一种细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法

摘要

本发明公开了一种细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法，以甘蓝型油菜胞质雄性不育材料oguraCMS为母本、大白菜早熟亲和系为父本，通过种间杂交获得转育一代种子，选留表现与转育父本相似的蜜腺正常、无败蕾优良单株作为下一轮回交母本，经连续7代回交转育，并经田间性状选择，选育出不育性稳定，不育株率和不育度达100％，性状和对应保持系完全一致的大白菜胞质雄性不育种质材料TYMS231‑330。所得不育系种质材料TYMS231‑330既能保持ogura胞质不育源大白菜雄性不育性的优点，又能克服其植株叶片黄花、蜜腺退化和配合力差等缺陷，能吸引蜜蜂等正常传粉，综合抗性强，利用价值高。

权利要求

1.一种细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用游离小孢子培养方法得到早熟自交不亲和系回交父本Y231-330、Y66-9、ZY15、Y177-28和Y152-3；

(2)以甘蓝型油菜胞质雄性不育材料oguraCMS为母本，以步骤(1)得到的大白菜早熟自交不亲和系回交父本为父本，通过种间杂交获得转育一代种子F1；

(3)在田间播种步骤(2)得到的一代种子F1，选择田间表现性状与步骤(2)所述的回交父本一致的优良不育单株作为下一轮的回交母本；

(4)采用步骤(3)选择的回交母本与步骤(2)所述的回交父本通过回交得到转育二代种子TYMSBC1；

(5)在田间播种步骤(4)得到的转育二代种子TYMSBC1，选择田间表现性状与步骤(2)所述的回交父本一致的优良不育单株作为下一轮的回交母本；

(6)采用步骤(5)选择的回交母本与步骤(2)所述的回交父本通过回交得到转育三代种子TYMSBC2；

(7)重复上述步骤，经过7代回交转育得到大白菜胞质雄性不育种质材料TYMSBC7。

2.根据权利要求1所述的细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法，其特征在于，步骤(1)所述的游离小孢子培养方法包括以下步骤：a.从供体植株主花序或顶部分枝花序上取2.0～4.0mm长的花蕾，在显微镜下镜检小孢子以确定其发育时期；

b.经过步骤a确定之后，选取小孢子处于单核中期至双核初期的花蕾，然后用体积浓度为75％的酒精浸泡30s、用质量浓度为0.1％的HgCl2消毒5min，再用无菌水冲洗3～5次；

c.将步骤b处理之后的花蕾置于10ml试管中，并加入Keller-13冲洗液3～5ml，用玻璃棒挤破花蕾散出小孢子，将得到的小孢子悬浮液用400滤网过滤、收集滤液；

d.将步骤c收集的滤液在600r/min的转速下离心3min，沉降小孢子、弃去上清液；然后再加入Keller-13冲洗液，重新悬浮小孢子，离心，沉降，弃去上清液，重复离心三次，弃去上清液、得到沉降小孢子；

e.在步骤d离心之后，最终得到的沉降小孢子中加入NLN-10～13培养液得到小孢子悬浮液，用血球计数板计数，调整小孢子浓度为1×105个/ml；将得到的小孢子悬浮液分装至

60×15mm培养皿中，每个培养皿中2ml，用Parafilm膜封口；

f.将步骤e封装好的小孢子放入33℃的恒温培养箱中培养24h，然后转入25℃下黑暗培养；培养30天后统计小孢子胚数目，在分化培养基形成小植株，田间授粉采种保存。

3.根据权利要求2所述的细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法，其特征在于，步骤b所述的选取小孢子处于单核中期至双核初期的花蕾长度为2.0～3.0mm。

说明书

一种细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法

技术领域

[0001] 本发明属于十字花科蔬菜育种技术领域，具体涉及一种细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法。技术背景

[0002] 大白菜是我国种植面积最大的蔬菜之一，也是北方冬储数量最大的蔬菜之一，在均衡市场供应、稳定蔬菜价格等方面具有举足轻重的作用。大白菜还具有品质肉嫩、清淡可口、营养丰富、适应性广等特点，深受消费者喜爱。

[0003] 随着人民生活水平的日益提高，消费者的需求不断变化，人们希望在每个季节都能吃到新鲜可口、营养丰富、花色品种多样的“国菜”大白菜。新品种选育应与市场紧密结合，培育小型白菜、娃娃菜、快菜和彩色大白菜等多种类型，以及耐抽薹、耐热反季节栽培的春、夏大白菜补淡品种，以满足大白菜的周年供应及多样化需求。因此，反季节、早熟大白菜种质的挖掘、改良、创新和快速鉴定，是目前迫切需要解决的问题之一。

