一种牛肠激酶轻链负载磁珠及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种牛肠激酶轻链负载磁珠及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明设计合成生物素化酶识别肽与bEKL融合表达的核苷酸序列，通过在大肠杆菌中高效表达和体外复性的方法，制备生物素修饰的bEKL，而后利用生物素与链霉亲合素之间极强的亲和力，将bEKL稳定负载于偶联链霉亲合素的磁性颗粒。应用该方法制备的bEKL负载磁珠可以特异性切割含有肠激酶酶切位点的底物，能够用于重组蛋白融合标签的切除。本发明制备的bEKL负载磁珠提高了酶的使用效率，降低了使用成本，为生物工程制药业、生物化学和分子生物学等方面的研究提供了有力的工具。

权利要求

1.一种牛肠激酶轻链负载磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)基因合成生物素化酶识别肽段Avi·tag与bEKL融合表达的核苷酸序列，采用定向克隆法将该核苷酸序列插入pET-28a质粒中，构建得到重组质粒pET-28a-Avi-bEKL；生物素化酶识别肽段Avi·tag与bEKL融合表达的核苷酸序列全长867bp，其5’端含有NcoI酶切位点，

3’端含有XhoI酶切位点，序列如SEQ ID NO.1所示；

2)将重组质粒pET-28a-Avi-bEKL转化入大肠杆菌中，诱导表达生物素修饰的bEKL包涵体蛋白，然后超声裂解破碎细菌，制备包涵体，采用稀释复性法，得到生物素修饰的bEKL；

3)将生物素修饰的bEKL与链霉亲合素磁珠孵育，利用生物素与链霉亲合素之间极强的亲和力，制备得到bEKL负载磁珠。

2.根据权利要求1所述的牛肠激酶轻链负载磁珠的制备方法，其特征在于，步骤2)中，以超声裂解仪破碎细菌，超声裂解参数为：直径6mm振幅杆，30％功率，开3秒/停3秒，超声裂解时间为20分钟。

3.根据权利要求1所述的牛肠激酶轻链负载磁珠的制备方法，其特征在于，所述的链霉亲合素磁珠是由链霉亲合素通过共价键偶联在磁性微球载体表面制备而成。

4.采用权利要求1～3中任意一项所述的制备方法制得的牛肠激酶轻链负载磁珠。

5.权利要求4所述的牛肠激酶轻链负载磁珠作为肠激酶制剂在蛋白表达纯化技术中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述牛肠激酶轻链负载磁珠能够特异性切割含有肠激酶酶切位点的底物。

7.如权利要求6所述的应用，所述含有肠激酶酶切位点的底物为含有非必需 肽段的重组蛋白。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组蛋白为含有Fc标签序列的Fc-EGFP融合蛋白，该融合蛋白由重组质粒pcDNA3.1-Fc-EGFP转染表达得到；其中：所述的重组质粒pcDNA3.1-Fc-EGFP是将编码人IgG重链分泌信号肽-Fc(人IgG1)蛋白的基因片段与含有肠激酶酶切位点的EGFP基因片段，采用定向克隆方法连入pcDNA3.1(-)质粒中获得；

编码人IgG重链分泌信号肽-Fc(人IgG1)蛋白的基因片段，全长729bp，5’端含有NheI酶切位点、3’端含有XhoI酶切位点，序列如SEQ ID NO.2所示；

编码含有肠激酶酶切位点的EGFP基因片段，全长753bp，5’端含有XhoI酶切位点、3’端含有和BamHI酶切位点，序列如SEQ ID NO.3所示。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组蛋白为含有Fc标签序列的Fc-IL2融合蛋白，该融合蛋白由重组质粒pcDNA3.1-Fc-IL2转染表达得到；其中：所述重组质粒pcDNA3.1-Fc-IL2是将编码含有肠激酶酶切位点的IL2基因片段，采用定向克隆方法连入pcDNA3.1-Fc-EGFP重组质粒中获得；

编码含有肠激酶酶切位点的IL2基因片段，全长435bp，5’端含有XhoI酶切位点、3’端含有和BamHI酶切位点，序列如SEQ ID NO.4所示。

说明书

一种牛肠激酶轻链负载磁珠及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种牛肠激酶轻链负载磁珠及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 肠激酶(Enterokinase，EC 3.4.21.9)存在于哺乳动物的十二指肠粘膜中，是使胰蛋白酶原水解成为活性胰蛋白酶的肽链内切酶(endo-peptidase)。牛肠激酶是由一条重链(799AA)和一条轻链(235AA)通过共价键连接而成的异源二聚体。牛肠激酶重链无催化活性，具有多个跨膜结构域，定位于十二指肠刷状缘膜表面，保证肠激酶对胰蛋白酶原的特异性切割。而其轻链具有催化作用，能够在不依赖其重链的条件下识别含有DDDDK氨基酸序列的多肽或蛋白，并切开赖氨酸与其羧基端紧邻氨基酸之间的肽键。因此，牛肠激酶轻链(bovine Enterokinase light chain,bEKL)常用于将融合标签序列从目的蛋白的氨基端切除，得到不含有任何非必须氨基酸残基的目的蛋白。

