一种检测谷胱甘肽的试剂及其合成方法和应用

摘要

本发明提供了一种检测谷胱甘肽(GSH)的试剂和方法，所述试剂是香豆素衍生物:(Z)‑2‑(3‑chloro‑3‑(7‑(diethylamino)‑2‑oxo‑2H‑chromen‑3‑yl)allylidene)malononitrile，中文名字是(Z)‑2‑(3‑氯‑3‑(7‑(二乙胺基)‑2‑氧‑2氢‑色烯‑3‑基)亚烯丙基)丙二腈。检测方法是在pH为7.4的PBS缓冲溶液中通过荧光分光光度计定量地检测谷胱甘肽的含量。该检测方法，对GSH显示了高的灵敏度和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

权利要求

1.一种检测谷胱甘肽试剂的合成方法，其特征在于，步骤为：

冰浴下，DMF溶液中缓慢滴加等体积量的三氯氧磷，搅拌半小时，加入溶解在DMF中的3-(二乙胺基)苯酚，75℃回流4-6h；反应完成后，把反应液倒入冰水中，并用Na2CO3水溶液调节pH至中性，棕色固体析出，抽滤，水洗，最后用乙醇重结晶得到4-(二乙胺基)-间羟基苯甲醛；

将摩尔比为1:1.5的4-(二乙胺基)-间羟基苯甲醛和乙酰乙酸乙酯，加入1-2滴哌啶做催化剂，在乙醇中充分溶解后回流10-12h，浓缩、冷却后减压蒸馏得到黄色固体即为3-乙酰基-7-(二乙胺基)-2氢-色烯-2-酮；

冰浴下，DMF溶液中缓慢滴加等体积的三氯氧磷，搅拌，当溶液颜色变成橘红色，加入充分溶解在DMF中的3-乙酰基-7-(二乙胺基)-2氢-色烯-2-酮，继续搅拌3-4h，然后在75℃回流6-8h；冷却至室温后将体系倒入适当量的冰水中，并用Na2CO3水溶液调节pH至中性，抽滤，有砖红色固体析出，然后以二氯甲烷洗脱剂经柱层析分离得到(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-

2-氧-2-氢-色烯-3-基)丙烯醛；

将摩尔比为1:1.5:1的(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氢-色烯-3-基)丙烯醛、丙二腈及催化剂1,4-二氮杂二环[2,2,2]辛烷溶于乙醇中，回流14-16小时；混合体系减压蒸馏，以二氯甲烷为洗脱剂柱层析分离得到紫红色目标试剂(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈。

2.一种检测谷胱甘肽的方法：其特征在于，步骤为：

(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mmol/L的PBS缓冲溶液，配制2mmol/L的(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的DMSO溶液；

(2)、按体积比1000:1000:5将pH 7.4 PBS、DMSO和(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的DMSO溶液加到荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，505nm处的荧光强度逐渐增强；

(3)、把1000μL的pH 7.4 PBS、1000μL的DMSO、5.0μL的(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-

2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的DMSO溶液加到另一个荧光比色皿中，分别再加入GSH溶液的体积为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μL，在荧光分光光度仪上测定505nm对应的荧光强度F为486、820、1242、1648、2006、2381，以GSH浓度为横坐标，以相对荧光强度F为纵坐标绘制图，得到GSH浓度的工作曲线；线性回归方程为：F＝161.56c+33.03，c的单位为μmol/L；

(4)、把1000μL的pH 7.4 PBS、1000μL的DMSO、5.0μL的(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-

2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的DMSO溶液加到另一个荧光比色皿中，用微量进样器吸取Vμl待测样品溶液，加入到此荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧-6光强度代入(3)的线性回归方程，得到浓度c，待测样品C待测样＝2000μL×c×10 /VμL,即可求得GSH的浓度。

说明书

一种检测谷胱甘肽的试剂及其合成方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及谷胱甘肽检测技术，具体涉及一种检测谷胱甘肽的试剂及其合成方法，以及这种试剂在检测谷胱甘肽中的应用。

背景技术

[0002] 谷胱甘肽(GSH)在人的生理活动中起着重要作用，是细胞内最多的非蛋白巯基化合物，它在维持细胞生理功能中起着重要作用，其中包括细胞内的氧化还原反应，异物代谢，信号传导与基因调控等。谷胱甘肽在细胞内的浓度为1-10mM，它分为还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽两种类型，它们之间存在着氧化还原平衡。其中还原型谷胱甘肽在细胞的生长、维持细胞正常功能的氧化还原平衡上起着关键作用；此外，人体中还原型谷胱甘肽浓度异常还与癌症、阿尔茨海默氏症和心血管等疾病相关。鉴于生物硫醇在生理活动中重要意义及其浓度与各类疾病的密切关系，所以针对小分子生物硫醇检测的研究引起了科学家们的高度关注及浓厚兴趣。

