一种利用热带爪蟾胚胎测定水环境样品发育毒性的方法

摘要

本发明公开了一种利用热带爪蟾胚胎测定水环境样品发育毒性的方法，包括以下步骤：1)挑选性成熟热带爪蟾，待蛙抱对产卵结束后收集胚胎；2)将采集好的待测水环境样品按倍比稀释，作为暴露组；3)挑选NF8‑11阶段的胚胎，培养并记录孵化个数，将未孵化的胚胎挑出，48h统计死亡个数；4)将存活胚胎处理后固定于4％的甲醛溶液中，观察胚胎的发育状况，并拍照分析处理；5)进行数据的统计分析；6)对毒性进行分级为无毒、轻毒、中毒和重毒。本发明通对畸形类型进行统计，建立畸形表型识别图谱，确定对应的畸形程度分级，建立畸形表型统计表，并计算不同浓度水环境样品的总畸形分值。所建立的胚胎的畸形表型类型覆盖全面，数据易整理，结果直观。

权利要求

1.一种利用热带爪蟾胚胎测定水环境样品发育毒性的方法,其特征在于，包括以下步骤：

1)挑选性成熟热带爪蟾多对，采用人工注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)注射液100单位，置于黑暗安静的环境进行抱对产卵；成蛙每隔3个月有规律重复注射，常年循环使用；每只爪蟾都进行2次注射，待蛙抱对产卵结束后收集胚胎；

2)将采集好的待测水环境样品标记好并在4℃下保存，分别取该样品按照100％、50％、

25％、12.5％倍稀释，得到共4组待测试样品，分别作为暴露组，另外再设置一个对照组；

3)挑选NF8-11阶段的胚胎，4个暴露组和1个对照组各组均设4个平行，每个90mm的培养皿中20个胚胎，加入40ml培养液，放在生化培养箱中培养；温度26±0.5℃，光周期12小时白天12小时黑，24h换液，记录孵化个数，并将未孵化的胚胎挑出，48h统计死亡个数；暴露2天后用4％的甲醛固定；

4)将存活胚胎用100mg/L MS-222麻醉处理后固定于4％的甲醛溶液中，取出经固定的胚胎，在Nikon解剖镜下观察胚胎的发育状况，用Nikon DS-SM型显微照相系统进行拍照，图像用Photoshop7.0分析处理，在光学显微镜下观察，用显微照相系统照相；相关指标有：孵化率、死亡率、畸形率、体长，判断畸形类型；

5)用SPSS16.0进行数据的统计分析；以每盘中的胚胎为一个平行样，数据以平均值±标准差(S.D.)表示，n＝4；用Tukey-test进行分析；对水环境样品的评价主要采用四项指标：死亡率、畸形率、生长抑制率和畸形表型值；

6)通过统计分析显示，若暴露组的胚胎各评价指标明显高于或低于对照组，则说明被检测的水环境样品有发育毒性；同时，根据胚胎畸形表型对正常、轻微、中等和严重组进行赋分值0、1、2和3分，分值越大，危害程度越大，毒性越强，并根据分值对毒性进行分级为无毒、轻度毒性、中度毒性和重度毒性；

所述人绒毛膜促性腺激素(HCG)注射液的配制方法：用10cc的注射器注射5.0ml 0.9％的盐水溶液到5000单位的HCG药瓶中，摇动直到全部溶解，配制成人体绒毛膜促性腺激素(HCG)储备液1000单位/ml；用1.0cc的注射器加0.15ml HCG储备液到0.85ml 0.9％的盐水溶液，摇动直到全部混合，配制成HCG注射液150单位/ml，HCG注射液被用来进行人工诱导性成熟和抱对；

所述畸形表型值是于畸形表型进行赋值得到的，畸形类型主要包括：头部变小、眼睛变小、眼睛变大、眼睛有异物、唾液腺位移、围心腔水肿、躯干增大、皮肤色素减少、泄殖腔水肿、泄殖腔后移、鳍变窄、尾巴弯曲、脊柱弯曲。