[0003] 最初的肠激酶制剂提取自牛或猪的十二指肠粘膜，因其来源有限和质量稳定性差等问题，无法实现广泛应用。随着生物技术的发展，bEKL在大肠杆菌或酵母等工程细胞中进行异源表达得以实现。异源表达的bEKL蛋白具有与原始肠激酶相同的肽链内切酶特异性和活性，能够实现大规模制备并且质量稳定，逐渐成为商品化肠激酶制剂的主要形式，bEKL在生物工程领域的应用也越来越广泛。

[0004] 目前，bEKL已成为科研工作者在蛋白表达纯化过程中切除融合标签等非必须肽段的首选肽链内切酶之一。肠激酶酶促反应效率较高，通常微克级的bEKL即可制备足够量的目的蛋白用于功能学实验。若需要获得大量的目的蛋白，进行结构研究等方向的实验，bEKL的消耗也随之增加，达到毫克级别。虽然使用工程细胞异源表达相比从动物组织提取，bEKL的制备成本已经显著下降，但是商品化肠激酶制剂的售价依然较高，大量bEKL的使用为科研工作带来不小的支出。酶作为一种生物催化剂，其自身在反应前后不会发生含量和活力的改变。因此，完成酶切反应后的肠激酶，依然具有足够的活力用于下一次的反应。但是，目前商品化bEKL制剂均无法通过简便易行的操作步骤实现对酶的反复利用，客观上造成了对酶制剂的浪费。

[0005] 应用bEKL对融合蛋白完成标签肽段切除后，为了不影响最终产物的纯度，需要将bEKL与目的蛋白分离。常用偶联bEKL抗体的树脂对酶切反应体系中的bEKL进行去除。但是商品化bEKL吸附树脂价格较高，并且无法反复使用，极大限制了此类产品在bEKL去除步骤的应用。目前，一些供应商提供融合有6×His标签序列的bEKL，应用其进行标签肽段切除后，可通过镍柱将酶切反应体系中bEKL去除。将结合到填料的bEKL洗脱后，镍柱可以实现反复使用，使用成本较偶联抗体的吸附树脂大幅下降。但是，无论使用吸附树脂或镍柱去除bEKL，都需要在蛋白纯化过程中增加额外的操作步骤，不仅使纯化工艺复杂化，而且目的蛋白的得率也有所降低。

发明内容

[0006] 为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种牛肠激酶轻链负载磁珠及其制备方法和应用，能够有效解决现有的牛肠激酶轻链制剂无法反复利用以及完成酶切反应后不易去除的问题。

[0007] 本发明是通过以下技术方案来实现：

[0008] 本发明公开了一种牛肠激酶轻链负载磁珠的制备方法，包括以下步骤：

[0009] 1)基因合成生物素化酶识别肽段Avi·tag与bEKL融合表达的核苷酸序列，采用定向克隆法将该核苷酸序列插入pET-28a质粒中，构建得到重组质粒pET-28a-Avi-bEKL；

[0010] 2)将重组质粒pET-28a-Avi-bEKL转化入大肠杆菌中，诱导表达生物素修饰的bEKL包涵体蛋白，然后超声裂解破碎细菌，制备包涵体，采用稀释复性法，得到生物素修饰的bEKL；

[0011] 3)将生物素修饰的bEKL与链霉亲合素磁珠孵育，利用生物素与链霉亲合素之间极强的亲和力，制备得到bEKL负载磁珠。

[0012] 优选地，步骤1)中，生物素化酶识别肽段Avi·tag与bEKL融合表达的核苷酸序列全长867bp，其5’端含有NcoI酶切位点，3’端含有XhoI酶切位点，序列如SEQ ID NO.1所示。

[0013] 优选地，步骤2)中，以超声裂解仪破碎细菌，超声裂解参数为：直径6mm振幅杆，30％功率，开3秒/停3秒，超声裂解时间为20分钟。

[0014] 优选地，所述的链霉亲合素磁珠为海狸纳米科技(苏州)有限公司产品，是由链霉亲合素通过共价键偶联在磁性微球载体表面制备而成，能够高效结合生物素修饰的核酸、蛋白等分子。

[0015] 本发明还公开了采用上述的制备方法制得的牛肠激酶轻链负载磁珠。

[0016] 本发明还公开了采用上述的牛肠激酶轻链负载磁珠作为肠激酶制剂在蛋白表达纯化技术中的应用。

[0017] 所述牛肠激酶轻链负载磁珠能够特异性切割含有肠激酶酶切位点的底物。

[0018] 所述含有肠激酶酶切位点的底物为含有融合标签等非必须肽段的重组蛋白。常用的重组蛋白标签序列为Fc、6*His、GST、FLAG等。

[0019] 所述重组蛋白为含有Fc标签序列的Fc-EGFP融合蛋白，该融合蛋白由重组质粒pcDNA3.1-Fc-EGFP转染表达得到；其中：

[0020] 所述的重组质粒pcDNA3.1-Fc-EGFP是将编码人IgG重链分泌信号肽-Fc(人IgG1)蛋白的基因片段与含有肠激酶酶切位点的EGFP基因片段，采用定向克隆方法连入pcDNA3.1(-)质粒中获得；

