转基因甘蔗白糖DNA的富集方法及转基因甘蔗白糖的鉴定方法

摘要

本发明涉及一种转基因甘蔗白糖DNA的富集方法及转基因甘蔗白糖的鉴定方法。本发明通过2‑3次简单的水溶解‑氯仿抽提‑异丙醇沉淀并实现残留DNA富集的过程，同时达到彻底去除糖分的目的，再通过DNA纯化或提取试剂盒进一步进行纯化并去除短片段DNA碎片，操作简单，成本低，能稳定的从甘蔗白糖中提取到高质量的DNA模板用于RT‑PCR检测。同时针对白糖中所残留DNA降解严重，片段短的特点，设计了一系列扩增短片段的内源和外源基因的引物，筛选到了扩增效果极佳的特异性引物，进行检测，能稳定灵敏的辨别转基因甘蔗白糖与非转基因甘蔗白糖。

权利要求

1.一种富集甘蔗白糖DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，取白糖；

S2，加入ddH2O，溶解；

S3，加入体积比为24︰1的氯仿/异戊醇混合溶液，摇晃震荡均匀后，离心，取上清液，ddH2O和氯仿/异戊醇混合溶液的体积比为1︰0.8-1.2；

S4，加入0.05-0.2体积的3M的NaAc；

S5，加入0.8-1.2体积的异丙醇，-15℃以下沉淀30-60min，离心，取沉淀；

S6，重复2～3次步骤S2～S5；

S7，沉淀用65～85％的乙醇洗涤，干燥即得。

2.一种转基因甘蔗白糖的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取待测甘蔗白糖，按照权利要求1方法富集甘蔗白糖DNA，(2)纯化步骤(1)得到的DNA，去除短片段；

(3)设计内源基因引物组和外源基因引物组，进行RT-PCR检测，其中，所述内源基因引物组为扩增甘蔗内源基因ShSAP1的引物对，该引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：1所示，反向引物的序列如SEQIDNO：2所示；所述外源基因引物组为扩增甘蔗外源基因CP4-EPSPS的引物对、和/或扩增甘蔗外源基因Cry1Ab的引物对、和/或扩增甘蔗外源基因Vip3Aa的引物对，其中，扩增甘蔗外源基因CP4-EPSPS的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：3所示，反向引物的序列如SEQIDNO：4所示；

扩增甘蔗外源基因Cry1Ab的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：5所示，反向引物的序列如SEQIDNO：6所示；

扩增甘蔗外源基因Vip3Aa的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：7所示，反向引物的序列如SEQIDNO：8所示。

3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，RT-PCR检测为：根据内源基因引物组扩增的Ct值，扩增曲线，溶解曲线，判断是否从白糖中提取出了可供RT-PCR检测的DNA；再根据外源基因引物组的扩增曲线Ct大小，溶解曲线是否与阳性对照一致，判断是否为转基因甘蔗白糖；其中，在检测过程中均须设置阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，引物的退火温度在58-62℃，扩增片段为80-120bp。

说明书

转基因甘蔗白糖DNA的富集方法及转基因甘蔗白糖的鉴定

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种转基因甘蔗白糖DNA的富集方法及转基因甘蔗白糖的鉴定方法。

背景技术

[0002] 甘蔗是世界上最为重要的糖料作物，盛产于热带和亚热带。同时甘蔗又是一种生物能源作物，2012年4月至2013年3月，巴西甘蔗产量达5.6亿吨，其中一半以上用于生产乙醇，是世界第二大乙醇生产国，该国近半数汽车使用乙醇汽油。随着石油短缺的加剧，生物能源将被进一步得到重视，像甘蔗这种高光效，高生物量的生物能源作物也将提升它的地位，对甘蔗品种的遗传改良也将随之受到重视。然而由于甘蔗本身复杂的遗传背景因素，及其开花特性等因素使得通过传统的育种方式对其进行遗传改良比起其他作物困难。基因工程转基因技术成了甘蔗品种遗传改良的重要途径。

[0003] 目前国内外通过基因工程转基因技术成功对甘蔗品种进行遗传改良的案例很多，获得了一些提高糖含量、提高抗逆性及改变株型的新品种。但这些新品种并未获批准进行开放性生产，因此也未有转基因甘蔗被允许用来生产蔗糖并进入食品市场。然而随着人们对转基因作物认识的不断深入，特别是甘蔗用于生产乙醇的比例加大，那么转基因的优良甘蔗新品种将很快被允许用于大田生产。那么一旦转基因甘蔗被允许用于大田生产，随之而来的就是备受人们瞩目的食品安全问题。白糖主要源于甘蔗白糖，因此当转基因甘蔗被允许用于大田生产后，就有必须有一种技术来鉴定白糖是否来源于转基因甘蔗。因此就有必要建立起一种稳定灵敏的技术方法，来辨别白糖是否为转基因甘蔗白糖。