说明书

一种利用热带爪蟾胚胎测定水环境样品发育毒性的方法

技术领域

[0001] 本发明属于水环境样品毒性的生物检测技术领域，具体来讲是涉及一种利用热带爪蟾胚胎测定水环境样品发育毒性的方法。

背景技术

[0002] 热带爪蟾是负子蟾科下的一种青蛙。它们是爪蟾属下唯一拥有二倍体基因组的，且已被DNA序列，补充了非洲爪蟾成为遗传学上的模式生物。特征是无舌，上叛有齿，耳咽管(欧氏管)汇合成一个，仅有一耳咽管口，开口在上瓢的后端。颤骨很原始，蝶筋骨和副蝶骨癫合在一起。上颖骨退化，具有瘤合的前锄骨。身体遍布粘液腺，因此很滑、后肢有五趾，趾简有蹼，其中三趾生有黑色趁利的爪，故名爪蟾躲，籍牛保留侧换器官，永远生活在水中，幼体从卵中孵出时已无外鳃。补充了非洲爪蟾成为遗传学上的模式生物。与非洲爪蟾相比，热带爪蟾个体更小、生长周期更短(3-6个月)、产卵量更大(2000-3000个)、基因组结构(2倍体)更简单和胚胎发育更快等优点。因此热带爪蟾是发育生物学、胚胎学和细胞生物学中重要的模式生物。与鱼类相比，热带爪蟾与人类的亲缘关系更近，更适合于进行健康风险评价。并且对于某些污染物，热带爪蟾更为敏感，

[0003] 热带爪蟾一年四季均可人工诱导排卵，并且产卵量大，保证了充足的实验材料。热带爪蟾胚胎非常适合进行分子操作，目前不仅发展了针对爪蟾早期胚胎发育的成熟的实验技术，如显微注射、转基因和荧光原位杂交等技术，而且大量针对热带爪蟾的特异性抗体甚至基因芯片等均可从商业途径获得。运用爪蟾胚胎畸形表型特征，结合分子标志物能够灵敏地表征微污染水体的毒理学效应。热带爪蟾在生态毒理学研究中具有广阔的应用前景。有研究表明，热带爪蟾蝌蚪可用于甲状腺激素干扰物的筛选，并且由于热带爪蟾性成熟快等特点，在生殖毒性的研究中有明显优势。在热带爪蟾作为模式生物发展日益成熟和毒理学体外测试方法需求强烈的双重背景下，胚胎期的热带爪蟾将在毒理学研究中发挥更重要的作用。

[0004] 胚胎致畸实验是检测水环境中的污染物发育毒性的有效方法，用胚胎实验代替个体实验也是今后毒性检测和毒理学研究的趋势。热带爪蟾在胚胎致畸实验中可以取代非洲爪蟾，不同浓度的污染物引起的胚胎畸形特征不同，这为污染物致畸机制的解析提供了形态学依据。

发明内容

[0005] 本发明解决的技术问题是提供一种利用热带爪蟾胚胎测定水环境样品发育毒性的方法。

[0006] 本发明的技术方案是：一种利用热带爪蟾胚胎测定水环境样品发育毒性的方法，包括以下步骤：

[0007] 1)挑选性成熟热带爪蟾多对，采用人工注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)注射液100单位，置于黑暗安静的环境进行抱对产卵；成蛙每隔3个月有规律重复注射，常年循环使用；每只爪蟾都进行2次注射，待蛙抱对产卵结束后收集胚胎；

[0008] 2)将采集好的待测水环境样品标记好并在4℃下保存，分别取该样品按照100％、50％、25％、12.5％倍稀释，得到共4组待测试样品，分别作为暴露组，分别记做S1、S2、S3、S4，另外再设置一个对照组，记做S5；

[0009] 3)挑选NF8-11阶段的胚胎，4个暴露组和1个对照组各组均设4个平行，每个90mm的培养皿中20个胚胎，加入40ml培养液，放在生化培养箱中培养；温度26±0.5℃，光周期12小时白天12小时黑夜，24h换液，记录孵化个数，并将未孵化的胚胎挑出，48h统计死亡个数；暴露2天后用4％的甲醛固定；

[0010] 4)将存活胚胎用100mg/L MS-222麻醉处理后固定于4％的甲醛溶液中，取出经固定的胚胎，在Nikon解剖镜下观察胚胎的发育状况，用Nikon DS-SM型显微照相系统进行拍照，图像用Photoshop7.0分析处理，在光学显微镜下观察，用显微照相系统照相；相关指标有：孵化率、死亡率、畸形率、体长，判断畸形类型；

[0011] 5)用SPSS16.0进行数据的统计分析；以每盘(每孔)中的胚胎为一个平行样，数据以平均值±标准差(S.D.)表示，n＝4；用Tukey-test进行分析；对水环境样品的评价主要采用四项指标：死亡率、畸形率、生长抑制率和畸形表型值，结果如表1所示；

[0012] 表1热带爪蟾胚胎暴露实验结果统计表

[0013]

[0014] 6)通过统计分析显示，若暴露组的胚胎各评价指标明显高于或低于对照组则说明被检测的水环境样品有发育毒性；同时，根据胚胎畸形表型对正常、轻微、中等和严重组进行赋分值0、1、2和3分，分值越大，危害程度越大，毒性越强，并根据分值对毒性进行分级为无毒、轻度毒性、中度毒性和重度毒性。