[0021] 编码人IgG重链分泌信号肽-Fc(人IgG1)蛋白的基因片段，全长729bp，5’端含有NheI酶切位点、3’端含有XhoI酶切位点，序列如SEQ ID NO.2所示；

[0022] 编码含有肠激酶酶切位点的EGFP基因片段，全长753bp，5’端含有XhoI酶切位点、3’端含有和BamHI酶切位点，序列如SEQ ID NO.3所示。

[0023] 所述重组蛋白含有FC标签序列的Fc-IL2融合蛋白，该融合蛋白由重组质粒pcDNA3.1-Fc-IL2转染表达得到；其中：

[0024] 所述重组质粒pcDNA3.1-Fc-IL2是将编码含有肠激酶酶切位点的IL2基因片段，采用定向克隆方法连入pcDNA3.1-Fc-EGFP重组质粒中获得；

[0025] 编码含有肠激酶酶切位点的IL2基因片段，全长435bp，5’端含有XhoI酶切位点、3’端含有和BamHI酶切位点，序列如SEQ ID NO.4所示。

[0026] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

[0027] 本发明提供了一种能够反复使用的牛肠激酶轻链负载磁珠的制备方法，具体是设计合成生物素化酶识别肽(Avi·tag)与bEKL融合表达的核苷酸序列，通过在大肠杆菌中高效表达和体外复性的方法，制备生物素修饰的bEKL，而后利用生物素与链霉亲合素之间极强的亲和力，将bEKL稳定负载于偶联链霉亲合素的磁性颗粒。应用该方法制备的bEKL负载磁珠可以特异性切割含有肠激酶酶切位点的底物，能够用于重组蛋白融合标签的切除。

[0028] 相比目前商品化的bEKL制品，本发明制备的bEKL负载磁珠具有两个显著优点：第一，重组蛋白的融合标签切割完成后，可通过简单的一步磁性分离将bEKL负载磁珠从反应体系中去除，简化了纯化工艺，保证了目的蛋白的得率；第二，磁性分离回收的bEKL负载磁珠酶切活力无显著下降，能够反复使用。本发明通过bEKL负载磁珠切割Fc-EGFP融合蛋白以及bEKL负载磁珠制备无标签IL2的实验验证，bEKL负载磁珠具有较高的切割活性，且能够反复使用，能够保持稳定的酶切活力。本发明制备的bEKL负载磁珠提高了酶的使用效率，降低了使用成本，为生物工程制药业、生物化学和分子生物学等方面的研究提供了有力的工具。

附图说明

[0029] 图1为bEKL负载磁珠的结构示意图；

[0030] 图2为重组质粒pET-28a-Avi-bEKL的结构示意图；

[0031] 图3为bEKL原核表达及磁珠负载前后bEKL蛋白检测结果；其中，A图显示了应用考马斯亮蓝染色方法检测bEKL原核表达情况，B图显示了使用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素检测bEKL原核表达及bEKL生物素修饰情况，C图显示了应用考马斯亮蓝染色方法检测磁珠负载前后bEKL蛋白变化情况，D图显示了使用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素检测磁珠负载前后bEKL蛋白变化情况；

[0032] 图4为重组质粒pcDNA3.1-Fc-EGFP及pcDNA3.1-Fc-IL2的结构示意图；

[0033] 图5为Western Bolt检测bEKL负载磁珠切割Fc-EGFP融合蛋白效果图；

[0034] 图6为bEKL负载磁珠在反复使用过程中稳定性检测结果；

[0035] 图7为Fc-IL2融合蛋白表达、酶切及IL2蛋白纯化电泳结果；

[0036] 图8为CTLL-2细胞增殖实验验证IL2蛋白活性结果。

具体实施方式

[0037] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

[0038] 本发明能够解决目前的bEKL制剂无法反复利用以及完成酶切反应后不易去除的问题，达到降低bEKL使用成本和简化目的蛋白纯化工艺的目的。

[0039] 为达到上述目的，本发明通过以下技术手段得以实现：

[0040] 首先，基因合成生物素化酶识别肽段(Avi·tag)与bEKL融合表达的核苷酸序列，以定向克隆法将其插入pET-28a质粒中，构建原核表达载体pET-28a-Avi-bEKL，结构参见图2；而后，在大肠杆菌中诱导表达生物素修饰的bEKL包涵体蛋白；接着，超声裂解破碎细菌，制备包涵体，通过稀释复性的方法得到具有生物活性的bEKL；最后，将生物素修饰的bEKL与链霉亲合素磁珠孵育，利用生物素与链霉亲合素之间极强的亲和力，制备得到bEKL负载磁珠，结构如图1所示。

