细管凝胶电泳验证标记结果。

[0007] 进一步的，所述EST-SSR标记引物为序列表中EST1-2～EST4-21引物中的任意1对。

[0008] 进一步的，所述EST-SSR标记引物应用于甘蔗和/或甘蔗近缘种属种质资源的遗传多样性分析。

[0009] 进一步的，所述EST-SSR标记引物应用于甘蔗种质资源的可转移性分析和聚类分析。

[0010] 进一步的，所述甘蔗种质资源优选为桂糖35号。

[0011] 本发明具有如下有益效果：

[0012] 1、虽然在应用上EST-SSR和gSSR都有着相同的用途，但由于EST-SSR来自于转录区，与位置不确定的gSSR相比具有更高的应用价值：与gSSR相比，虽然由于EST-SSR的保守性限制了标记的多态性，但EST-SSR高质量标记的比率要比gSSR高；EST-SSR具有更好的通用性，这在亲缘物种之间校正基因组连锁图谱和比较作图方面有很高的利用价值；该标记从转录区域产生，通常都代表着某种功能，这种功能可以通过序列同源性比对获得，还能为功能基因提供“绝对”标记，能对重要性状的等位基因进行直接鉴定，更有利于连锁基因的研究工作；当EST-SSR用于种质资源评价时，它表现的是转录区的差异，因而能够反映出“真实的遗传多样性”；在应用于分子标记辅助选择时，EST-SSR位于控制目标性状的基因内部，可以进行直接的等位基因选择。

[0013] 本申请利用不断更新的甘蔗dbEST数据库和本单位开展的甘蔗转录组测序调查项目所获得的数据库开发出新的EST-SSR，能快速、简便的对甘蔗及其近缘种属进行遗传多样性分析检测其多态性，再选择多态性高的遗传标记对本单位近年来所育新材料与系谱亲本间的遗传关系进行分析，可为甘蔗遗传多样性和遗传关系的应用研究提供更多有效的SSR标记，从而为甘蔗在遗传育种中的研究诸如QTL分析、亲缘关系鉴定、遗传多样性研究及杂种优势预测等方面提供有价值的遗传工具，并通过系谱亲本间遗传关系的研究为甘蔗育种亲本的合理选配及甘蔗种质的创新利用提供参考依据。【附图说明】

[0014] 图1是引物EST1-9在Guitang12(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0015] 图2是引物EST1-9在Guitang15(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0016] 图3是引物EST1-9在Guitang18(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0017] 图4是引物EST1-9在Guitang21(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0018] 图5是引物EST1-9在Guitang28(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0019] 图6是引物EST1-9在Guitang29(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0020] 图7是引物EST1-9在Guitang32(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0021] 图8是引物EST1-9在Guitang35(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0022] 图9是引物EST1-9在Guitang37(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0023] 图10是引物EST1-9在Guitang43(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0024] 图11是引物EST1-9在Guifu98-296(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0025] 图12是引物EST1-9在ROC16(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0026] 图13是引物EST1-9在ROC25(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0027] 图14是引物EST1-9在Yunzhe06-281(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0028] 图15是引物EST1-9在Yunzhe05-250(Saccharum sp.)种质的扩增毛细管电泳图；

[0029] 图16是引物EST1-9在Badila(S.officinarum)种质的扩增毛细管电泳图；

[0030] 图17是引物EST1-9在GXS85-30(S.spontaneum)种质的扩增毛细管电泳图；

[0031] 图18是引物EST1-9在57NG208(S.robustum)种质的扩增毛细管电泳图；

[0032] 图19是引物EST1-9在Nagans(S.bareri)种质的扩增毛细管电泳图；

[0033] 图20是引物EST1-9在GuangXi bamboo cane(S.sinense)种质的扩增毛细管电泳图；

[0034] 图21是引物EST1-9在GXB87-36(Erianthus arundinaceus)种质的扩增毛细管电泳图；

[0035] 图22是引物EST1-9在GXN1(Narenga porphyrocoma)种质的扩增毛细管电泳图；

[0036] 图23是甘蔗材料的UPGMA聚类分析树状图。【具体实施方式】

[0037] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

[0038] 实施例：

[0039] 一种甘蔗EST-SSR标记的制备方法，所述方法包括：(1)利用本单位开展的甘蔗转录组测序调查项目所获得的数据库开发出新的EST-SSR引物，再将EST-SSR标记引物对相应的种质DNA进行标记，利用毛细管凝胶电泳验证标记结果；(2)上述EST-SSR标记引物应用于甘蔗和/或甘蔗近缘种属种质资源的遗传多样性分析；(3)上述EST-SSR标记引物还应用于甘蔗种质资源的可转移性分析和聚类分析。

