一种测定雷迪帕韦纯度的分析方法

摘要

本发明公开了一种测定雷迪帕韦纯度的分析方法，属于检测领域，在高效液相色谱仪上，用以八烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱进行分析，以酸水溶液和有机溶剂为流动相，对雷迪帕韦的样品溶液进行梯度洗脱，按面积归一化法计算雷迪帕韦的纯度及其多个杂质的含量。本发明可以为雷迪帕韦的纯度及其杂质含量的测定提供了一种准确的、高效的检测方法。

权利要求

1.一种测定雷迪帕韦纯度的分析方法，其特征在于：样品配制成含雷迪帕韦约0.5mg/ml的供试品溶液，照高效液相色谱法在配有DAD检测器的反相高效液相色谱仪上进行检测，用以八烷基硅烷键合硅胶为填料，粒径为3.5μm，色谱柱长150mm，色谱柱直径为4.6nm的色谱柱进行分析，在以甲烷磺酸/三氟乙酸/水为流动相A，以甲醇/异丙醇/水为流动相B的流动相体系下进行梯度洗脱，其中甲烷磺酸/三氟乙酸/水的体积比为10/1/89，甲醇/异丙醇/水的体积比为90/1/9，洗脱梯度如下：洗脱时间 A相(％) B相(％)

0min 84 16

25min 25 75

50min 25 75

60min 84 16

检测波长为220nm，柱温35℃，流速为0.8ml/min，取供试品溶液5ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算雷迪帕韦的纯度；所述的供试品溶液中的杂质包括如下四种：

说明书

一种测定雷迪帕韦纯度的分析方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种NS5A蛋白酶抑制剂雷迪帕韦的纯度及其杂质含量的检测方法。技术背景

[0002] 雷迪帕韦(Methyl N-[(2S)-1-[(6S)-6-[5-[9,9-Difluoro-7-[2-[(1S,2S,4R)-3-[(2S)-2-(methoxycarbonylamino)-3-methylbutanoyl]-3-azabicyclo[2.2.1]heptan-
2-yl]-3H-benzimidazol-5-yl]fluoren-2-yl]-1H-imidazol-2-yl]-5-azaspiro[2.4]heptan-5-yl]-3-me thyl-1-oxobutan-2-yl]carbamate)是一种NS5A蛋白酶抑制剂，其CAS号为：1256388-51-8，分子式为C49H54F2N8O6，分子量为：889.00，化学结构为：

[0003]

[0004] 雷迪帕韦是由吉利德公司新开发的一种具有pmol级活性的NS5A蛋白酶抑制剂。2014年2月10日，用于治疗基因1型丙型肝炎的雷迪帕韦/索非布韦的固定剂量组合的片剂被美国药典收录，2014年10月10日组合产品雷迪替韦/索非布韦获得美国FDA批准。

[0005] 作为刚刚上市的新药，雷迪帕韦对丙型肝炎具有非常高的治疗指数，但雷迪帕韦的药物结构十分复杂，它具有多个对映和非对映异构体杂质，现有的相关技术发明对其合成工艺和可能存在的杂质已有说明，但目前在雷迪帕韦的质量控制上尚无已公开的检测方法，故本发明旨在提供一种雷迪帕韦的质量控制方法，用于检测雷迪帕韦的纯度及其杂质含量。

发明内容

[0006] 作为刚刚上市的新药，雷迪帕韦的药物结构十分复杂，它具有多个对映和非对映异构体杂质，目前，关于雷迪帕韦的合成工艺及其制剂工艺已有多篇相关的技术报道，对其可能存在的杂质亦有相关研究，但在雷迪帕韦的质量控制上尚无已公开的检测方法，故本发明旨在提供一种能有效的控制雷迪帕韦的纯度及其多个杂质的含量的检测方法。具体技术方案如下：

[0007] 在高效液相色谱仪上，用以八烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱进行分析，以酸水溶液和有机溶剂为流动相，对雷迪帕韦的样品溶液进行梯度洗脱，按面积归一化法计算雷迪帕韦的纯度及其多个杂质含量；其中，洗脱梯度如下：