[0041] 为了验证bEKL负载磁珠的酶切活性，本发明构建了含有肠激酶酶切位点的Fc-EGFP融合蛋白真核表达载体pcDNA3.1-Fc-EGFP，并在哺乳动物细胞HEK293-F中表达，以proteinA亲和层析填料纯化Fc-EGFP融合蛋白。使用不同剂量的bEKL负载磁珠与50μg Fc-EGFP融合蛋白室温混合16小时，Western Blot检测Fc-EGFP融合蛋白被bEKL负载磁珠切割的效率。参见图5，结果显示，bEKL负载磁珠具有较高的切割活性，10μL磁珠即可将融合蛋白完全切开。

[0042] bEKL负载磁珠不仅具有高效的切割活性，而且肠激酶与磁珠之间结合稳固，具备反复使用的能力。取10μL bEKL负载磁珠与50μg Fc-EGFP融合蛋白进行酶切反应后，通过磁性分离回收bEKL负载磁珠，将回收的磁珠再次与50μg融合蛋白进行酶切反应，如此反复复酶切5次。对酶切后上清液样品进行Western Blot检测，参见图6，结果显示5次酶切反应均能够将底物蛋白完全切开，bEKL负载磁珠在反复使用过程中未发生解离，能够保持稳定的酶切活力。

[0043] bEKL负载磁珠完成融合蛋白的切割后，可通过简单的一步磁性分离将bEKL负载磁珠去除，简化了纯化工艺，保证了目的蛋白的得率。将白细胞介素2(interleukin-2，IL2)编码基因克隆入含有Fc标签序列和肠激酶酶切位点的真核表达载体中，构建重组质粒pcDNA3.1-Fc-IL2，并在哺乳动物细胞HEK293-F中表达。Fc-IL2融合蛋白使用ProteinA填料一步法亲和层析后，使用bEKL负载磁珠对Fc标签序列进行切割。酶切后样品经磁性分离去除bEKL负载磁珠后，再次与ProteinA填料混合，切除了Fc融合标签的IL2不与ProteinA填料结合，亲和层析流穿样品即为不含融合标签的IL2蛋白。电泳检测流穿样品中无标签IL2比例为95％以上，且未见肠激酶电泳条带。CTLL-2细胞增殖实验结果表明，应用bEKL负载磁珠制备的无标签IL2具有与两种商品化IL2相似的生物活性。bEKL负载磁珠能够作为有力的工具，在制备去除融合标签的重组蛋白过程中提供极大的便利。

[0044] 本发明下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置四次重复实验，结果取平均值。

[0045] 实验材料来源：

[0046] 本发明所使用的pET-28a载体为Novagen公司产品、pcDNA3.1为Invitrogen公司产品、pEGFP-C1载体为Clontech公司产品。人IL2基因(NCBI注册码：NM_000586)ORF全长cDNA购自北京义翘神州生物技术有限公司。HEK293-F细胞系购自Thermo Fisher公司。IL2依赖的小鼠T细胞CTLL-2细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。用于HEK293-F细胞培养的无血清哺乳动物细胞培养基及Sinofection转染试剂购自北京义翘神州生物技术有限公司。BamHI、NcoI、NheI、XhoI限制性核酸内切酶为美国NEB公司产品。HS DNA聚合酶、T4DNA连接酶为TAKARA公司产品。质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。兔抗人Fc(IgG1)抗体购自Sigma-Aldrich公司，近红外荧光标记抗的兔二抗购自LI-COR公司，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素购自碧云天生物技术公司，ECL发光液购自Millipore公司。BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo Fisher公司。链霉亲合素磁珠购自海狸纳米科技(苏州)有限公司。IL2重组蛋白购自eBioscience公司和PeproTech公司。CCK-8细胞增殖检测试剂购自日本同仁化学研究所。
引物合成及基因合成技术服务由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。

[0047] 实施例1 bEKL负载磁珠的制备

[0048] 1、肠激酶原核表达载体的构建

[0049] (1)Avi·tag氨基酸序列为GLNDIFEAQKIEWHE；bEKL氨基酸序列检索自UniProt数据库，登录号为Q6B4R4。按照大肠杆菌常用密码子对上述两段序列进行反向编译后拼接，并在核酸序列的5’端加入NcoI酶切位点、3’端加入XhoI酶切位点，得到Avi·tag与bEKL融合表达的基因序列，详见序列如SEQ ID NO.1所示。该基因序列由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

[0050] (2)以限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切pET-28a质粒和步骤(1)获得的DNA片段，分别回收约5.2Kb和770bp的DNA片段；

[0051] (3)将步骤(2)回收的DNA片段在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a-Avi-bEKL；

