增强肝癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的化合物及其制剂

摘要

本发明公开了一种增强肝癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的化合物及其制剂，具体提供了一种吡啶并咪唑类有机化合物在制备增强肝癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的药物中的应用。本发明证明吡啶并咪唑类化合物可以有效增强肝癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性，可以制备成药学上可以接受的药物制剂，以实现使用少量的CIK细胞就发挥较优的免疫治疗效果。

权利要求

1.一种吡啶并咪唑类有机化合物在制备增强肝癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的药物中的应用，其特征在于，该吡啶并咪唑类有机化合物具有如下通式结构：其中，R2为-OCH2CH3或-OH；

R1为-CH2-或-CH(CH3)2-或-CH2CH2CH2-。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，吡啶并咪唑类有机化合物选自下列化合物：

说明书

增强肝癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的化合物及其制剂

技术领域

[0001] 本发明属于免疫治疗领域，涉及CIK细胞，具体涉及一种增强肝癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的化合物及其制剂。

背景技术

[0002] 原发性肝癌(以下简称肝癌)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，每年大约有63万的新发病例，而且近年来发病率有上升趋势。肝癌患者的病程短，临床上较难早期发现，确诊时往往病情已进入中、晚期，病死率高。目前肝癌的治疗主要是以手术切除、肝移植、局部消融、化学治疗栓塞及其他局部区域治疗、分子靶向治疗等，但这些方法的治疗效果并不理想，因为肝癌患者体内天然免疫、特异性免疫功能低下，根治性手术切除率低，手术后复发率高，放射、化学治疗疗效差，易发生肝内播散及肝外转移，因此急需寻找新的有效方法来治疗肝癌。生物治疗已经成为肿瘤综合治疗中的第四种模式，越来越受到重视。

[0003] 目前用于肿瘤生物治疗的免疫活性细胞主要有肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、树突状细胞(DC)以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)等。CIK细胞是一种新型的免疫活性细胞，其主要效应细胞的表面标志为CD3+CD56+，与其他过继性免疫治疗细胞相比，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点。研究表明，过继细胞免疫治疗对抑制肝癌的复发和转移、提高患者治愈率、改善患者生活质量、延长生存期都具有重要作用。

[0004] 如何用较少的CIK细胞就发挥较优的免疫治疗效果是科研工作者的一个重要研究方向。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种增强肝癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的化合物及其制剂，以使用较少的CIK细胞就发挥较优的免疫治疗效果。

[0006] 实现本发明上述目的技术方案如下：

[0007] 一种吡啶并咪唑类有机化合物在制备增强肝癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的药物中的应用，该吡啶并咪唑类有机化合物具有如下通式结构：

[0008]

[0009] 其中，R2为-OCH2CH3或-OH；

[0010] R1为-CH2-或-CH(CH3)2-或-CH2CH2CH2-。

[0011] 优选地，吡啶并咪唑类有机化合物选自下列化合物：

[0012]

[0013] 一种用于增强肝癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的药物制剂，包括上述吡啶并咪唑类有机化合物，还包括药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。

[0014] 优选地，所述药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。

[0015] 优选地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、膏剂、口服液体制剂。

[0016] 本发明的突出优点：

[0017] 本发明证明吡啶并咪唑类化合物可以有效增强肝癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性，可以制备成药学上可以接受的药物制剂，以实现使用少量的CIK细胞就发挥较优的免疫治疗效果。

附图说明

[0018] 图1为各组CIK细胞对HepG2的杀伤率比较。

具体实施方式

[0019] 下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。

[0020] 一、实验材料

[0021] 编号CM1-6的吡啶并咪唑类有机化合物均为已知化合物，由本公司合成人员参照文献和有机合成常规方法合成，并经质谱和核磁确证。

[0022] 人肝癌细胞系HepG2为本公司长期保存。重组人干扰素rhIFN-γ、重组人白细胞介素rhIL-2、CD3鼠抗人单克隆抗体、CIK细胞分离液、PBS、无血清培养基MD-CM-STMN、RPMI1640培养基、胎牛血清FBS、MTT、DMSO、胰酶均购自南京建成生物。

[0023] 二、实验方法

[0024] 1、外周血单个核细胞制备

[0025] 无菌抽取健康人外周血约50mL，肝素抗凝(肝素15IU/mL)，用等体积PBS稀释外周血。按1：1的体积比缓慢加入到含有细胞分离液的50mL离心管中，2000r/min离心20min。取中间环状乳白色单个核细胞层，移入50mL离心管中，加入适量PBS，1800r/min离心8min，弃上清，洗涤2次，细胞计数。