[0004] 甘蔗白糖是甘蔗经切断粉碎、榨汁过滤、高温蒸馏、结晶分离等过程形成的。特别是高温蒸馏与结晶分离使得甘蔗白糖中核酸含量极低、降解严重。因此必须提高甘蔗白糖DNA提取效率与质量，并采用灵敏度较高的DNA检测技术。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，为转基因甘蔗白糖DNA的提取与检测提供一种稳定有效的方法。

[0006] 本发明的第一个方面是提供一种一种富集甘蔗白糖DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0007] S1，取白糖；

[0008] S2，加入ddH2O，溶解；

[0009] S3，加入体积比为24︰1的氯仿/异戊醇混合溶液，摇晃震荡均匀后，离心，取上清液；

[0010] S4，加入0.05-0.2体积的3M的NaAc；

[0011] S5，加入0.8-1.2体积的异丙醇，-15℃以下沉淀30-60min，离心，取沉淀；

[0012] S6，重复2～3次步骤S2～S5；

[0013] S7，沉淀用65～85％的乙醇洗涤，干燥即得。

[0014] 优选地，ddH2O和氯仿/异戊醇混合溶液的体积比为1︰0.8-1.2。

[0015] 本发明的第二个方面是提供一种转基因甘蔗白糖的鉴定方法，包括以下步骤：

[0016] (1)取待测甘蔗白糖，按照本发明第一个方面所述的方法富集甘蔗白糖DNA，[0017] (2)纯化步骤(1)得到的DNA，去除短片段；

[0018] (3)设计内源基因引物组和外源基因引物组，进行RT-PCR检测。

[0019] 其中，步骤(2)中纯化方法可以通过PCR反应、酶促反应、测序反应等纯化试剂盒完成，也可以通过植物DNA小量提取试剂盒来完成。具体方法可参照各种DNA纯化试剂盒的说明书。

[0020] 优选地，所述内源基因引物组为扩增甘蔗内源基因ShSAP1的引物对，该引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：1所示，反向引物的序列如SEQIDNO：2所示。

[0021] 优选地，所述外源基因引物组为扩增甘蔗外源基因CP4-EPSPS的引物对、和/或扩增甘蔗外源基因Cry1Ab的引物对、和/或扩增甘蔗外源基因Vip3Aa的引物对。

[0022] 进一步优选地，扩增甘蔗外源基因CP4-EPSPS的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：3所示，反向引物的序列如SEQIDNO：4所示。

[0023] 进一步优选地，扩增甘蔗外源基因Cry1Ab的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：5所示，反向引物的序列如SEQIDNO：6所示。

[0024] 进一步优选地，扩增甘蔗外源基因Vip3Aa的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：7所示，反向引物的序列如SEQIDNO：8所示。

[0025] 优选地，RT-PCR检测为：根据内源基因引物组扩增的Ct值，扩增曲线，溶解曲线，判断是否从白糖中提取出了可供RT-PCR检测的DNA；再根据外源基因引物组的扩增曲线Ct大小，溶解曲线是否与阳性对照一致，判断是否为转基因甘蔗白糖；其中，在检测过程中均须设置阳性对照和阴性对照。

[0026] 优选地，引物的退火温度在58-62℃，扩增片段为80-120bp。

[0027] 本发明的第三个方面是提供一种用于鉴定转基因甘蔗白糖的引物组合物，，所述引物组合物包括外源基因引物组和内源基因引物组，所述内源基因引物组为扩增甘蔗内源基因ShSAP1的引物对，所述外源基因引物组为扩增甘蔗外源基因CP4-EPSPS的引物对、和/或扩增甘蔗外源基因Cry1Ab的引物对、和/或扩增甘蔗外源基因Vip3Aa的引物对。

[0028] 优选地，扩增甘蔗内源基因ShSAP1的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：1所示，反向引物的序列如SEQIDNO：2所示。

[0029] 优选地，扩增甘蔗外源基因CP4-EPSPS的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：3所示，反向引物的序列如SEQIDNO：4所示。

[0030] 优选地，扩增甘蔗外源基因Cry1Ab的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：5所示，反向引物的序列如SEQIDNO：6所示。