[0052] (4)对重组质粒pET-28a-Avi-bEKL进行测序。测序结果表明，融合有Avi·tag的肠激酶编码基因成功插入了pET-28a质粒。重组质粒pET-28a-Avi-bEKL的结构示意图参见图2。

[0053] 2、诱导表达生物素修饰的bEKL

[0054] (1)将重组质粒pET-28a-Avi-bEKL转化入大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)中；

[0055] (2)挑取转化阳性菌落于5mL氨苄青霉素抗性的LB培养液中，220rpm37℃过夜摇菌，制备种子液；

[0056] (3)吸取2mL种子液转接到200mL氨苄青霉素抗性的LB培养液中，220rpm 37℃摇菌至OD600达到0.6～0.8；

[0057] (4)培养瓶中加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG和0.05mmol/L的D-Biotin，220rpm 37℃继续培养4小时；

[0058] (5)菌液以6000×g离心10min，收集菌体，记录菌体重量。

[0059] 3、包涵体制备及复性

[0060] (1)以1g菌体加入10mL裂菌缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.0)的比例，重悬菌体；

[0061] (2)菌体悬液置冰上，以超声裂解仪破碎细菌。超声裂解参数为：直径6mm振幅杆，30％功率，开3秒/停3秒，超声裂解时间20分钟；

[0062] (3)菌体裂解液以13400×g离心10min，收集包涵体沉淀；

[0063] (4)以10ml包涵体洗涤液I(50mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，2％TritonX-100，pH7.0)重悬包涵体，13400×g离心10min，收集包涵体沉淀；

[0064] (5)以10ml包涵体洗涤液II(50mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，pH7.0)重悬包涵体，13400×g离心10min，收集包涵体沉淀，记录包涵体重量；

[0065] (6)以1g包涵体加入20mL变性液I(7.5mol/L GuHCl，50mmol/L Tris-HCl，100mmol/Lβ-巯基乙醇，pH9.0)的比例重悬，溶解包涵体；

[0066] (7)以浓盐酸调整包涵体变性液pH值至4.0，而后置于柠檬酸缓冲溶液(5mmol/L柠檬酸，pH4.0)透析过夜；

[0067] (8)透析完毕后，13400×g离心10min，收集析出蛋白，记录重量；

[0068] (9)以1g析出蛋白加入10mL变性液II(7.5mol/L GuHCl，50mmol/L Tris-HCl，pH4.0)的比例重悬，室温作用6小时，溶解析出蛋白；

[0069] (10)以1：100(V/V)比例将析出蛋白变性液逐滴缓慢加入复性液中(0.5mol/L arginine-HCl，50mmol/L Tris-HCl，20mmol/L CaCl2，5mmol/L cystine-HCl，0.5mmol/L cystine，pH8.3)，4℃复性24小时；

[0070] (11)将复性液超滤浓缩20倍后，透析至肠激酶贮存缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，pH7.5)；

[0071] (12)透析完毕后，13400×g离心10min去除析出沉淀，上清液即为生物素修饰的肠激酶，应用BCA蛋白定量试剂盒测定其蛋白浓度。

[0072] 4、以链霉亲合素磁珠负载生物素修饰的肠激酶

[0073] (1)吸取100μL链霉亲合素磁珠(海狸纳米科技(苏州)有限公司，货号22305-10)至EP管中，加入1mL肠激酶贮存缓冲液，充分振荡重悬磁珠，磁性分离5分钟，吸弃上清；重复洗涤磁珠三次；

[0074] (2)向磁珠中加入1mL生物素修饰的肠激酶溶液，充分混匀磁珠。将离心管置旋转混合仪，室温孵育1小时，使生物素修饰的肠激酶负载于链霉亲合素磁珠；

[0075] (3)负载完毕后，磁性分离5分钟，吸弃上清；以1mL肠激酶贮存缓冲液，充分振荡重悬磁珠。磁性分离5分钟，吸弃上清；重复洗涤磁珠三次；

[0076] (4)以100μL肠激酶贮存缓冲液重悬磁珠，完成bEKL负载磁珠的制备。bEKL负载磁珠的结构示意图参见图1。

[0077] 5、SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色及bEKL生物素修饰情况检测

[0078] (1)考马斯亮蓝染色：检测样品中加入5×还原型上样缓冲液，制备电泳样品，进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，将凝胶浸入考马斯亮蓝染液中染色2小时；随后，以脱色液浸泡，脱色过夜，凝胶成像仪采集实验结果。

[0079] (2)采用如下方法检测bEKL生物素修饰情况：蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后，采用湿转法，100V恒压转膜1.5小时；以3％牛血清白蛋白溶液室温封闭30分钟；以1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素室温孵育1小时；TBST缓冲液洗膜3次后，使用ECL发光液曝光成像。

