多糖水溶液的灭菌方法及无菌的多糖水溶液

摘要

由于多糖因其水溶液的高粘度无法通过无菌过滤进行灭菌，多糖通常通过伽马辐射或蒸汽来灭菌，但是这会导致聚合物链的降解。本发明提供了一种灭菌方法，根据该方法，多糖水溶液在内酯和缓冲体系的存在下储存至少24小时。本发明还提供了以此方式制备的无菌多糖溶液。

权利要求

1.多糖水溶液的灭菌方法，

其特征在于，

在缓冲液存在下将β-内酯添加到多糖水溶液中，并将混合物在4℃至40℃的温度下储存至少24小时。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-内酯选自由通式（I）表示的化合物（a1），

其中R1、R2、R3和R4彼此独立地代表H、取代或未取代的烃基、卤素基团、硝基或氰基；和化合物（a2），其选自化合物（a1）的二聚体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述β-内酯为β-丙内酯（CAS编号57-57-8）。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，

相对于所述多糖水溶液的量，所述β-内酯以大于/等于0.5重量%的量添加。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述多糖选自透明质酸的钠盐、羧甲基纤维素的钠盐、羟乙基纤维素、羟乙基淀粉、甲基纤维素和氧化纤维素。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，使用pH值7.0-8.0的磷酸盐缓冲液作为缓冲体系。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，使用pH值7.4的磷酸盐缓冲液作为缓冲体系。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液选自磷酸氢钾和磷酸氢二钠的组合、磷酸氢钠和磷酸氢二钠的组合、磷酸二钠和磷酸的组合、磷酸三钠和磷酸氢钠的组合以及磷酸三钠和磷酸的组合。

9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，由β-丙内酯的水解产生的3-羟基丙酸是缓冲体系的组分。

10.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，3-羟基丙酸和透明质酸的钠盐或3-羟基丙酸和羧甲基纤维素的钠盐组成缓冲体系。

11.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，以大于/等于0.5重量%的浓度将所述缓冲液的所有组分一起溶解在所述多糖水溶液中。

12.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述多糖水溶液的灭菌在初级包装器件内部发生。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，将所述多糖水溶液和β-内酯混合后立刻将多糖水溶液填充到初级包装器件中。

14.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，

a) 将至少一种多糖溶解在水中；

b) 将至少0.5重量%的β-内酯添加到a）中制备的多糖水溶液中；

c) 将混合物在4℃至40℃的温度下储存至少24小时，其中所述水溶液含有缓冲体系，该缓冲体系的缓冲能力足以缓冲由所述β-内酯的水解产生的3-羟基丙酸，从而使灭菌后的多糖水溶液的pH值等于未灭菌的多糖溶液的pH值。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法制备的无菌多糖溶液，其特征在于，所述多糖水溶液含有至少一种至少部分可溶于水的多糖、水和3-羟基丙酸，以及缓冲体系。

16.根据权利要求15所述的无菌多糖溶液，其特征在于，所述缓冲体系含有钠离子、磷酸二氢根离子、磷酸氢根离子、磷酸根离子、3-羟基丙酸和3-羟基丙酸根。

17.根据权利要求1-14中任一项所述的方法制备的无菌多糖溶液在制备用于粘性补充疗法的制品中的用途。

18.根据权利要求1-14中任一项所述的方法制备的无菌多糖溶液用作人用药和兽用药的药物载体的用途。

说明书

多糖水溶液的灭菌方法及无菌的多糖水溶液

技术领域

[0001] 本发明的主题是一种多糖水溶液的灭菌方法以及通过所述方法制备的多糖溶液。

背景技术

[0002] 关节病（变形性关节病）是一种常见的关节退行性疾病。其包括软骨表面的损伤（磨损）、软骨颗粒的脱离、以及软骨颗粒导致的滑膜炎症。在轻中度关节病的情况下，近年来已经尝试使用透明质酸的关节内注射(粘性补充疗法(visco-supplementation))来改善患者的疼痛状态并同时减缓关节病的进展。