[0015] 进一步地，在上述方案中，所述人绒毛膜促性腺激素(HCG)储备液的配制方法：用10cc的注射器注射5.0ml 0.9％的盐水溶液到5000单位的HCG药瓶中，摇动直到全部溶解，配制成人体绒毛膜促性腺激素(HCG)储备液1000单位/ml)；用1.0cc的注射器加0.15ml HCG储备液到0.85ml 0.9％的盐水溶液，摇动直到全部混合，配制成HCG注射液(150单位/ml)，HCG注射液被用来进行人工诱导性成熟和抱对。

[0016] 进一步地，在上述方案中，所述畸形表型值是于畸形表型进行赋值得到的，所涉及的畸形类型主要包括：头部变小、眼睛变小、眼睛变大、眼睛有异物、唾液腺位移、围心腔水肿、躯干增大、皮肤色素减少、泄殖腔水肿、泄殖腔后 移、鳍变窄、尾巴弯曲、脊柱弯曲，对畸形类型进行统计，然后根据畸形类型统计建立畸形表型识别图谱(如图1所示)，确定对的畸形程度分级，根据水环境样品浓度数据对应的畸形类型的畸形程度分值，建立畸形表型统计表，并计算不同浓度水环境样品的畸形分值(如表2所示)，确定毒性分级体系(如表3所示)，从而确定所测水环境样品对热带爪蟾的发育毒性强度。

[0017] 表2畸形表型统计表

[0018]

[0019] 表3发育毒性分级体系

[0020]发育毒性程度 无毒 轻度毒性 中度毒性 重度毒性
总畸形分值 0 1-13 14-26 27-39

[0021] 本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明挑选发育时期一致的热带爪蟾胚胎进行水环境样品毒性对比暴露实验，通过显微镜照相系统获取每只胚胎的特征图像，对畸形类型进行统计，然后根据畸形类型统计建立畸形表型识别图谱，确定对应的畸形程度分级，根据水环境样品浓度数据对应的畸形类型的畸形程度分值，建立畸形表型统计表，并计算不同浓度水环境样品的总畸形分值确定毒性分级体系，从而确定所测水环境样品对热带爪蟾的发育毒性程度。所建立的胚胎的畸形表型类型覆盖全面，数据易整理，原理简单，结果直观。

附图说明

[0022] 图1-a是头部变小、眼睛变小、眼睛变大、眼睛有异物、唾液腺位移各畸形表型的识别图谱，图1-b是围心腔水肿、躯干增大、皮肤色素减少、泄殖腔水肿、泄殖腔后移各畸形表型的识别图谱，图1-c是鳍变窄、尾巴弯曲、脊柱弯曲各畸形表型的识别图谱。

具体实施方式

[0023] 以某污染取水源为水环境样品，进行发育毒性测定，具体方法包括以下步骤：

[0024] 1)挑选性成熟热带爪蟾多对，采用人工注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)注射液100单位，置于黑暗安静的环境进行抱对产卵；成蛙每隔3个月有规律重复注射，常年循环使用；每只爪蟾都进行2次注射，待蛙抱对产卵结束后收集胚胎；

[0025] 2)将采集好的待测水环境样品标记好并在4℃下保存，分别取该样品按照100％、50％、25％、12.5％倍稀释，得到共4组待测试样品，分别作为暴露组，分别记做S1、S2、S3、S4，另外再设置一个对照组，记做S5；

[0026] 3)挑选NF8-11阶段的胚胎，4个暴露组和1个对照组各组均设4个平行，每个90mm的培养皿中20个胚胎，加入40ml培养液，放在生化培养箱中培养；温度26±0.5℃，光周期12小时白天12小时黑夜，24h换液，记录孵化个数，并将未孵化的胚胎挑出，48h统计死亡个数；暴露2天后用4％的甲醛固定；

[0027] 4)将存活胚胎用100mg/L MS-222麻醉处理后固定于4％的甲醛溶液中，取出经固定的胚胎，在Nikon解剖镜下观察胚胎的发育状况，用Nikon DS-SM型显微照相系统进行拍照，图像用Photoshop7.0分析处理，在光学显微镜下观 察，用显微照相系统照相；相关指标有：孵化率、死亡率、畸形率、体长，判断畸形类型；

[0028] 5)用SPSS16.0进行数据的统计分析；以每盘(每孔)中的胚胎为一个平行样，数据以平均值±标准差(S.D.)表示，n＝4；用Tukey-test进行分析；对水环境样品的评价主要采用四项指标：死亡率、畸形率、生长抑制率和畸形表型值，结果如表1所示；

