一株牛支原体及其应用

摘要

本发明公开了一株牛支原体及其应用，所述的牛支原体为牛支原体(Mycoplasma bovis)HNMB1，保藏编号：CGMCC NO：13295，保藏日期：2016年11月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明中的菌株HNMB1分离自发生典型呼吸道症状死亡的奶犊牛，在PPLO固体培养基上分离时无其它细菌生长，只有支原体生长，在PPLO液体培养基中增殖滴度高，达109CFU/mL以上。本发明中的菌株HNMB1对犊牛具有较强的致病力，引起犊牛发病死亡，具有良好的免疫原性。

权利要求

1.一株牛支原体，其特征在于：所述的牛支原体为牛支原体(Mycoplasmabovis)HNMB1，保藏编号：CGMCC NO：13295，保藏日期：2016年11月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.一种如权利要求1所述的牛支原体在制备牛支原体灭活疫苗方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的牛支原体灭活疫苗中，牛支原体菌量为1×109CFU/mL。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的牛支原体灭活疫苗的制备方法为：将所述的牛支原体依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入佐剂即得疫苗。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的佐剂为氢氧化铝佐剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的牛支原体灭活疫苗的制备方法为：将牛支原体接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，3天后收取培养物，测9

定浓度，调整培养物中的菌数为2×10 CFU/mL，加入甲醛至终浓度为0.2％，于37℃灭活

12h；灭活后的培养物按体积比1:1加入氢氧化铝佐剂，混合制得牛支原体灭活疫苗。

说明书

一株牛支原体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一株牛支原体及其应用。

背景技术

[0002] 牛支原体(Mycoplasma bovis)主要引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎、生殖道炎症以及流产和不孕等疾病。1961年，美国人Hale等首次从在患乳房炎奶牛的牛奶中分离出牛支原体。1976年牛支原体被描述为致呼吸道疾病的主要病因，之后，牛支原体及其相关疾病迅速扩散至世界各个国家和地区的牛群，对世界养牛业的健康发展造成了极大的威胁和了严重的经济损失。2008年以来，我国多地相继发生并广泛流行的以发热、咳嗽和流鼻涕为主要症状，以坏死性肺炎为主要病变的牛呼吸道传染病亦被确定为牛支原体感染所致的牛支原体肺炎，由于该病常规药物疗效不佳，且无有效疫苗进行预防，因此给我国的养牛业造成了严重经济损失。

发明内容

[0003] 为了解决上述问题，本发明的目的是提供一株牛支原体及其应用，该菌株毒力强，制备的疫苗免疫性好。

[0004] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

[0005] 一株牛支原体，所述的牛支原体为牛支原体(Mycoplasma bovis)HNMB1，保藏编号：CGMCC NO：13295，保藏日期：2016年11月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0006] 一种牛支原体在制备牛支原体灭活疫苗方面的应用。

[0007] 所述的牛支原体灭活疫苗中，牛支原体菌量为1×109CFU/mL。

[0008] 所述的牛支原体灭活疫苗的制备方法为：将所述的牛支原体依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入佐剂即得疫苗。

[0009] 所述的佐剂为氢氧化铝佐剂。

[0010] 所述的牛支原体灭活疫苗的制备方法为：将牛支原体接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，3天后收取培养物，测定浓度，调整培养物中的菌数为2×109CFU/mL，加入甲醛至终浓度为0.2％，于37℃灭活12h；灭活后的培养物按体积比1:1加入氢氧化铝佐剂，混合制得牛支原体灭活疫苗。

[0011] 本发明的有益效果：

[0012] 1、本发明中的菌株HNMB1分离自发生典型呼吸道症状死亡的奶犊牛，在PPLO固体培养基上分离时无其它细菌生长，只有支原体生长，在PPLO液体培养基中增殖滴度高，达109CFU/mL以上。

[0013] 2、本发明中的菌株HNMB1对犊牛具有较强的致病力，引起犊牛发病死亡，具有良好的免疫原性。

[0014] 3、根据本发明中的菌株HNMB1制备的疫苗对牛的支原体肺炎具有较好的保护效果。

附图说明

[0015] 图1为菌株HNMB1菌落4×显微镜下形态。

[0016] 图2为菌株HNMB1菌体吉姆萨染色100×显微镜下形态。

[0017] 图3为菌株HNMB1的PCR鉴定结果，图中的Marker为DL 2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；1为引物MB1，MB2对牛支原体标准株的扩增结果；2为引物MB1，MB2对菌株HNMB1的扩增结果；3为引物MB3，MB4对菌株HNMB1的扩增结果；从图中可以看出，模板PCR扩增片段约为1390bp，证明扩增片段为目的片段，符合预期设计大小。