[0080] (3)对bEKL原核表达及磁珠负载过程中蛋白样品进行电泳考马斯亮蓝染色和生物素修饰情况检测结果显示：

[0081] a.IPTG诱导后，bEKL能够在大肠杆菌大量表达，主要形成包涵体存在于裂菌后沉淀样品中(参见图3中A图)；

[0082] b.表达产生的bEKL能够被生物素分子修饰(参见图3中B图)；

[0083] c.包涵体蛋白经过复性后得到了纯度为85％以上的生物素修饰的bEKL可溶蛋白，能够用于磁珠负载(参见图3中图C)；

[0084] d.相比磁珠负载前蛋白样品，负载后样品中bEKL蛋白显著减少，表明bEKL蛋白已成功负载至链霉亲和素磁珠(参见图3中图C，图D)。

[0085] 图3中，bEKL原核表达及磁珠负载前后bEKL蛋白检测。图A，考马斯亮蓝染色方法检测bEKL原核表达情况；图B，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素检测bEKL原核表达及bEKL生物素修饰情况；图中M，Marker；1，未诱导全菌样品；2，诱导后全菌样品；3，超声裂菌后上清样品；4，超声裂菌后上沉淀样品。图C，考马斯亮蓝染色方法检测磁珠负载前后bEKL蛋白变化情况；图D，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素检测磁珠负载前后bEKL蛋白变化情况；图中，M，Marker；1，磁珠负载前bEKL蛋白样品；2，磁珠负载后bEKL蛋白样品。

[0086] 实施例2 应用bEKL负载磁珠切割Fc-EGFP融合蛋白

[0087] 1、重组质粒pcDNA3.1-Fc-EGFP的构建

[0088] (1)由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成编码人IgG重链分泌信号肽-Fc(人IgG1)蛋白的基因片段，全长729bp，具体序列如SEQ ID NO.2所示。该基因片段的5’端含有NheI酶切位点、3’端含有XhoI酶切位点。

[0089] (2)编码含有肠激酶酶切位点的EGFP基因片段是以pEGFP-C1质粒为模板，使用P1和P2组成的引物对(序列见表1)，在 HS DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，电泳回收获得的含有肠激酶酶切位点的EGFP基因片段全长753bp，具体序列如SEQ ID NO.3所示。该片段的5’和3’端分别含有XhoI和BamHI酶切位点。

[0090] (3)以限制性内切酶NheI和BamHI双酶切pcDNA3.1(-)质粒，以限制性内切酶NheI和XhoI双酶切步骤(1)获得的DNA片段，以限制性内切酶XhoI和BamHI双酶切步骤(2)获得的DNA片段，分别回收约5.4Kb、720bp和750bp的DNA片段。

[0091] (4)将步骤(3)回收的DNA片段在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pcDNA-Fc-EGFP。

[0092] (5)将重组质粒pcDNA-Fc-EGFP进行测序。测序结果表明编码人IgG重链分泌信号肽-Fc(人IgG1)-肠激酶酶切位点-EGFP融合蛋白的基因片段成功插入pcDNA3.1(-)质粒。重组质粒pcDNA-Fc-EGFP的结构示意图见图4。

[0093] 表1引物序列

[0094]引物名称 引物序列(5’至3’方向)
P1 aaactcgaggacgacgacgacaagatggtgagcaagggcgaggagctg
P2 gcgggatccttacttgtacagctcgtccatgccg
P3 ggactcgaggacgacgacgacaaggcacctacttcaagttctacaaag
P4 gcgggatcctcaagtcagtgttgagatgatgc

[0095] 2、Fc-EGFP融合蛋白的表达

[0096] (1)以无血清哺乳动物细胞培养基(SMM 293-TIS)悬浮培养HEK293-F细胞，培养条件为37℃，CO2浓度8％，摇床转速120转/分钟，细胞培养摇瓶规格为125mL，装液体积30mL；

[0097] (2)待细胞密度扩增至1×106/mL时，进行转染操作；

[0098] (3)配制转染混合液：吸取15μg重组质粒pcDNA-Fc-EGFP，与1.5mL150mmol/L NaCl溶液混匀，室温静置5分钟；再向混合液中加入75μL Sinofection转染试剂，混匀后室温静置20分钟；

[0099] (4)将步骤(3)配制的转染混合液逐滴加入细胞培养瓶中，充分混匀；

[0100] (5)继续培养7天后，1000转/分钟离心，沉淀细胞，培养上清使用45μm滤器过滤后进行蛋白纯化。

[0101] 3、应用proteinA亲和层析方法纯化Fc-EGFP融合蛋白

[0102] (1)取0.5mL proteinA亲和层析填料，使用5mL平衡缓冲溶液(50mmol/L硼酸，4.0mmol/L NaCl，pH 9.0)预平衡；

[0103] (2)吸取20mL含有Fc-EGFP融合蛋白的培养上清，加入4.64g NaCl，至NaCl终浓度为4mol/L；测定溶液酸碱度，调节pH至9.0；12000rpm离心10分钟，收集上清；