[0029] 6)通过统计分析显示，若暴露组的胚胎各评价指标明显高于或低于对照组则说明被检测的水环境样品有发育毒性；同时，根据胚胎畸形表型对正常、轻微、中等和严重组进行赋分值0、1、2和3分，分值越大，危害程度越大，毒性越强，并根据分值对毒性进行分级为无毒、轻度毒性、中度毒性和重度毒性。

[0030] 其中，所述人绒毛膜促性腺激素(HCG)储备液的配制方法：用10cc的注射器注射5.0ml 0.9％的盐水溶液到5000单位的HCG药瓶中，摇动直到全部溶解，配制成人体绒毛膜促性腺激素(HCG)储备液1000单位/ml)；用1.0cc的注射器加0.15ml HCG储备液到0.85ml 
0.9％的盐水溶液，摇动直到全部混合，配制成HCG注射液(150单位/ml)，HCG注射液被用来进行人工诱导性成熟和抱对。

[0031] 其中，所述畸形表型值是于畸形表型进行赋值得到的，所涉及的畸形类型主要包括：头部变小、眼睛变小、眼睛变大、眼睛有异物、唾液腺位移、围心腔水肿、躯干增大、皮肤色素减少、泄殖腔水肿、泄殖腔后移、鳍变窄、尾巴弯曲、脊柱弯曲，对畸形类型进行统计，然后根据畸形类型统计建立畸形表型识别图谱(如图1所示)，确定对应的畸形程度分级，根据水环境样品浓度数据对应的畸形类型的畸形程度分值，建立畸形表型统计表，并计算不同浓度水环境样品的总畸形分值(如表2所示)，确定毒性分级体系(如表3所示)，从而确定所测水环境样品对热带爪蟾的发育毒性强度。

[0032] 察，用显微照相系统照相；相关指标有：孵化率、死亡率、畸形率、体长，判断畸形类型；

[0033] 5)用SPSS16.0进行数据的统计分析；以每盘(每孔)中的胚胎为一个平行样，数据以平均值±标准差(S.D.)表示，n＝4；用Tukey-test进行分析；对水环境样品的评价主要采用四项指标：死亡率、畸形率、生长抑制率和畸形表型值，结果如表1所示；

[0034] 6)通过统计分析显示，若暴露组的胚胎各评价指标明显高于或低于对照组则说明被检测的水环境样品有发育毒性；同时，根据胚胎畸形表型对正常、轻微、中等和严重组进行赋分值0、1、2和3分，分值越大，危害程度越大，毒性越强，并根据分值对毒性进行分级为无毒、轻度毒性、中度毒性和重度毒性。

[0035] 其中，所述人绒毛膜促性腺激素(HCG)储备液的配制方法：用10cc的注射器注射5.0ml 0.9％的盐水溶液到5000单位的HCG药瓶中，摇动直到全部溶解，配制成人体绒毛膜促性腺激素(HCG)储备液1000单位/ml)；用1.0cc的注射器加0.15ml HCG储备液到0.85ml 
0.9％的盐水溶液，摇动直到全部混合，配制成HCG注射液(150单位/ml)，HCG注射液被用来进行人工诱导性成熟和抱对。

[0036] 其中，所述畸形表型值是于畸形表型进行赋值得到的，所涉及的畸形类型主要包括：头部变小、眼睛变小、眼睛变大、眼睛有异物、唾液腺位移、围心腔水肿、躯干增大、皮肤色素减少、泄殖腔水肿、泄殖腔后移、鳍变窄、尾巴弯曲、脊柱弯曲，对畸形类型进行统计，然后根据畸形类型统计建立畸形表型识别图谱(如图1所示)，确定对应的畸形程度分级，根据水环境样品浓度数据对应的畸形类型的畸形程度分值，建立畸形表型统计表，并计算不同浓度水环境样品的总畸形分值(如表2所示)，确定毒性分级体系(如表3所示)，从而确定所测水环境样品对热带爪蟾的发育毒性强度。

[0037] 表1热带爪蟾胚胎暴露实验结果统计表

[0038]

[0039] 表2畸形表型统计表

[0040]

[0041] 表2发育毒性分级体系

[0042]发育毒性程度 无毒 轻度毒性 中度毒性 重度毒性
总畸形分值 0 1-13 14-26 27-39

[0043] 由以上结果可见，采用本发明的毒性测定方法可以准确判断出该水环境样品的发育毒性，并能够对其毒性等级进行清楚的表其中，S1为重度毒性、S2为中度毒性、S3为轻度毒性、S4为轻度毒性、S5为无毒。所以本发明的水环境样品发育毒性的测定是可靠的。