具体实施方式

[0018] 以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

[0019] 实施例1、牛支原体的分离和鉴定

[0020] 1.1病料采集

[0021] 病料来自于2016年11月在河南省济源市某大型奶牛场发生重症肺炎呼吸困难死亡的2月龄黑白花奶牛。

[0022] 1.2培养基的制备

[0023] PPLO液体培养基：PPLO肉汤粉10.5g，葡萄糖2.5g，酵母粉2.5g，溶于440mL超纯水中，115℃灭菌15min，加MEM培养基5mL、马血清50mL、青霉素8万单位、无菌10％精氨酸10mL和1％(w/v)酚红500μL。培养基于115℃灭菌15min后，于4℃保存备用。

[0024] PPLO固体培养基：1.5％(w/v)琼脂粉的PPLO液体培养基。培养基于115℃灭菌15min后，于4℃保存备用。

[0025] 1.3支原体的分离培养

[0026] 无菌条件下将采集的病肺组织切成小块。将小块组织的切面涂于PPLO固体培养基表面，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。3～5d后，无明显的其它细菌生长，肉眼见极小的针尖状菌落，低倍显微镜下观察固体培养基上菌落的形态，形态为典型的支原体“煎荷包蛋样”(见图1)。挑取PPLO固体培养基上具有“煎荷包蛋样”典型特征的菌落，纯化。吉姆萨染色(见图2)，油镜下观察支原体菌体形态，为多形态，呈球菌样、弯曲的丝状、螺旋状，命名为菌株HNMB1。

[0027] 1.4菌株的鉴定

[0028] 1.4.1设计引物

[0029] 根据牛支原体16S rRNA的序列设计一对通用引物，用于牛支原体的扩增，引物序列如下：

[0030] MB1：5’-CCTTAGGCAGTTTCTTTATAA-3’(SEQ ID NO.1)

[0031] MB2：5’-CATGCATGTCGAGCGATGAT-3’(SEQ ID NO.2)

[0032] 扩增片段大小为1390bp。

[0033] 同时设计一对牛传染性胸膜肺炎支原体的特异性引物，用于牛传染性胸膜肺炎支原体的扩增，引物序列如下：

[0034] MB3：5’-ATATACTTCTGTTCTAGTAA TATG-3’(SEQ ID NO.3)

[0035] MB4：5’-CTGAT TATGATGACAGTGGTCA-3’(SEQ ID NO.4)

[0036] 扩增片段大小为277bp。

[0037] 1.4.2PCR鉴定

[0038] 将菌株HNMB1接种PPLO液体培养基，置于37℃5％CO2培养箱中培养3d后，培养基由红色变为黄色，收集菌体，按照DNA提取试剂盒的操作步骤提取出菌株HNMB1的DNA，分光光度计测定浓度为100μg/mL，分别用MB1，MB2和MB3，MB4扩增进行PCR鉴定。同时，设置牛支原体标准株为阳性对照。

[0039] PCR扩增反应体系为25μL：10×缓冲液2.5μL，2.5mM(each)dNTPs Mix0.5μL，10μM/L通用引物MB1，MB2(或MB3，MB4)各1μL，5U/μL rTaq 1μL，100μg/mL DNA模板1μL，加入ddH2O至25μL。

[0040] 反应条件：95℃预变性5min，进入循环：95℃1min，57℃1min，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物4℃保存。

[0041] 扩增产物分别进行电泳，每孔加样10μL，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果(见图3)。图3看出，MB1，MB2扩增出符合预期大小片段，经测序与牛支原体HB0801-P180株(Genbank No.CP007591)同源性100％，测序结果如下。MB3，MB4未扩增出片段，证明所分离的毒株HNMB1为牛支原体(Mycoplasma bovis)，不是牛传染性胸膜肺炎支原体。

[0042] CCTTAGGCAGTTTCTTTATAAACCGACTTCGGGCATTACCAGCTCCCATGGTTTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGAGAACGTATTCACCGTAGCGTAGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGAAGTCGAGTTGCAGACTTCAATCCGAACTGAGAACGGTTTTTTGAGGTTTGCTCCATGTCACCACTTCGCTTCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCCACTCGTAAGAGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCCGATTACTCGGGCAGTCTCCTTAGAGTGCTCAACTAAATGGTAGTAACTAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCAGGACTTAACCGAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCATCTGTCATTCTGTTAACCTCCACTATGTCTCCATAGCTTTGCAGAAGATGTCAAGAGTGGGTAAGGTTCTACGCGTAACATCAAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGATCCCCGTCAATTCCTTTAAGTTTTATTCTTGCGAACGTACTACTCAGGCGGATCATTTAATGCGTTAGCTGCGTCGATGAGTTCCCCATCAACTAATGATCATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTCTCTCAGTGTCAGTGTATGCCCAGTTAGCTGCCTTCGCCATATTGATGTTCTTCCTTATATCTACGCATTTCACCGCTTCACAAGGAATTCCGCTAACCTCTACATAACTCTAGTCTGCCAGTATCCAACGCGTTTTGGGGTTGAGCCCCAAAATTTAACGCCAGACTTAACAAACAACCTACAGACGCTTTACGCCCAATAATTTCGGATAACGCTTGCAACCTATGTATTACCGCGGCTGCTGGCACATAGTTAGCCGTTGCTTTCTAA TCAGGTACCGTCAAGGTAGCATCATTTCCTATGCTACTTTTTCTTCCCTAACCACAGCAGTTTACAACCCATAGGGCCTTCATCCTGCACGCTGTGTCGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAATATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAGTGTGGCGGATCAATCTCTCAACCCCGCTAAACATCATCGCCTTGGTGGGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGTTGCGCACTCCGATCTTTTAGCGAAGCAAACGCTTCCTTTTATATTACTTTCATGCAAAAATAATAAGTATTCGGTATTATCGGATGTTTCCATCCGCTATCCCAATCTAAAAGGTACGTTGAGTACGTGTTACTCACCCATTCGCCGCTATGATATTGCTATCATCGCTCGACATGCATG(SEQ ID NO.5)