[0004] 大白菜具有非常明显的杂种优势，杂种一代的生产主要利用自交不亲和系和雄性不育系两条途径。国内60年代末开始研究利用自交不亲和性生产F1杂种并应用于生产，但是由于自交不亲和系的繁殖主要依靠人工蕾期授粉，多代自交易出现生活力衰退、亲本种子成本高，制种技术难度大及杂交种难以达到100％等缺陷，而利用雄性不育系生产一代杂种则可以解决上述问题。

发明内容

[0005] 为了达到上述目的，本发明提供了一种细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法。该方法得到的大白菜材料品种早熟、耐热、综合抗病能力强、适应性广，为配制早熟耐热抗病大白菜新品种奠定了基础。

[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的

[0007] 一种细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法，包括以下步骤：

[0008] (1)采用游离小孢子培养方法得到早熟自交不亲和系回交父本；

[0009] (2)以甘蓝型油菜胞质雄性不育材料oguraCMS为回交母本，以步骤(1)得到的大白菜早熟自交不亲和系回交父本为父本，通过种间杂交获得转育一代种子F1；

[0010] (3)在田间播种步骤(2)得到的一代种子F1，选择田间表现性状与步骤(2)所述的回交父本一致的优良不育单株作为下一轮的回交母本；

[0011] (4)采用步骤(3)选择的回交母本与步骤(2)所述的回交父本通过回交得到转育二代种子TYMS BC1；

[0012] (5)在田间播种步骤(4)所得到的转育二代种子TYMS BC1，选择田间表现性状与步骤(2)所述的回交父本一致的优良不育单株作为下一轮的回交母本；

[0013] (6)采用步骤(5)选择的回交母本与步骤(2)所述的回交父本通过回交得到转育三代种子TYMS BC2；

[0014] (7)重复上述步骤，经过7代回交转育得到大白菜胞质雄性不育种质材料TYMS BC7。

[0015] (8)对步骤(7)得到的大白菜胞质雄性不育种质材料进行田间性状鉴定；

[0016] 所述的细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法，步骤(1)所述的早熟自交不亲和系回交父本包括Y231-330、Y66-9、ZY15、Y177-28和Y152-3。

[0017] 所述的细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法，步骤(1)所述的游离小孢子培养方法包括以下步骤：

[0018] a.从供体植株主花序或顶部分枝花序上取2.0～4.0mm长的花蕾，在显微镜下镜检小孢子以确定其发育时期；

[0019] b.经过步骤a确定之后，选取小孢子处于单核中期至双核初期的花蕾(花蕾的长度为2.0～3.0mm)，然后用体积浓度为75％的酒精浸泡30s、用质量浓度为0.1％的HgCl2消毒5min，再用无菌水冲洗3～5次；

[0020] c.将步骤b处理之后的花蕾置于10ml试管中，并加入Keller-13冲洗液3～5ml，用玻璃棒挤破花蕾散出小孢子，将得到的小孢子悬浮液用400滤网过滤、收集滤液；

[0021] d.将步骤c收集的滤液在600r/min的转速下离心3min，沉降小孢子、弃去上清液；然后再加入Keller-13冲洗液，重新悬浮小孢子，离心，沉降，弃去上清液，重复离心三次，弃去上清液、得到沉降小孢子；

[0022] e.在步骤d离心之后，最终得到的沉降小孢子中加入NLN-10～13培养液得到小孢子悬浮液，用血球计数板计数，调整小孢子浓度为1×105个/ml；将得到的小孢子悬浮液分装至60×15mm培养皿中，每个培养皿中2ml，用Parafilm膜封口；

[0023] f.将步骤e封装好的小孢子放入33℃的恒温培养箱中培养24h，然后转入25℃下黑暗培养；培养30天后统计小孢子胚数目，在分化培养基形成小植株，田间授粉采种保存。

[0024] 所述的细胞质雄性不育早熟大白菜材料的选育方法，步骤b所述的选取小孢子处于单核中期至双核初期的花蕾长度为2.0～3.0mm。

[0025] 与现有技术相比，本发明具有以下积极有益效果

[0026] (1)以甘蓝型油菜胞质雄性不育材料oguraCMS为母本，同时与Y231-330、Y66-9、ZY15、Y177-28、Y152-3等多份自交系进行杂交、回交，田间鉴定，花期通过肉眼观察花开植株，开花正常，雄蕊瘪，无花粉，不育性稳定，不育株率和不育度均达到100％；