[0104] (3)将步骤(2)获得的上清溶液与步骤(1)平衡后的proteinA亲和层析填料混合；以0.5mL/min流速，收集流穿样品；使用10mL平衡缓冲溶液洗涤层析填料；使用2.5mL洗脱缓冲溶液(50mmol/L磷酸三钠，50mmol/L柠檬酸钠，4.0mmol/L NaCl，pH 3.0)洗脱Fc-EGFP融合蛋白，洗脱得到的蛋白样品立即加入0.3mL 1.5mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH8.8)调解酸碱度至中性；

[0105] (4)将制备的Fc-EGFP融合蛋白溶液过夜透析至肠激酶贮存缓冲液；

[0106] (5)采用BCA蛋白定量试剂盒对Fc-EGFP融合蛋白样品进行浓度测定，应用截留分子量10kDa Amicon Ultra-4超滤管(Millipore)超滤浓缩样品至蛋白浓度为0.5mg/mL。

[0107] 4、bEKL负载磁珠切割Fc-EGFP融合蛋白

[0108] (1)在1.5mL离心管中加入100μL Fc-EGFP融合蛋白，按照表2吸取实施例1步骤4获得的bEKL负载磁珠与Fc-EGFP融合蛋白混合；

[0109] 表2 bEKL负载磁珠切割Fc-EGFP融合蛋白

[0110]EK磁珠(μL) 0 1 2 5 10 15 20
Fc-EGFP(μL) 100 100 100 100 100 100 100

[0111] (2)将离心管置于旋转混合仪，低速旋转，室温作用16小时；

[0112] (3)酶切反应结束后，磁性分离5分钟，将bEKL负载磁珠从酶切体系中分离；

[0113] (4)磁性分离回收得到的bEKL负载磁珠，以1mL肠激酶贮存缓冲液充分振荡重悬；磁性分离5分钟，吸弃上清；重复洗涤三次后，以肠激酶贮存缓冲液重悬磁珠，4℃保存。

[0114] (5)酶切后样品进行SDS-PAGE电泳，用于Western Blot检测；Western Blot检测使用一抗为1:2500稀释的兔抗人Fc(IgG1)抗体，其余步骤同实施例1步骤5的(2)；应用Quantity One软件对Western Blot结果进行灰度扫描，分析Fc-EGFP融合蛋白被bEKL负载磁珠切割的效率；

[0115] (6)结果参见图5，可以看出，bEKL负载磁珠能够高效切割Fc-EGFP融合蛋白，加入1μL磁珠即可完成对60％以上融合蛋白的酶切反应；10μL bEKL负载磁珠可以在16小时内，将50μg的Fc-EGFP融合蛋白完全切开。

[0116] 5、bEKL负载磁珠反复使用稳定性实验

[0117] (1)分别吸取10μL实施例1步骤4获得的bEKL负载磁珠和100μL实施例2步骤3获得的Fc-EGFP融合蛋白至1.5mL离心管中，置于旋转混合仪，低速旋转，室温作用16小时；

[0118] (2)酶切反应结束后，磁性分离5分钟，将bEKL负载磁珠从酶切体系中分离；

[0119] (3)酶切后的样品用于制备蛋白电泳样品；磁性分离回收得到的bEKL负载磁珠，以1mL肠激酶贮存缓冲液充分振荡重悬；磁性分离5分钟，吸弃上清；重复洗涤三次；

[0120] (4)重复步骤(1)至步骤(3)，使用回收得到的bEKL负载磁珠反复酶切Fc-EGFP融合蛋白5次。依照步骤4的(5)方法，对酶切后上清液样品进行Western Blot检测，灰度扫描计算Fc-EGFP融合蛋白切割比例，分析bEKL负载磁珠在反复使用过程中的稳定性。

[0121] (5)图6结果显示，反复应用同一批磁珠对Fc-EGFP融合蛋白进行5次酶切反应，均能够将底物蛋白完全切开，表明生物素修饰的肠激酶与链霉亲合素磁珠之间结合稳固，bEKL负载磁珠在反复使用过程中未发生解离，能够保持稳定的酶切活力，具备反复使用的能力。

[0122] 实施例3 应用bEKL负载磁珠制备无标签IL2

[0123] 1、重组质粒pcDNA3.1-Fc-IL2的构建

[0124] (1)编码含有肠激酶酶切位点的IL2基因片段是以人IL-2基因ORF全长cDNA为模板，使用P3和P4组成的引物对(序列见表1)，在 HS DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，电泳回收获得的含有肠激酶酶切位点的IL2基因片段全长约435bp，序列如SEQ ID NO.4所示。该片段的5’和3’端分别含有XhoI和BamHI酶切位点。

[0125] (2)以限制性内切酶XhoI和BamHI双酶切实施例2步骤1构建的pcDNA3.1-Fc-EGFP重组质粒以及步骤(1)获得的DNA片段，分别回收约6.1Kb和430bp的DNA片段。

[0126] (3)将步骤(2)回收的DNA片段在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pcDNA3.1-Fc-IL2。