[0003] 目前，大部分荧光探针可以实现三种生物硫醇Cys/Hcy/GSH对其他22种氨基酸的区分检测，但是特异性检测GSH的试剂还比较少。因此研究开发一种可以在细胞浓度水平上检测GSH的试剂显得尤为重要。

[0004] 在本发明中，合成了一种基于香豆素的化合物，通过GSH和化合物在亲核取代反应前后荧光强度的变化，实现GSH的特异性检测。发明内容：

[0005] 本发明的目的是提供一种合成简单、操作方便、选择性高、水溶性好的定量检测GSH的试剂，以及该试剂在GSH检测中的应用。

[0006] 本发明提供的一种检测GSH的试剂，它是(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈，英文名称是：(Z)-2-(3-chloro-3-(7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromen-3-yl)allylidene)malononitrile，结构式为：

[0007]

[0008] (Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的合成方法，步骤为：

[0009] 冰浴下，DMF溶液中缓慢滴加等体积量的三氯氧磷，搅拌半小时，加入溶解在DMF中的3-(二乙胺基)苯酚，75℃回流4-6h；反应完成后，把反应液倒入冰水中，并用Na2CO3水溶液调节pH至中性，棕色固体析出，抽滤，水洗，最后用乙醇重结晶得到4-(二乙胺基)-2-间羟基苯甲醛；

[0010] 将摩尔比为1:1.5的4-(二乙胺基)-2-间羟基苯甲醛和乙酰乙酸乙酯，加入1-2滴哌啶做催化剂，在乙醇中充分溶解后回流10-12h，浓缩、冷却后减压蒸馏得到黄色固体即为3-乙酰基-7-(二乙胺基)-2氢-色烯-2-酮；

[0011] 冰浴下，DMF溶液中缓慢滴加等体积的三氯氧磷，搅拌，当溶液颜色变成橘红色，加入充分溶解在DMF中的3-乙酰基-7-(二乙胺基)-2氢-色烯-2-酮，继续搅拌3-4h，然后在75℃回流6-8h；冷却至室温后将体系倒入适当量的冰水中，并用Na2CO3水溶液调节pH至中性，抽滤，有砖红色固体析出，然后以二氯甲烷洗脱剂经柱层析分离得到(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氢-色烯-3-基)丙烯醛；

[0012] 将摩尔比为1:1.5:1的(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氢-色烯-3-基)丙烯醛、丙二腈及催化剂1,4-二氮杂二环[2,2,2]辛烷溶于乙醇中，回流14-16小时；混合体系减压蒸馏，以二氯甲烷为洗脱剂柱层析分离得到紫红色目标试剂(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈。

[0013] 一种检测GSH的方法，步骤为：

[0014] (1)、配制pH＝7.4、浓度为10mmol/L的PBS缓冲溶液，配制2mmol/L的(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的DMSO溶液；

[0015] (2)、按体积比1000:1000:5将pH 7.4PBS、DMSO和(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的DMSO溶液加到荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，505nm处的荧光强度逐渐增强；

[0016] (3)、把1000μL的pH 7.4PBS、1000μL的DMSO、5.0μL的(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的DMSO溶液加到另一个荧光比色皿中，分别再加入GSH溶液的体积为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μL，在荧光分光光度仪上测定505nm对应的荧光强度F为486、820、1242、1648、2006、2381，以GSH浓度为横坐标，以相对荧光强度F为纵坐标绘制图，得到GSH浓度的工作曲线；线性回归方程为：F＝161.56c+33.03，c的单位为μmol/L；

[0017] (4)、把1000μL的pH 7.4PBS、1000μL的DMSO、5.0μL的(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的DMSO溶液加到另一个荧光比色皿中，用微量进样器吸取Vμl待测样品溶液，加入到此荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入(3)的线性回归方程，得到浓度c，待测样品C待测样＝2000μL×c×10-6/VμL,即可求得GSH的浓度。

[0018] 本发明的(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈还可用于细胞成像。

[0019] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：1、试剂合成简单，检测体系成本低廉；2、本发明的检测方法，对GSH显示了高的灵敏性和选择性，Cys和Hcy在细胞浓度水平不干扰测定；3、检测手段简单，只需要借助荧光分光光度仪即可实现。附图说明：

[0020] 图1实施例1制备的(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的核磁氢谱图

[0021] 图2实施例1制备的(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的核磁碳谱图

[0022] 图3实施例1制备的(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的质谱图

[0023] 图4实施例2(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈与GSH作用的荧光发射图

[0024] 图5实施例3(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈与各种分析物的荧光柱状图

[0025] 图6实施例4测定GSH的工作曲线

[0026] 图7实施例5测定样品的荧光发射图

[0027] 图8检测GSH的细胞成像图具体实施方式：

[0028] 实施例1(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的制备及表征

[0029] 在冰浴下，向10mL DMF溶液中缓慢滴加10mL三氯氧磷，搅拌半小时，加入溶解在DMF中的3-(二乙胺基)苯酚(4.95g,20mmol)，75℃回流4h；反应完成后，把反应液倒入60mL冰水中，并用Na2CO3水溶液调节pH至中性，棕色固体析出，抽滤，水洗，最后用乙醇重结晶得到4-(二乙胺基)-2-间羟基苯甲醛；