[0008]洗脱时间(分钟) 酸水溶液 有机溶剂
0 100～50 0～50
A 50～0 50～100
B 50～0 50～100
C 100～50 0～50

[0009] 其中，0＜A≤60分钟，60＜B≤100分钟，100＜C≤150分钟。

[0010] 优选洗脱梯度为：

[0011]洗脱时间(分钟) 酸水溶液 有机溶剂
0 90～70 10～30
A 35～15 65～85
B 35～15 65～85
C 90～70 10～30

[0012] 其中，10＜A≤35分钟，35＜B≤55分钟，55＜C≤80分钟。

[0013] 其中，色谱柱的填料粒径为3.0μm～5.0μm之间，色谱柱长为150mm～250mm之间，色谱柱直径为2.0nm～4.6nm之间的色谱柱，优选以八烷基硅烷键合硅胶为填料，粒径为3.5μm，色谱柱长250mm，色谱柱直径为4.0nm的色谱柱。

[0014] 其中，酸水溶液为三氟乙酸水溶液、甲酸水溶液、磷酸水溶液、甲烷磺酸水溶液中的一种或多种；有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃中的一种或多种，优选乙腈和异丙醇。

[0015] 其中，酸水溶液的浓度为0.01％～90％之间，优选浓度为0.01％～20％的酸水溶液；所述有机溶剂的浓度为1％～100％之间。

[0016] 样品配制成含雷迪帕韦约0.5mg/ml的供试品溶液，照高效液相色谱法在配有DAD检测器的反相高效液相色谱仪上进行检测，用以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，粒径为3.5μm，色谱柱长150mm，色谱柱直径为4.6nm的色谱柱进行分析，在以甲烷磺酸/三氟乙酸/水为流动相A，以甲醇/异丙醇/水为流动相B的流动相体系下进行梯度洗脱，其中甲烷磺酸/三氟乙酸/水的体积比为10/1/89，甲醇/异丙醇/水的体积比为90/1/9，洗脱梯度如下：

[0017]洗脱时间 A相(％) B相(％)
0min 84 16
25min 25 75
50min 25 75
60min 84 16

[0018] 检测波长为220nm，柱温35℃，流速为0.8ml/min，取供试品溶液5ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算雷迪帕韦的纯度。

[0019] 10、根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：样品配制成含雷迪帕韦约0.5mg/ml的供试品溶液，照高效液相色谱法在配有DAD检测器的反相高效液相色谱仪上进行检测，用以八烷基硅烷键合硅胶为填料，粒径为3.5μm，色谱柱长250mm，色谱柱直径为
4.0nm的色谱柱进行分析，在以5％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B的流动相体系下进行梯度洗脱，洗脱梯度如下：

[0020]洗脱时间 A相(％) B相(％)
0min 72 28
32min 30 70
40min 30 70
50min 72 28

[0021] 检测波长为220nm，柱温30℃，流速为0.9ml/min；取供试品溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算雷迪帕韦的纯度。

[0022] 其中，多个杂质分别为：

[0023] 杂质1：

[0024]

[0025] 杂质2：

[0026]

[0027] 杂质3：

[0028]

[0029] 杂质4：

[0030]

[0031] 有益效果：

[0032] 由上述各杂质的结构式及现有的已公开的雷迪帕韦的合成路线可知这些杂质均是在合成工艺中可能产生的，且较难通过优化工艺完全去除。鉴于目前尚无公开的关于雷迪帕韦的质量控制方法，本发明提供的技术方案，在发明过程中，显示出对雷迪帕韦的多个杂质的检测优势，故本发明可以为雷迪帕韦的纯度及其杂质含量的测定提供了一种准确的、高效的检测方法。

附图说明

[0033] 图1为实施例1的检测结果示意图，其中RT＝2.9min为杂质1的峰，RT＝7.8min为杂质4的峰，RT＝8.1min为雷迪帕韦的峰，RT＝9.2min为杂质3的峰，RT＝13.1min为杂质2的峰，其它均为未知杂质峰；