[0026] 2、CIK细胞诱导培养

[0027] 用含有5％FBS的MD-CM-STMN细胞培养基调整单个核细胞密度为1×106个/mL，接种20mL于培养瓶中，细胞总数为2×107，当天(第0天)加入rhIL-21000U/mL、rhIFN-γ1000U/mL、CD3鼠抗人单克隆抗体5mg/L，放置37℃，5％CO2培养箱中开始培养。第3天开始补加MD-CM-STMN细胞培养基，同时补充CD3鼠抗人单克隆抗体、rhIFN-γ、rhIL-2，用量同前，此后每3d添加新鲜培养基，补加rhIFN-γ，用量相同，rhIL-2用量减半为500U/mL。

[0028] 3、CIK细胞增殖测定

[0029] 台盼蓝染色方法，用细胞计数板分别于培养第0、5、8、13、20天对细胞进行计数，重复3次取平均值。

[0030] 4、肿瘤细胞系的培养

[0031] 将HepG2细胞接种于培养瓶中，加入含有10％FBS的RPMI 1640，贴壁细胞用0.25％的胰酶消化。取对数生长期的细胞，接种于96孔板，进行体外杀伤实验。

[0032] 5、MTT法测定CM 1-6化合物对HepG2细胞的细胞毒作用

[0033] 取对数生长期HepG2细胞，调整细胞悬液密度为5×103个/mL，接种于96孔板，每孔200μL。待细胞贴壁后换液，给药组分别加入2μM化合物CM 1-6，对照组加入培养液，每组均设3个平行孔，放置在37℃、5％CO2培养箱中作用48h后，各给药组及对照组每孔均分别加入
20μLMTT(5g/L)，继续放置在37℃、5％CO2培养箱中培养4h，弃上清，每孔加入200μL DMSO，
37℃下摇床振荡10min，酶标仪测定490nm处吸光度(A)值。

[0034] 6、MTT法测定CIK对HepG2细胞杀伤作用

[0035] 将培养至第13天的CIK细胞作为效应细胞，进行体外杀伤实验。调整HepG2细胞浓度5×103个/mL，每孔100μL，分为CM 1增敏组、CM 2增敏组、CM 3增敏组、CM 4增敏组、CM 5增敏组、CM 6增敏组和常规组，CM 1-6增敏组分别添加2μM化合物CM 1-6，常规组正常培养，放置在37℃、5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁后换液，按效靶比10：1将效应细胞加入培养孔中，同时另设单独靶细胞(靶细胞+培养液)和单独效应细胞(效应细胞+培养液)为阴性对照，放置在37℃、5％CO2培养箱中作用48h后，加入MTT(5g/L)，20μL/孔，继续放置在37℃、5％CO2培养箱中培养4h，2000r/min离心5min，翻板弃上清，加入DMSO 150μL/孔，震荡，待沉淀溶解，放于酶标仪中，490nm测光密度(OD)值，按如下公式计算杀伤活性：杀伤率(％)＝{1-[(实验组OD值-单独效应细胞OD值)/单独靶细胞OD值]}×100％。

[0036] 7、统计学方法

[0037] 采用SPSS 19.0统计软件分析，数据以均数±标准差表示，P＜0.05具有统计学意义。

[0038] 三、实验结果

[0039] 1、CIK细胞增殖

[0040] CIK细胞在培养第5天细胞增殖速度加快，第5-13天为快速增殖时间段，在第20天细胞增殖达到原种植量的118倍，在第20天细胞增殖达到原种植量的176倍。

[0041] 2、化合物CM 1-6对HepG2细胞的细胞毒作用

[0042] 化合物CM 1-6给药组与对照组的吸光度(A)值无显著差异，证明2μM化合物CM 1-6对HepG2细胞无明显细胞毒作用。结果见表1。

[0043] 表1化合物CM 1-6给药组与对照组的吸光度值的比值

[0044]  CM 1 CM 2 CM 3 CM 4 CM 5 CM 6
A给药/A对照 1.02 0.98 0.98 0.99 1.01 1.01

[0045] 3、化合物CM 1-6增强肝癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性

[0046] 从表2和图1可以看出，各增敏组CIK细胞对HepG2细胞的杀伤率均显著高于常规组。已知2μM化合物CM 1-6对HepG2细胞无明显细胞毒作用，各增敏组CIK细胞对HepG2细胞杀伤率的提高只能归结于化合物CM 1-6提高了HepG2细胞对CIK细胞的杀伤敏感性，使用化合物CM 1-6对靶细胞HepG2细胞增敏后，效靶比不变的情况下，CIK细胞对HepG2细胞的杀伤力显著提高。

[0047] 表2各组CIK细胞对HepG2细胞的杀伤率(效靶比10:1)

[0048]

[0049] 本发明证明吡啶并咪唑类化合物可以有效增强肝癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性，可以制备成药学上可以接受的药物制剂，以实现使用少量的CIK细胞就发挥较优的免疫治疗效果。

[0050] 上述实施例是对本发明实质性内容的体现，用于更好地解释本发明，但本领域技术人员应当知晓，不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。