[0031] 优选地，扩增甘蔗外源基因Vip3Aa的引物对的正向引物的序列如SEQIDNO：7所示，反向引物的序列如SEQIDNO：8所示。

[0032] 本发明的第四个方面是提供一种用于鉴定转基因甘蔗白糖的试剂盒，含有本发明第三个方面所述的引物组合物。

[0033] 本发明的有益效果如下：

[0034] 本发明通过2-3次简单的水溶解-氯仿抽提-异丙醇沉淀并实现残留DNA富集的过程，同时达到彻底去除糖分的目的，再通过DNA纯化或提取试剂盒进一步进行纯化并去除短片段DNA碎片，操作简单，成本低，能稳定的从甘蔗白糖中提取到高质量的DNA模板用于RT-PCR检测。同时针对白糖中所残留DNA降解严重，片段短的特点，设计了一系列扩增短片段的内源和外源基因的引物，筛选到了扩增效果极佳的特异性引物，进行检测，能稳定灵敏的辨别转基因甘蔗白糖与非转基因甘蔗白糖。

附图说明

[0035] 图1为转基因白糖的照片。

[0036] 图2为甘蔗叶片组织DNA内源基因RT-PCR检测结果。

[0037] 图3为转基因甘蔗白糖内源基因ShSAP1的RT-PCR检测扩增曲线。

[0038] 图4为转基因甘蔗白糖内源基因ShSAP1的RT-PCR检测溶解曲线。

[0039] 图5为转基因甘蔗白糖外源基因Cry1Ab的RT-PCR检测扩增曲线。

[0040] 图6为转基因甘蔗白糖外源基因Cry1Ab的RT-PCR检测溶解曲线。

[0041] 图7为转基因甘蔗白糖外源基因EPSPS的RT-PCR检测扩增曲线。

[0042] 图8为转基因甘蔗白糖外源基因EPSPS的RT-PCR检测溶解曲线。

[0043] 图9为转基因甘蔗白糖外源基因Vip3Aa的RT-PCR检测扩增曲线。

[0044] 图10为转基因甘蔗白糖外源基因Vip3Aa的RT-PCR检测溶解曲线。

具体实施方式

[0045] 下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进步一步的说明，以更好地理解本发明。

[0046] 一、实验材料：

[0047] 转基因甘蔗白糖(图1)，原料甘蔗来源于研究室前期的研究中所获得的转基因甘蔗，并由云南开远甘蔗研究所模拟糖厂白糖生产过程小批量加工成白糖，原料甘蔗含外源基因：抗除草剂基因EPSPS，抗螟虫基因Cry1Ab和抗螟虫基因Vip3Aa，品种为ROC22。

[0048] 二、引物筛选

[0049] 1、ShSAP1内源基因荧光定量PCR检测引物筛选

[0050] 针对甘蔗的内源基因ShSAP1基因设计多对扩增片段在100bp左右的引物。按照常规的CTAB法提取转基因甘蔗叶片的基因组DNA，初始浓度为0.2μg/μl，并进行50倍，100倍，200倍的梯度稀释，然后向各个稀释液中加入各ShSAP1引物进行扩增。扩增后，分析扩增曲线，溶解曲线，筛选到扩增效果最好的ShSAP1内源基因荧光定量PCR检测的引物一对，引物为：

[0051] ShSAP-F:TTCGACTATCGGACTGCTGC

[0052] ShSAP-R:TGAGCCAACCGTAGGAAACC

[0053] 以同样的方式获得其他外源基因Cry1Ab、EPSPS和Vip3Aa的扩增效果最好的引物对，分别为：

[0054] 外源基因Cry1Ab：

[0055] Cry1Ab-F:ATCACCATCTACACCGACGC

[0056] Cry1Ab-R:CGTACAGGGGGAAGGTGAAC

[0057] 外源基因EPSPS：

[0058] EPSPS-F:GGATCACAGGATCGCCATGT

[0059] EPSPS-R:GGTCCATGAACTCGGGGAAG

[0060] 外源基因Vip3Aa：

[0061] Vip3Aa-F:GATCGGCTTCGAGATCAGCA

[0062] Vip3Aa-R:ATCACCTCGCTCAAGCTGTC

[0063] 三、提取转基因甘蔗白糖DNA

[0064] 称取转基因甘蔗白糖10g，于50ml的离心管中，加入20ml的ddH2O，温浴并使白糖充分溶解，再加20ml的氯仿/异戊醇(24:1)，摇晃震荡均匀后，12000rpm离心10min。收取上清液，加1/10体积的3M的NaAc溶液，加入等体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀30-60min，12000rpm离心10min。倒掉上清液，三管合并，共同溶解于20ml的ddH2O，温浴并使沉淀充分溶解，加1/10体积的3M的NaAc溶液，加入等体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀30-60min，12000rpm离心
10min。沉淀用75％的乙醇洗涤一次后吹干，溶解于100ul的ddH2O或TE中，此即为转基因甘蔗白糖DNA。