[0003] 透明质酸是滑液（关节液）的一种天然成分。透明质酸在滑液中起到润滑剂的作用。特别有利的是，透明质酸水溶液是粘弹性的。这导致非常良好的润滑性和滑动性。

[0004] 由于有利的润滑性，过去的近二十年以来，透明质酸溶液已被用于粘性补充疗法。现有技术的目前状态是使用由发酵制成并且以无菌透明质酸水溶液形式使用的透明质酸。
除此之外，原则上也可以将水溶性纤维素衍生物，如羧甲基纤维素和甲基纤维素，以及淀粉衍生物，如羟乙基淀粉，用于粘性补充疗法。

[0005] 迄今为止，一般通过暴露于伽马辐射来灭菌透明质酸水溶液。在此情况下通常使用25 kGy或更高的剂量。该灭菌法对最终包装好的透明质酸溶液实施。

[0006] 但是，伽马辐射暴露会带来严重的缺陷。由于聚合物链的降解，根据伽马辐射的剂量会产生或多或少的低分子量降解产物，除此之外，还可能出现导致透明质酸溶液变色的副反应。使用伽马辐射的另一个缺陷是，常用的伽马源具有球面辐射场。因此，入射剂量可随着待灭菌物体的位置而变化。这导致不均匀的聚合物降解，不均匀的聚合物降解可能会造成最终粘度的不均匀性。实际上不可能得到灭菌后的透明质酸溶液的可重复的最终粘度。另外，伽马辐射会导致包装器件（通常是一次性塑料注射器）的脆性。

[0007] 透明质酸水溶液的蒸汽灭菌也会带来类似的缺陷，其会导致透明质酸和塑料包装器件的损坏。

[0008] 由于溶液的粘度相对较高，透明质酸水溶液的无菌过滤基本上是不可行的，或者仅在付出超常努力的情况下可行。并且，无菌过滤仅能够除去一定尺寸的微生物生命形态。无菌过滤不能除去或灭活病毒。

[0009] 除了所述物理方法外，通常还使用化合物用于医疗产品的灭菌。

[0010] 这些化合物包括甲醛、戊二醛、邻苯二甲醛。使用醛类灭菌的缺陷在于，需要在灭菌后再将醛类除去，以防止在人体中使用期间造成损害。这就排除了在储存在其最终包装中的透明质酸水溶液的情况下用醛类进行灭菌。醛类无法再从储存在其最终包装中的透明质酸溶液中除去。

[0011] 氧化剂，如过氧化氢、过氧甲酸、过氧乙酸、次氯酸以及释放次氯酸的物质（如氯胺T 2或三氯异氰尿酸），是非常有效的灭菌手段。这些试剂的缺陷在于，它们会造成溶解的透明质酸的显著氧化降解。另外，未反应的氧化剂残余物可残留在储存在其最终包装中的透明质酸溶液中，并且可能会具有局部毒性作用。

[0012] 制药业中已知，蛋白质水溶液，如疫苗，对氧化灭菌剂和各种物理灭菌法（例如用伽马辐射灭菌）的作用非常敏感。为此，这些蛋白质水溶液先经过无菌过滤，然后添加少量的β-丙内酯以灭活病毒。β-丙内酯酰化病毒的DNA/RNA或蛋白质的氨基。作为溶剂存在的水能够缓慢分解β-丙内酯，从而仅经过短时间就可使蛋白质水溶液中不再存在任何活性的β-丙内酯。迄今为止，已知气态β-丙内酯会不可逆地灭活内生孢子（R. K. Hoffmann, B. Warshowsky: Beta-Propiolactone Vapor as a Disinfectant. Appl. Microbiol. 1958年9月；6(5): 358-362）。并且，已知β-丙内酯在非水有机单体/单体混合物和含有有机单体的糊状粘固粉（pasty cements）中灭活内生孢子（EP 2 596 812 B1）。