[0027] (2)TYMS231-330为母本，Y18-58为父本进行杂交，田间制种TYMS231-330与Y18-58比例为4：2，花期结束，拔除父本，生产出的杂交一代种子，纯度为100％，因此能在生产上大面积应用；

[0028] (3)本发明育成甘蓝型油菜胞质雄性不育系的方法简单、周期短、效率高，不育性稳定，不育株率和不育度达到100％，可为大白菜或小白菜雄性不育育种提供鉴定；

[0029] (4)本发明的大白菜胞质雄性不育种质材料TYMS231-330的花朵与保持系相比，花瓣小，花药干瘪、纤瘦、退化成短丝状，无花粉，雄蕊和花药长度明显变短，在显微镜下观察，找不到花粉。子房外观与保持系基本相同，结构、功能正常，蜜腺数量与保持系相同，发育正常，芳香，能吸引蜜蜂等昆虫正常传粉。TYMS231-330综合园艺性状与保持系相同。早熟、耐热、抗性强。

附图说明

[0030] 图1为本发明的技术流程图；

[0031] 图2为大白菜不育型种质材料TYMS231-330的DNA电泳条带图；

[0032] 图3为大白菜胞质雄性不育种质材料TYMS231-330和回交父本材料Y231-330的田间种植性状对比图。

具体实施方式

[0033] 下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，但是并不用于限制本发明的保护范围。

[0034] 实施例1

[0035] 一种细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法之一，包括以下步骤：

[0036] (1)采用游离小孢子培养方法得到早熟自交不亲和系回交父本Y231-330(基因型AA)(已在河南省农业科学院种子资源中期库保存，保藏号：S01A0057)；

[0037] (2)以甘蓝型油菜胞质雄性不育材料oguraCMS(其基因型为AACC)为母本，以步骤(1)得到的大白菜早熟自交不亲和系回交父本Y231-330为父本，通过种间杂交获得转育一代种子F1(基因型AAC)；

[0038] (3)在田间播种步骤(2)得到的一代种子F1，选择田间表现性状与步骤(2)所述的回交父本一致(即后代全部不育)的优良不育单株作为下一轮的回交母本；

[0039] (4)采用步骤(3)选择的回交母本与回交父本Y231-330通过回交得到转育二代种子TYMS231-330BC1；

[0040] (5)在田间播种转育二代种子TYMS231-330BC1，选择田间表现性状与回交父本Y231-330一致的优良不育单株作为下一轮的回交母本；

[0041] (6)采用步骤(5)选择的回交母本与回交父本Y231-330通过回交得到转育三代种子TYMS231-330BC2；

[0042] (7)重复上述步骤，经过7代回交转育得到大白菜胞质雄性不育种质材料TYMS231-330。

[0043] 其中，所述的细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法，步骤(1)所述的游离小孢子培养方法包括以下步骤：

[0044] a.从供体植株主花序或顶部分枝花序上取2.0～4.0mm长的花蕾，在显微镜下镜检小孢子以确定其发育时期；

[0045] b.经过步骤a确定之后，选取小孢子处于单核中期至双核初期的花蕾(花蕾的长度为2.0～3.0mm)，然后用体积浓度为75％的酒精浸泡30s、用质量浓度为0.1％的HgCl2消毒5min，再用无菌水冲洗3～5次；

[0046] c.将步骤b处理之后的花蕾置于10ml试管中，并加入Keller-13冲洗液3～5ml，用玻璃棒挤破花蕾散出小孢子，将得到的小孢子悬浮液用400滤网过滤、收集滤液；

[0047] d.将步骤c收集的滤液在600r/min的转速下离心3min，沉降小孢子、弃去上清液；然后再加入Keller-13冲洗液，重新悬浮小孢子，离心，沉降，弃去上清液，重复离心三次，弃去上清液、得到沉降小孢子；

[0048] e.在步骤d离心之后，最终得到的沉降小孢子中加入NLN-10～13培养液得到小孢子悬浮液，用血球计数板计数，调整小孢子浓度为1×105个/ml；将得到的小孢子悬浮液分装至60×15mm培养皿中，每个培养皿中2ml，用Parafilm膜封口；

[0049] f.将步骤e封装好的小孢子放入33℃的恒温培养箱中培养24h，然后转入25℃下黑暗培养；培养30天后统计小孢子胚数目，在分化培养基形成小植株，田间授粉采种保存。