[0040] 具体研究方法为：

[0041] 1、实验材料：甘蔗属及其近缘属(河八王属和蔗茅属)材料；

[0042] 2、分析方法：对品种为桂糖35号(Guitang35)的甘蔗品种进行转录组测序，将所获得的序列与NCBI的甘蔗dbEST数据库进行比对，在比对结果中针对测序所获得的新序列筛查SSR位点并设计引物，则所设计引物的SSR位点均为新位点。应用桂糖35号(Guitang35)作为模板进行验证，经验证，共有50对EST-SSR标记引物(见表1)符合要求，将50对EST-SSR标记引物分别对22个不同亲本的甘蔗栽培种材料进行标记，并利用毛细管凝胶电泳验证标记结果，绘制聚类分析树状图。

[0043] 表1

[0044]

[0045]

[0046] 对上述的EST-SSR标记引物进行多态性分析，结果显示(表2)：

[0047] 表2：

[0048]

[0049]

[0050] 由上表可知，上述EST-SSR标记引物的多态性信息含量(PIC)为0.76(EST1-7)～0.95(EST1-9等)，平均值为0.92，表现出高多态性；对开发的EST-SSR标记在甘蔗近缘属间可转移性进行分析，表明，在蔗茅属(Erianthus Michanx)和河八王属(Narenga Bor)间的可转移性不高(平均值分别为24.0％和33.8％)，然而在河八王属中的可转移性明显优于蔗茅属。

[0051] 应用开发的50对EST-SSR标记引物对22个不同种属的甘蔗材料(表3)进行毛细管电泳扩增，(本申请仅列举EST1-9引物对不同种属的甘蔗材料进行扩增的电泳图，结果如图1-图22所示)，根据显示的结果进行聚类分析得到如图23所示的甘蔗材料UPGMA聚类分析树状图。

[0052] 表3

[0053] 样品编号 名称 亲本1 Guitang12(Saccharum sp.) 印度419×川者57-416
2 Guitang15(Saccharum sp.) 华南56-12×内江59-782
3 Guitang18(Saccharum sp.) CP65-357×F172
4 Guitang21(Saccharum sp.) 赣蔗76-65×崖城71-374
5 Guitang28(Saccharum sp.) CP80-1018×CP89-1475
6 Guitang29(Saccharum sp.) 崖城94-46×ROC22
7 Guitang32(Saccharum sp.) 粤糖91-976×ROC1
8 Guitang35(Saccharum sp.) ROC23×CP84-1198
9 Guitang37(Saccharum sp.) 湛蔗92-126×CP72-2086
10 Guitang43(Saccharum sp.) 粤糖85-177×GT92-66
11 Guifu98-296(Saccharum sp.) Guitang91-131经Coγ射线辐照诱变选育而成
12 ROC16(Saccharum sp.) F171×74-575
13 ROC25(Saccharum sp.) 79-6048×69-463
14 Yunzhe06-281(Saccharum sp.) 德蔗93-88×云瑞99-155
15 Yunzhe05-250(Saccharum sp.) 粤农73-204×CP72-1210
16 Badila(S.officinarum)  
17 GXS85-30(S.spontaneum)  
18 57NG208(S.robustum)  
19 Nagans(S.bareri)  
20 GuangXi bamboo cane(S.sinense)  
21 GXB87-36(Erianthus arundinaceus)  
22 GXN1(Narenga porphyrocoma)  

[0054] 根据图23的甘蔗材料UPGMA聚类分析树状图表明：供试22份材料的遗传相似系数为0.390～0.733，变幅较大，平均值为0.591，其中Guitang29与斑茅GXB87-36的相似系数最小，Guitang32与Guitang35的相似系数最大；蔗茅属中的斑茅GXB87-36(Erianthus arundinaceus)在聚类图中形成单独的分支，作为甘蔗的近缘属，表现出与其它资源较远的亲缘关系；在相似系数0.46处的21份材料聚成两个类群，第1类群的20个材料均属于甘蔗属，第2类群的GXN1(Narenga porphyrocoma)为河八王属；在相似系数0.49处，又将21份甘蔗属材料聚成两个小类群，第1小类群的20份材料包含了所有的栽培种、热带种中的拔地拉(Badila)、大茎野生种(57NG208)、印度种(Nagans)与中国种(Guangxi bamboo cane)，第2小类群为割手密(GXS85-30)，与预期的亲缘关系密切程度相一致。最终将结果绘制成聚类分析树状图(图11)：

[0055] 综上所述，使用本发明的EST-SSR标记方法和本申请人设计的50对EST-SSR标记引物能有效提高标记的效率，对甘蔗属种质进行亲缘分析。

[0056] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。