[0013] 但是，除了繁殖形态（vegetative  form）外，微生物还具有可生性形态（generative form），如内生孢子。微生物的这些可生性生存形态由革兰氏阳性菌，特别是杆菌和梭菌属形成，作为在不利生存条件下持续存在的一种手段。在它们的休眠状态下，内生孢子没有活跃的代谢，并且具有多层孢子荚膜以极大程度地保护孢子芯免受化学物质作用和其他环境影响。这使得孢子对热和化学物质的作用极为耐受（Borick, P. M.: Chemical sterilizers. Adv. Appl. Microbiol. 10 (1968) 291-312; Gould, G. W.: Recent advances in the understanding of resistance and dormancy in bacterial spores. J. Appl. Bacteriol. 42 (1977) 297-309; Gould, G. W.: Mechanisms of resistance and dormancy. p. 173-209. In Hurst, A. and Gould, G. W. (ed.), The bacterial spore. vol. 2 Academic Press, Inc. 纽约, 1983）。由于它们的抗性高，内生孢子被用作验证和控制灭菌过程有效性的生物指示物。这是基于以下假设：内生孢子的灭活指示杀灭了所有繁殖型微生物生命形态。革兰氏阳性菌的内生孢子被分类在国际抗性III级中。抗性I级包括无孢子形成的细菌和形成孢子的细菌的繁殖形态，抗性II级包括在105 ℃的蒸汽流中几分钟之内被杀灭的孢子。根据DAB 2008（德国药典），所有抗性I-III级的微生物均必须被杀灭或不可逆地灭活。

发明内容

[0014] 本发明的目的在于开发一种多糖水溶液的灭菌方法。所述方法能够在灭菌的同时不引起溶解的多糖聚合物的显著降解。

[0015] 并且，要开发的灭菌方法应适于对储存在其最终包装中的多糖水溶液、包括与所述多糖水溶液接触的包装器件的内壁进行灭菌。要开发的灭菌方法应安全地灭活耐受性III级的微生物。

[0016] 在本发明的范围内，无菌应被理解为意指根据EN 556-1:2001不含活的微生物的状态。

[0017] 根据权利要求1，本发明的目的通过一种多糖水溶液的灭菌方法得以解决。根据本发明，在缓冲液存在下将β-内酯添加到多糖水溶液中，混合物在4 ℃至40 ℃的温度下储存至少24小时。

[0018] 一个优选的方法的特征在于：

[0019] a) 将至少一种多糖溶解在水中；

[0020] b) 将至少0.5重量%的β-内酯添加到a）中制备的多糖水溶液中；

[0021] c) 将混合物在4 ℃至40 ℃的温度下储存至少24小时，其中

[0022] 所述水溶液含有缓冲体系，该缓冲体系的缓冲能力足以缓冲由所述β-内酯的水解产生的3-羟基丙酸，从而使灭菌后的多糖水溶液的pH值等于未灭菌的多糖溶液的pH值。

[0023] 根据权利要求14，所述目的通过根据上述方法中的任一种制得的无菌多糖溶液也得以实现。

[0024] 显然，令人惊讶地，通过使用根据权利要求1所述的方法，可对多糖水溶液进行灭菌而仅发生最低程度的聚合物降解。这意味着灭菌后的多糖溶液的增比比浓粘度（reduced specific viscosity）与未灭菌的多糖溶液的增比比浓粘度的比率可保持在大于/等于0.8。在确定该比率时，是否测量增比比浓粘度、动力粘度或运动粘度是不重要的。在对多糖水溶液可进行凝胶渗透色谱法处理的情况下，灭菌后的多糖的数均摩尔质量与未灭菌的多糖的数均摩尔质量的比率可保持在大于/等于0.8。并且，根据本发明的灭菌方法不会引起任何由于灭菌过程中的副反应而导致的变色。

[0025] 悬浮在多糖水溶液中的耐受性III级的内生孢子通过根据本发明的方法经由β-内酯的作用灭活。在这种情况下，所述多糖溶液含有缓冲液，所述缓冲液足以能够缓冲由所述β-内酯的水解释放的3-羟基丙酸，从而使灭菌后的多糖溶液的pH值等于之前未灭菌的多糖溶液的pH值。优选在这种情况下使用与β-内酯等量的缓冲液。