[0050] 实施例2

[0051] 一种细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法之二，包括以下步骤：

[0052] (1)采用游离小孢子培养方法得到早熟自交不亲和系回交父本Y66-9(已在河南省农业科学院种子资源中期库保存，保藏号S01A0061)(其基因型AA)；

[0053] (2)以甘蓝型油菜胞质雄性不育材料oguraCMS(其基因型AACC)为母本，以步骤(1)得到的大白菜早熟自交不亲和系回交父本Y66-9为父本，通过种间杂交获得转育一代种子F1(基因型AA)；

[0054] (3)在田间播种步骤(2)得到的一代种子F1，选择田间表现性状与回交父本Y66-9一致(后代全部不育)的优良不育单株作为下一轮的回交母本；

[0055] (4)采用步骤(3)选择的回交母本与回交父本Y66-9通过回交得到转育二代种子TYMS66-9BC1；

[0056] (5)在田间播种转育二代种子TYMS66-9BC1，选择田间表现性状与回交父本Y66-9一致的优良不育单株作为下一轮的回交母本；

[0057] (6)采用步骤(5)选择的回交母本与回交父本Y66-9通过回交得到转育三代种子TYMS66-9BC2；

[0058] (7)重复上述步骤，经过7代回交转育得到大白菜胞质雄性不育种质材料TYMS66-9。

[0059] 其中，所述的细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法，步骤(1)所述的游离小孢子培养方法包括以下步骤：

[0060] a.从供体植株主花序或顶部分枝花序上取2.0～4.0mm长的花蕾，在显微镜下镜检小孢子以确定其发育时期；

[0061] b.经过步骤a确定之后，选取小孢子处于单核中期至双核初期的花蕾(花蕾的长度为2.0～3.0mm)，然后用体积浓度为75％的酒精浸泡30s、用质量浓度为0.1％的HgCl2消毒5min，再用无菌水冲洗3～5次；

[0062] c.将步骤b处理之后的花蕾置于10ml试管中，并加入Keller-13冲洗液3～5ml，用玻璃棒挤破花蕾散出小孢子，将得到的小孢子悬浮液用400滤网过滤、收集滤液；

[0063] d.将步骤c收集的滤液在600r/min的转速下离心3min，沉降小孢子、弃去上清液；然后再加入Keller-13冲洗液，重新悬浮小孢子，离心，沉降，弃去上清液，重复离心三次，弃去上清液、得到沉降小孢子；

[0064] e.在步骤d离心之后，最终得到的沉降小孢子中加入NLN-10～13培养液得到小孢子悬浮液，用血球计数板计数，调整小孢子浓度为1×105个/ml；将得到的小孢子悬浮液分装至60×15mm培养皿中，每个培养皿中2ml，用Parafilm膜封口；

[0065] f.将步骤e封装好的小孢子放入33℃的恒温培养箱中培养24h，然后转入25℃下黑暗培养；培养30天后统计小孢子胚数目，在分化培养基形成小植株，田间授粉采种保存。

[0066] 实施例3

[0067] 一种细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法，包括以下步骤：

[0068] (1)采用游离小孢子培养方法得到早熟自交不亲和系回交父本ZY15(已在河南省农业科学院种子资源中期库保存，保藏号S01A0060)(基因型AA)；

[0069] (2)以甘蓝型油菜胞质雄性不育材料oguraCMS(基因型AACC)为母本，以步骤(1)得到的大白菜早熟自交不亲和系回交父本ZY15为父本，通过种间杂交获得转育一代种子F1(基因型AA)；

[0070] (3)在田间播种步骤(2)得到的一代种子F1，选择田间表现性状与回交父本ZY15一致的优良不育单株作为下一轮的回交母本；

[0071] (4)采用步骤(3)选择的回交母本与回交父本ZY15通过回交得到转育二代种子TYMSZY15BC1；

[0072] (5)在田间播种转育二代种子TYMSZY15BC1，选择田间表现性状与回交父本ZY15一致的优良不育单株作为下一轮的回交母本；

[0073] (6)采用步骤(5)选择的回交母本与回交父本ZY15通过回交得到转育三代种子TYMSZY15BC2；

[0074] (7)重复上述步骤，经过7代回交转育得到大白菜胞质雄性不育种质材料TYMSZY15。

[0075] 其中，所述的细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料的选育方法，步骤(1)所述的游离小孢子培养方法包括以下步骤：