[0043] 1.5毒力试验

[0044] 试验牛为2月龄健康的黑白花奶牛，公牛、母牛各8头。试验动物分为两组，对照组8头，试验组8头。两组试验动物各包括随机分组的公牛2头、母牛2头。将HNMB1接种PPLO液体培养基，37℃5％CO2培养箱中培养3d后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，低倍镜下活菌计数，计算原液菌体浓度，为3.1×109CFU/mL，再调整至108CFU/mL，试验组动物通过喉气管接种3mL支原体液体培养物，对照组动物通过喉气管接种3mL灭菌的PPLO液体培养基。试验期为15d，每天观察试验动物的临床表现，测量体温，如试验动物死亡则立即进行剖杀，观察呼吸道病变病采集病料。于15d试验结束时，剖杀所有试验动物。

[0045] 试验组动物在接种支原体24h后表现出呼吸道分泌物增多、咳嗽等症状，体温升高，不食，反刍停止，7天后死亡1头，10天后死亡2头。对照组动物在试验期间体温正常且无明显的呼吸道症状。试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀4头对照组动物。采集病料，进行支原体分离。试验组剖检胸膜有大量纤素样渗出，肺隔叶部分出现肉样实变，胸腔积液。对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的4份病料均未分离到支原体，试验组的4份病料中均分离到牛支原体，菌落形态表现为“煎荷包蛋样”，PCR鉴定结果与HNMB1一致。

[0046] 实施例2、疫苗的制备、安全性和效力试验

[0047] 2.1疫苗的制备

[0048] 将牛支原体菌株HNMB1接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，3天后收取培养物，测定浓度，调整培养物中的菌数为2×109CFU/mL，加入甲醛至终浓度为0.2％，于37℃灭活12h。灭活后的培养物按体积比1:1加入氢氧化铝佐剂，混合制得牛支原体灭活疫苗。

[0049] 2.2疫苗的安全性试验：

[0050] 选取60日龄健康黑白花奶牛10头，分为2组，每组5头。疫苗组：颈部肌肉注射10mL本疫苗；对照组：颈部肌肉注射10mL灭菌生理盐水。观察30天。观察期间，疫苗组和对照组的奶牛均健康活泼，早晚体温、采食量差异均不显著，说明本发明的灭活疫苗安全。

[0051] 2.3疫苗的效力试验

[0052] 选取30日龄健康黑白花奶牛30头，分为6组，每组5头。具体为：疫苗1-4组：每组分别注射本疫苗0.5ml、1ml、1.5ml和2ml，第5组为未免疫组，第6组为健康对照组，注射2mL灭菌生理盐水。疫苗组和健康对照组60日后二免注射同等剂量的疫苗或灭菌生理盐水。二免后1个月各组用109CFU的HNMB1采取气管注射的攻毒方式进行攻毒。攻毒后第2天开始每天采集鼻拭子，第10天开始每3天采一次鼻拭子，鼻拭子过滤后，做固体培养基培养。在攻毒后10天，40天，结合临床情况，剖检实验动物，采集喉拭子，肺脏等器官进行牛支原体分离培养。

[0053] 观察结果：疫苗组与未免疫组奶牛有明显的差异，攻毒后，未免疫组第二天开始出现临床症状，体温升高，流涕，呼吸困难，减食甚至绝食，反刍停止，7天后开始出现死亡，2周后共死亡4头。剖检结果：肺脏与胸腔发生粘连严重，胸腔积液，肺实变。健康对照组的奶牛均未发病。而疫苗组中，0.5ml疫苗组的5头奶牛中有2头出现临床症状和病例变化；1ml疫苗组的5头奶牛中有1头出现临床症状和病例变化；1.5ml和2ml疫苗组的5头奶牛没有发病。免疫攻毒保护情况见下表。

[0054]

[0055] 注：“—”表示不适用。

[0056] 由上表可以看出，本疫苗的最小免疫保护剂量为0.5ml含菌量为1×109CFU/mL。说明本发明的灭活苗具有良好的保护效果。

[0057] 以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。