[0026] 本发明进一步基于以下令人惊讶的发现：β-内酯允许多糖水溶液的灭菌在缓冲液的存在下进行，而在所述灭菌过程中没有发生多糖的显著聚合物降解。根据本发明的灭菌方法的特别优势在于，所述多糖溶液在灭菌前后的粘度保持相等。提及多糖水溶液用于粘性补充疗法的用途，这意味着所述溶液的粘度可在灭菌前精确调整，因为没有由于灭菌过程而导致的粘度变化。因此，可提供精确调整了粘度和其他流变性质的无菌多糖溶液用于粘性补充疗法。另一个优点是，不存在由于所述灭菌方法导致的多糖水溶液的变色。

[0027] 多糖是其中大量（至少10个）单糖通过糖苷键彼此相连形成的碳水化合物。在本发明范围内的水溶性多糖为由单糖、双糖、其进一步的寡聚物或衍生物组成并且以相同的方式彼此相连的多糖。

[0028] 根据本发明，所述多糖为天然多糖和人工多糖。根据本发明，衍生物应被理解为盐、醚、酸或酯的酯，尤其是碱金属盐，特别是钠盐和钾盐。实例包括海藻酸、海藻酸钠、透明质酸、透明质酸的钠盐、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素的钠盐、羟乙基纤维素、纤维素醚、淀粉、淀粉醚、瓜尔胶、甲壳素、壳聚糖。

[0029] 优选地，所述多糖选自透明质酸的钠盐、羧甲基纤维素的钠盐、羟乙基纤维素、羟乙基淀粉、甲基纤维素和氧化纤维素。

[0030] 根据本发明，所述多糖也可以是上述多糖的混合物。

[0031] 所述多糖优选以至少0.5重量%的量使用。并且，优选以至多5重量%的量使用。特别优选以1-2重量%的量使用多糖。每种情况下的量是指水中多糖的量。

[0032] 所述β-内酯可为由通式（I）表示的化合物（a1）

[0033] ，

[0034] 在所述式中，R1、R2、R3和R4彼此独立地可代表H、取代或未取代的烃基、卤素基团、硝基或氰基。

[0035] 化合物（a1）的立体化学不受任何方式的限制。优选地，本发明的范围包括由通式（I）表示的所有异构体作为化合物（I），无论它们的确切构型如何。

[0036] 所述烃基彼此独立地可为取代的或未取代的烃基。取代的烃基的至少一个取代基优选选自卤素基团、硝基和氰基。

[0037] 所述烃基彼此独立地可为饱和或不饱和烃基。优选地，不饱和烃基包括至少一个碳-碳双键。

[0038] 所述烃基彼此独立地可为支化或未支化的烃基。优选烃基R1、R2、R3和R4为未支化的烃基。

[0039] 所述烃基彼此独立地具有1-4个碳原子范围内的主链长度，优选1-2个碳原子范围内的主链长度，甚至更优选1个碳原子。

[0040] 氟基、氯基和溴基是通式（I）中优选的卤素基团。所述基团各自彼此独立地可代表基团R1、R2、R3和R4中的一个或多个。

[0041] 根据一个优选的实施方案，基团R1、R2、R3和R4各自代表H。

[0042] 根据另一个优选的实施方案，基团R1代表甲基且基团R2、R3和R4代表H。

[0043] 根据另一个优选的实施方案，基团R1、R2和R3代表H且基团R4代表甲基。

[0044] 根据再一个优选的实施方案，基团R1和R3代表H且基团R2和R4代表甲基。

[0045] 根据一个特别优选的实施方案，化合物（a1）为β-丙内酯 （CAS编号57-57-8）。

[0046] 所述β-丙内酯也可以是化合物（a2），其为任一化合物（a1）的二聚体。化合物（a2）的立体化学不受任何方式的限制。

[0047] 根据本发明，pH值7.0-8.0的磷酸盐缓冲液优选作为缓冲液，其中pH值7.4的磷酸盐缓冲液是特别优选的。

[0048] 特别地，磷酸氢钾和磷酸氢二钠的组合、磷酸氢钠和磷酸氢二钠的组合、磷酸二钠和磷酸的组合、磷酸三钠和磷酸氢钠的组合以及磷酸三钠和磷酸的组合非常适合制备所述磷酸盐缓冲液。