[0127] (4)将上述重组质粒进行测序。

[0128] 测序结果表明，编码人IL2的基因片段成功替换EGFP基因片段，pcDNA3.1-Fc-IL2质粒构建成功，结构示意图见图4。

[0129] 2、Fc-IL2融合蛋白的表达

[0130] 蛋白表达步骤同实施例2步骤2。

[0131] 3、应用proteinA亲和层析方法纯化Fc-IL2融合蛋白

[0132] 蛋白纯化步骤同实施例2步骤3。

[0133] 4、bEKL负载磁珠切割Fc-IL2融合蛋白及IL2蛋白纯化

[0134] (1)分别吸取100μL实施例1步骤4获得的bEKL负载磁珠和1mL实施例3步骤3获得的Fc-IL2融合蛋白至1.5mL离心管中，置于旋转混合仪，低速旋转，室温作用16小时；

[0135] (2)酶切反应结束后，磁性分离5分钟，将bEKL负载磁珠从酶切体系中分离；

[0136] (3)磁性分离回收得到的bEKL负载磁珠，以1mL肠激酶贮存缓冲液充分振荡重悬；磁性分离5分钟，吸弃上清；重复洗涤三次后，以肠激酶贮存缓冲液重悬磁珠，4℃保存。

[0137] (4)计算酶切后样品体积，加入NaCl粉末，至NaCl终浓度为4mol/L；

[0138] (5)将上述样品与经平衡缓冲溶液预平衡的proteinA亲和层析填料混合；以0.5mL/min流速，收集流穿样品；流穿样品即为不含融合标签的IL2蛋白；

[0139] (6)将流穿样品过夜透析至D-PBS缓冲液(2.67mmol/L KCl，1.47mmol/L KH2PO4，137.93mmol/L NaCl，8.06mmol/L Na2HPO4，pH7.4)；采用BCA蛋白定量试剂盒对IL2蛋白样品进行浓度测定，应用截留分子量3kDa Amicon Ultra-4超滤管(Millipore)超滤浓缩样品至蛋白浓度为0.5mg/mL。

[0140] (7)对Fc-IL2融合蛋白表达、纯化、酶切及IL2蛋白纯化过程中样品进行SDS-PAGE电泳并考马斯亮蓝染色，结果如图7所示。使用ProteinA填料进行一步法亲和层析，能够对Fc-IL2融合蛋白进行有效纯化，Fc-IL2融合蛋白在洗脱样品中的比例大于85％；融合蛋白与bEKL负载磁珠共孵育后，Fc-IL2融合蛋白电泳条带几乎消失，出现了两条与Fc片段和IL2分子量大小相符的新生条带，提示Fc-IL2融合蛋白其被有效切割；酶切后样品再次与ProteinA填料混合，酶切产生的Fc片段能够与层析填料结合，切除了Fc标签的IL2不再与ProteinA填料结合，亲和层析流穿样品即为不含融合标签的IL2蛋白；流穿样品中无标签IL2比例为90％以上，且未见肠激酶电泳条带。上述结果表明，bEKL负载磁珠不仅能够有效切割融合蛋白，并且肠激酶与磁珠之间能够稳定的结合，不会在酶切反应过程中脱落，通过简单的磁性分离即可将bEKL负载磁珠去除，简化了纯化工艺，减小了目的蛋白的损失。

[0141] 5、CTLL-2细胞增殖实验验证IL2蛋白活性

[0142] (1)CTLL-2细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，以完全培养液(RPMI-1640+10％胎牛血清+2ng/mL重组人IL2)传代培养；

[0143] (2)以无血清RPMI-1640洗涤对数生长期的CTLL-2细胞三次；按照1×105个/孔的密度接种至96孔板中，每孔加入200μL IL2缺陷培养液(RPMI-1640+10％胎牛血清)；

[0144] (3)向孔板中加入步骤4制备的IL2样品、eBioscience公司或PeproTech公司生产的IL2制品，至终浓度为0.5ng/mL，以不添加IL2作为对照组，每组设置4个复孔，5％CO2 37℃培养箱孵育过夜；

[0145] (4)加入CCK-8检测试剂20μL/孔，5％CO2 37℃培养箱孵育4小时，使用酶标仪检测吸光值，检测波长为450nm。

[0146] (5)结果分析

[0147] 计算各组样品的吸光值均值和方差，均值越大表示CTLL-2细胞增殖越快。应用SPSS软件以单因素方差分析法比较各组之间是否具有显著性差异。结果如图8所示，按照本实施例获得的IL2样品与eBioscience公司和PeproTech公司出品的IL2相对于未加入IL2的对照组，均能够显著促进CTLL-2细胞的增殖。在添加浓度相同的情况下，本实施例获得的IL2样品在450nm处吸光值与商品化IL2制品相当甚至略高，表明按照本实施例获得的IL2具有与商品化IL2相似的生物活性。

[0148] 综合步骤4蛋白电泳结果提示，应用本发明提供的bEKL负载磁珠制备的IL2蛋白，不仅成功去除了融合标签，且具有较强的生物学活力。