[0076] a.从供体植株主花序或顶部分枝花序上取2.0～4.0mm长的花蕾，在显微镜下镜检小孢子以确定其发育时期；

[0077] b.经过步骤a确定之后，选取小孢子处于单核中期至双核初期的花蕾(花蕾的长度为2.0～3.0mm)，然后用体积浓度为75％的酒精浸泡30s、用质量浓度为0.1％的HgCl2消毒5min，再用无菌水冲洗3～5次；

[0078] c.将步骤b处理之后的花蕾置于10ml试管中，并加入Keller-13冲洗液3～5ml，用玻璃棒挤破花蕾散出小孢子，将得到的小孢子悬浮液用400滤网过滤、收集滤液；

[0079] d.将步骤c收集的滤液在600r/min的转速下离心3min，沉降小孢子、弃去上清液；然后再加入Keller-13冲洗液，重新悬浮小孢子，离心，沉降，弃去上清液，重复离心三次，弃去上清液、得到沉降小孢子；

[0080] e.在步骤d离心之后，最终得到的沉降小孢子中加入NLN-10～13培养液得到小孢子悬浮液，用血球计数板计数，调整小孢子浓度为1×105个/ml；将得到的小孢子悬浮液分装至60×15mm培养皿中，每个培养皿中2ml，用Parafilm膜封口；

[0081] f.将步骤e封装好的小孢子放入33℃的恒温培养箱中培养24h，然后转入25℃下黑暗培养；培养30天后统计小孢子胚数目，在分化培养基形成小植株，田间授粉采种保存。

[0082] 实施例4

[0083] 对实施例1所得到的细胞质雄性不育早熟大白菜种子TYMS231-330进行鉴定，包括以下步骤：

[0084] (1)根据ogura CMS的特异基因orfl38的全长序列设计引物序列，所述的引物序列如下：

[0085] 正向引物：GTCGTTATCGACCTCGCAAC

[0086] 反向引物：CAATTGGGTTCACAAAGCAT；

[0087] (2)采用常用的CTAB法提取TYMS231-330种子中的DNA以及父本材料Y231-330种子中的DNA，以及并以步骤(1)所述的引物对为引物分别对TYMS231-330种子中的DNA以及父本材料Y231-330种子中的DNA进行PCR扩增，扩增步骤如下：

[0088] PCR反应体系共20μL，其成分及比例如下：10×Taq Buffer(Mg2+plus)2μL；dNTP Mix(10mM each)0.4μL；Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL；ddH2O 13.9μL；正反向引物共0.8μL；模板DNA 2μL，加双蒸馏水补足；

[0089] PCR反应程序共分为7步，第1步：94℃预变性5min；第2步：94℃变性50s；第3步：55℃退火50s；第4步：72℃延伸50s；第5步：从第2步重复35个循环；第6步：72℃延伸5min；第7步：12℃低温保存。扩增结果图如图1所示。

[0090] 由图1可以看出，在550bp附近能够稳定扩增出单一条带，而在父本材料Y231-330中未扩增出条带。即TYMS为OguraCMS不育性稳定，不育度为100％，不受环境条件的影响，易于找到保持系、找不到恢复系。

[0091] 同理，采用该方法对实施例2、实施例3得到的细胞质雄性不育早熟大白菜种质材料TYMS66-9、TYMSZY15进行鉴定，其不育度均为100％，且不受环境条件影响，易于找到保持系、找不到恢复系。

[0092] 应用实施例5

[0093] 该实施例为所得到TYMS231-330种子(已在河南省农业科学院种子资源中期库保存，保藏号为S01A0058)的应用，包括以下步骤：

[0094] (1)以本发明得到的TYMS231-330为母本、Y18-58(已在河南省农业科学院种子资源中期库保存，保藏号为S01A0059)为父本进行杂交，田间制种TYMS231-330与Y18-58比例为4:2(即田间种植4行TYMS231-330、2行Y18-58，按照该比例进行种植)；

[0095] (2)花期结束后，拔除父本，生产的杂交一代种子的纯度为100％。

[0096] 应用实施例6

[0097] 将实施例1经过7代回交转育得到大白菜胞质雄性不育种质材料TYMS231-330和回交父本材料Y231-330于秋季同时播种于田间，从苗期到结球期进行田间对比，如图3所示，TYMS231-330与Y231-330表现一致，生长势中等，外叶深绿色，无茸毛,叶球矮桩叠抱，卵圆形，单球质量0.6kg，抗热性强。