[0049] 优选地，以大于/等于0.5重量%的浓度将所述磷酸盐缓冲液的所有组分一起溶解在所述多糖水溶液中。

[0050] 根据本发明，由所述β-丙内酯的水解产生的3-羟基丙酸是所述缓冲液的组分。

[0051] 根据本发明，3-羟基丙酸和透明质酸的钠盐或3-羟基丙酸和羧甲基纤维素的钠盐组成缓冲液。

[0052] 对于本发明而言重要的是，所述多糖水溶液的灭菌在初级包装内部发生。因此，不需要额外的努力，如伽马辐射或电子辐射或高压蒸汽灭菌。因此，可节省大量生产成本。

[0053] 为了成功灭菌，重要的是将所述多糖水溶液和β-丙内酯混合后立刻将多糖水溶液填充到初级包装器件中。这保证了可将足够的灭菌剂用于多糖溶液和初级包装器件内壁的灭菌。反之，如果将所述多糖溶液和β-丙内酯混合一段延长的时间后再填充所述初级包装器件，则根据温度和在填充所述初级包装器件之前消逝的时间,可能会因水解生成3-羟基丙酸而损失β-丙内酯。特别地，这会导致所述初级包装器件的内壁的灭菌产生问题。

[0054] 本发明的范围包括根据本发明的方法制备的无菌多糖水溶液。所述无菌多糖溶液的特征在于，所述多糖水溶液含有至少一种至少部分可溶于水的多糖、水和3-羟基丙酸，以及缓冲体系。

[0055] 并且，根据本发明，所述无菌多糖水溶液含有由钠离子、磷酸二氢根离子、磷酸氢根离子、磷酸根离子、3-羟基丙酸和3-羟基丙酸根组成的缓冲体系。其中也可含有钾离子。

[0056] 根据本发明，灭菌后的多糖溶液的比浓粘度（reduced viscosity）与未灭菌的多糖溶液的比浓粘度的比率大于0.8。

[0057] 本发明的范围还包括所述无菌多糖水溶液用于粘性补充疗法以及作为人用药和兽用药的药物载体的用途。

具体实施方式

[0058] 通过以下呈现的实施例对本发明进行说明，但不限制本发明的范围。实施例

[0059] 将以下的多糖和/或多糖衍生物用于下述实验中：

[0060] 透明质酸的钠盐（Mn 130万道尔顿，Kraeber GmbH），~

[0061] 羧甲基纤维素的钠盐（Mn 90,000道尔顿，Sigma-Aldrich），~

[0062] 甲基纤维素（SM-4000, Shin-Etsu-Chemical Co.），

[0063] 羟乙基纤维素（60SH-4000, Shin-Etsu-Chemical. Co）

[0064] 制备pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。为此目的，将1.65 g磷酸氢钾和9.71 g二水合磷酸氢二钠溶于1升蒸馏水中。

[0065] 实施例1

[0066] 各使用30 mL磷酸盐缓冲液（pH值7.4）制备多糖溶液。

[0067]多糖 多糖在磷酸盐缓冲液中的浓度[wt.%]
透明质酸的钠盐 0.25
羧甲基纤维素的钠盐 2.00
甲基纤维素 (SM-4000) 1.00
羟乙基纤维素 (60SH-4000) 1.00

[0068] 将总计106 cfu的萎缩芽孢杆菌（Bacillus atropheus）的孢子悬浮液添加到无菌的25 mL塑料管中的5ml的各多糖溶液中。然后用涡旋混合器使孢子均匀悬浮。接下来，将0.5重量%、1.0重量%和2.0重量%的β-丙内酯添加到5 mL的预先混合了孢子的各多糖溶液中。然后将样品在涡旋混合器中再次均化。未用β-丙内酯处理的多糖溶液用作阳性对照。在室温下储存48小时之后，按照DIN EN ISP 11737第二部分对多糖溶液进行无菌测试。该测试一式两份进行。

[0069]