[0030] 将4-(二乙胺基)-2-间羟基苯甲醛(1.16g,6mmol)、乙酰乙酸乙酯(1.17g,9mmol)在0.2mL哌啶催化下在乙醇中回流10小时，浓缩、冷却后减压蒸馏得到黄色固体即为3-乙酰基-7-(二乙胺基)-2氢-色烯-2-酮。

[0031] 在冰浴下，向5mL DMF溶液中缓慢滴加5mL三氯氧磷，搅拌半小时，当溶液颜色变成橘红色，加入溶解在5mL DMF中的3-乙酰基-7-(二乙胺基)-2氢-色烯-2-酮继续搅拌3h，后将该体系在75℃回流6h。冷却到室温后将体系倒入60mL冰水中，并用Na2CO3水溶液调节pH至中性，抽滤，有砖红色固体析出，然后通过柱层析分离(二氯甲烷)得到(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氢-色烯-3-基)丙烯醛。

[0032] 将(Z)-3-氯-(7-(二乙胺基)-2-氧-2-氢-色烯-3-基)丙烯醛(1.22g,4mmol)和丙二腈(0.40g,6mmol)溶于乙醇中，加入1,4-二氮杂二环[2,2,2]辛烷(0.45g,4mmol)做催化剂，然后回流14小时。混合体系减压蒸发后通过柱层析分离(二氯甲烷)得到目标试剂(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈。

[0033] 1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ8.65(s,1H),8.39(d,1H,J＝11.9),8.34(d,1H,J＝11.9),7.72(d,1H,J＝9.1),6.88(d,1H,J＝9.8),6.67(s,1H),3.54(q,4H,J＝7.0),1.16(t,6H,J＝7.0)(图1)。13C-NMR(DMSO-d6,151MHz):158.6,157.2,156.9,154.0,147.5,
145.3,132.8,120.5,114.9,113.3,111.4,109.3,96.3,81.8,45.1,12.9(图2)。Elemental analysis(calcd.％)for C19H16ClN3O2:C,64.50；H,4.56；Cl,10.02；N,11.88；O,9.04.ESI-MS m/z:[probe+H]+，m/z 354.0990(图3)。

[0034] 实施例2

[0035] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，并用DMSO配制2mM(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的溶液；把2mL的PBS-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液及5μL(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，取GSH的溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在荧光分光光度仪上检测，随着GSH的加入，505nm处荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图4。

[0036] 实施例3

[0037] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，并用DMSO配制2mM的(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈溶液；在22个荧光比色皿中，各加入2mL的PBS-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液和5μL的试剂的DMSO溶液，再分别加入30μL GSH，以及300μL的各种分析物：Cys,Hcy,Ala,Arg,Asp,Gln,Glu,Gly,His,lle,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Tyr,Trp,Val,Asn在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的505nm相对荧光强度的柱状图，(见图5)。GSH使得试剂的荧光强度由16变到2983，其它的分析物基本没有引起试剂荧光强度的变化。

[0038] 经实验证明，其它分析物不干扰体系对GSH的测定。

[0039] 实施例4

[0040] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，并用DMSO配制2mM的(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈溶液，用蒸馏水配制2mM的GSH溶液；把2mL PBS-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液和5μL的试剂的DMSO溶液加到荧光比色皿中，分别再加入GSH溶液的体积为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μL时，在荧光分光光度仪上测定505nm对应的荧光强度F为486、820、1242、1648、2006、2381，以GSH浓度为横坐标，以相对荧光强度F为纵坐标绘制图，得到GSH浓度的工作曲线(见图6)；线性回归方程为：F＝161.56c+33.03，c的单位为μmol/L；

[0041] 实施例5

[0042] 配制pH＝7.4的PBS(10mM)缓冲溶液，配制2mM的GSH水溶液，并用DMSO配制2mM的(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈溶液；把2mL的PBS-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液和5μL的(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，取GSH的溶液3.3μL，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧光光谱仪上测定505nm的对应的荧光强度F为578，通过实施例4的线性回归方程，求得c＝3.3732×10-6mol/L，偏差为0.02％。见图7。

[0043] 实施例6

[0044] 配制2mmol/L(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的DMSO溶液；将(Z)-2-(3-氯-3-(7-(二乙胺基)-2-氧-2氢-色烯-3-基)亚烯丙基)丙二腈的DMSO溶液加入A549细胞培养液中，使得其浓度为15μmol/L，在37℃下孵育30分钟，体系在倒置荧光显微镜下显示了绿色荧光(图8 a1)，即为该试剂与A549细胞中的硫醇作用发出了荧光。图8的b1为A549细胞先与1mM的NEM(硫醇清除剂)作用，再与探针溶液作用，c1和d1分别为A549细胞先与NEM作用，后分别加入外源GSH和Cys培养，最后加入探针溶液。a2、b2、c2、d2为与之对应的明场。