[0034] 图2为实施例2的检测结果示意图，其中，RT＝9.8min为杂质1的峰，RT＝10.3min为雷迪帕韦的峰，RT＝10.5min为杂质2的峰，RT＝11.0min为杂质4的峰，RT＝11.2min为杂质3的峰，其它均为未知杂质峰；

[0035] 图3为实施例3的检测结果示意图，其中，RT＝10.5min为杂质2的峰，RT＝11.5min为杂质1的峰，RT＝14.1min为杂质4的峰，RT＝15.2min为雷迪帕韦的峰，RT＝15.8min为杂质3的峰，其它均为未知杂质峰。

[0036] 图4为杂质1的质谱图。

[0037] 图5为杂质2的质谱图。

[0038] 图6为杂质3的质谱图。

[0039] 图7为杂质4的质谱图。

具体实施方式

[0040] 以下实施例用于进一步理解本发明，但不限于本实施的范围。

[0041] 实施例1

[0042] 高效液相色谱仪：戴安U3000-DAD检测器

[0043] 流动相：A相：甲烷磺酸/三氟乙酸/水(10/1/89)

[0044] B相：甲醇/异丙醇/水(90/1/9)

[0045] 洗脱梯度：

[0046]洗脱时间 A相(％) B相(％)
0min 84 16
25min 25 75
50min 25 75
60min 84 16

[0047] 色谱柱：Kromasil 100-5-C8 4.6*250mm

[0048] 检测波长：220nm

[0049] 流速：0.8ml/min

[0050] 柱温：35℃

[0051] 进样量：5ul

[0052] 样品溶液配制：精密称取样品约10mg，置于20ml量瓶中，加初始流动相溶液稀释刻度，摇匀。

[0053] 检测结果：结果参见附图1，经液质联用，可得出图4～图7的质谱图分别为杂质1～杂质4，故可知在本实施例中RT＝2.9min为杂质1的峰，RT＝7.8min为杂质4的峰，RT＝8.1min为雷迪帕韦的峰，RT＝9.2min为杂质3的峰，RT＝13.1min为杂质2的峰，其它均为未知杂质峰。

[0054] 实施例2

[0055] 高效液相色谱仪：Agilent 1100-DAD检测器

[0056] 流动相：A：15％甲酸水溶液

[0057] B：甲醇/乙腈(20/80)

[0058] 洗脱梯度：

[0059]洗脱时间 A相(％) B相(％)
0min 75 25
45min 10 90
60min 10 90
65min 75 25

[0060] 色谱柱：Agilent Extend-C18 5um 2.1*150mm

[0061] 检测波长：220nm

[0062] 流速：0.5ml/min

[0063] 柱温：30℃

[0064] 进样量：20ul

[0065] 样品溶液配制：精密称取样品约25mg，置于50ml量瓶中，加初始流动相溶液稀释刻度，摇匀。

[0066] 检测结果：结果参见附图2，其中，RT＝9.8min为杂质1的峰，RT＝10.3min为雷迪帕韦的峰，RT＝10.5min为杂质2的峰，RT＝11.0min为杂质4的峰，RT＝11.2min为杂质3的峰，其它均为未知杂质峰。

[0067] 实施例3

[0068] 高效液相色谱仪：Agilent 1260-DAD检测器

[0069] 流动相：A：5％磷酸水溶液

[0070] B：乙腈

[0071] 洗脱梯度：

[0072]洗脱时间 A相(％) B相(％)
0min 72 28
32min 30 70
40min 30 70
50min 72 28

[0073] 色谱柱：Kromat Universil C18 4.0*150mm,3.5um

[0074] 检测波长：220nm

[0075] 流速：0.9ml/min

[0076] 柱温：30℃

[0077] 进样量：10ul

[0078] 样品溶液配制：精密称取样品约15mg，置于25ml量瓶中，加初始流动相溶液稀释刻度，摇匀。

[0079] 检测结果：结果参见附图3，其中，RT＝10.5min为杂质2的峰，RT＝11.5min为杂质1的峰，RT＝14.1min为杂质4的峰，RT＝15.2min为雷迪帕韦的峰，RT＝15.8min为杂质3的峰，其它均为未知杂质峰。