[0070] （+）生长 （-）未生长。

[0071] 与用作阳性对照的未处理的多糖溶液相比，用β-丙内酯灭菌的多糖溶液显示没有任何变色。

[0072] 实施例2

[0073] 将以下的多糖用于下述实验中：

[0074] NaHya 1: 透明质酸的钠盐 （Mn   100万道尔顿，Sigma-Aldrich），~

[0075] NaHya 2: 透明质酸的钠盐 （Mn   130万道尔顿，Kraeber GmbH），~

[0076] NaHya 3: 透明质酸的钠盐 （Mn   200,000道尔顿，用二氧化氯降解的透明质酸）~

[0077] 将透明质酸溶解在pH7.4的磷酸盐缓冲液中，以各自达到1重量%的浓度。总计5 mL的各透明质酸溶液与100 μl的β-丙内酯混合，并在室温下储存48小时。与此平行地，也储存未用β-丙内酯处理的透明质酸溶液作为对照。在另一个对比中，未用β-丙内酯处理的透明质酸溶液用伽马辐射灭菌。透明质酸溶液的伽马灭菌由BBF Sterilisationsservice GmbH 使用 Co60 源以25.2 kGy的剂量进行。

[0078] 未灭菌条件下的透明质酸溶液的pH值为7.4，在用β-丙内酯灭菌后pH仍为7.4。与未灭菌的透明质酸溶液相比，用β-丙内酯灭菌的透明质酸溶液显示没有任何变色。未灭菌的透明质酸溶液和用β-丙内酯灭菌的透明质酸溶液目测均为透明且无色的。相反，用伽马辐射灭菌的透明质酸溶液表现出轻微的变黄。

[0079] 透明质酸样品的分子量和分子量分布通过凝胶渗透色谱法使用普鲁兰标准品来确定。使用折光指数检测器（RI检测器）作为检测器。该测量使用来自Jasco的GPC设备一式两份进行。

[0080]

[0081] Mn：数均摩尔质量

[0082] Mw：重均摩尔质量

[0083] D：多分散性。

[0084] 多糖溶液用β-丙内酯灭菌并未导致聚合物降解。通过对比可见，伽马灭菌导致了显著的聚合物降解。

[0085] 实施例3

[0086] 将以下的多糖衍生物用于下述实验中：

[0087] 羧甲基纤维素的钠盐（Mw   90,000道尔顿，Sigma-Aldrich），~

[0088] 羟乙基纤维素（60SH-4000, Shin-Etsu-Chemical. Co）

[0089] 各使用30 mL的磷酸盐缓冲液（pH值7.4）制备多糖溶液。

[0090]多糖 多糖在磷酸盐缓冲液中的浓度 [wt.%]
羧甲基纤维素的钠盐 2.00
羟乙基纤维素 (60SH-4000) 1.00

[0091] 将总计100 mg的β-丙内酯添加到5 mL的各多糖溶液中，混合，并在室温下储存48小时。未处理的多糖溶液用作对照。为了对溶液进行粘度测量，将溶液稀释至0.2重量%和0.4重量%的多糖浓度。由于聚合物降解程度高，通过伽马辐射灭菌的多糖溶液未进行稀释而测量。

[0092] 与未灭菌的多糖溶液相比，用β-丙内酯灭菌的透明质酸溶液显示没有任何变色。

[0093] 在25 ℃下使用Ubbelohde粘度计（毛细管I，K=0.010257）测量稀释后的多糖溶液（5倍测量）。

[0094]

[0095] 注：使用了目测透明的甲基纤维素溶液。但是，不能排除甲基纤维素溶液中可能存在透明的凝胶颗粒。这可能是灭菌后的甲基纤维素溶液与未灭菌的甲基纤维素溶液相比运动粘度略高的原因。在灭菌后的甲基纤维素溶液中可能存在凝胶颗粒。

[0096] 用β-丙内酯灭菌的多糖溶液的运动粘度基本上与未灭菌的多糖溶液的运动粘度相同。多糖溶液用β-丙内酯灭菌并不会引起聚合物降解。相反，由伽马灭菌的多糖溶液的运动粘度与未灭菌的多糖溶液的运动粘度的对比明显可见，伽马灭菌导致相当量的聚合物降解。