[0065] 四、转基因甘蔗白糖DNA纯化

[0066] 按照AxyGen生物技术(杭州)有限公司提供的AxyPrep PCR清洁试剂盒(回收片段>75bp)操作步骤进行：

[0067] 在前一步提取的白糖DNA溶解液中，加入3倍反应液体积的Buffer PCR-A，混匀后，转移至制备管中，将制备管置于2ml的离心管中，离心，弃滤液。

[0068] 将制备管置回2ml离心管中，加700ul Buffer W2，洗涤两次。最后不加BufferW2，离心一次。

[0069] 制备管风干之后置于1.5ml的离心管中，在制备管中央加30-50ul的去离子H2O，室温静置1min，离心洗脱DNA。

[0070] 得到的洗脱液即为纯化好的转基因甘蔗白糖DNA。

[0071] 五、转基因甘蔗白糖内源基因检测

[0072] 以甘蔗叶片组织DNA(浓度梯度为100ng/ul、10ng/ul、1ng/ul、0.1ng/ul、0.01ng/ul)为正对照，同时以待检测的转基因甘蔗白糖DNA为模板，加入甘蔗内源基因引物[0073] ShSAP-2F:TTCGACTATCGGACTGCTGC；

[0074] ShSAP-2R:TGAGCCAACCGTAGGAAACC，

[0075] 进行RT-PCR检测。每个反应重复2-3次，扩增体系如下：

[0076]物质 体积 最终浓度
DNA模板 3.0ul 按需
正向引物(10uM) 0.2ul 0.2uM
反向引物(10uM) 0.2ul 0.2uM
qPCR Mix 5.0ul 1*
惰性参比染料 0.2ul 1*
ddH2O 1.4ul -
总体积 10ul -

[0077]

[0078] 最后进行分离。

[0079] 根据内源基因引物扩增后白糖DNA以及正对照的Ct值，扩增曲线，以及溶解曲线，判断是否从白糖中提取出了可供RT-PCR检测的DNA。

[0080] 甘蔗叶片组织DNA内源基因检测结果如图2所示，甘蔗叶片组织DNA浓度在：100ng/ul、10ng/ul、1ng/ul、0.1ng/ul、0.01ng/ul时，RT-PCR检测的Ct值均值分别为：21.55、23.93、27.57、31.59、35.43。

[0081] 转基因甘蔗白糖DNA内源基因检测结果如图3(扩增曲线)和图4(溶解曲线)所示。转基因甘蔗白糖的RT-PCR检测的Ct值均值为32.65，且与阳性对照的溶解曲线一致。说明已经成功的从转基因甘蔗白糖中提取到了可用于RT-PCR检测的DNA。与甘蔗叶片组织DNA的不同浓度梯度的扩增Ct做相对比较，所提取的转基因甘蔗白糖模板量介于0.1ng/ul到
0.01ng/ul之间，可继续用于外源基因的检测。

[0082] 六、转基因甘蔗白糖外源基因Cry1Ab检测

[0083] 以所提取的转基因甘蔗白糖的DNA为检测模板(GM-白糖)，以转基因甘蔗叶片组织DNA为阳性对照(CK+)，以非转基因甘蔗白糖DNA为阴性对照(CK-)，加入外源基因Cry1Ab的引物：

[0084] Cry1Ab-F:ATCACCATCTACACCGACGC；

[0085] Cry1Ab-R:CGTACAGGGGGAAGGTGAAC，

[0086] 进行RT-PCR检测。结果如图5(扩增曲线)和图6(溶解曲线)，Ct值均值为32.47，与阳性对照有相同的溶解曲线，且CK-没有Ct值，说明通过RT-PCR从转基因甘蔗白糖中检测到了外源基因Cry1Ab。

[0087] 七、转基因甘蔗白糖外源基因EPSPS检测

[0088] 以所提取的转基因甘蔗白糖的DNA为检测模板(GM-白糖)，以转基因甘蔗叶片组织DNA为阳性对照(CK+)，以非转基因甘蔗白糖DNA为阴性对照(CK-)，加入外源基因EPSPS的引物：

[0089] EPSPS-F:GGATCACAGGATCGCCATGT；

[0090] EPSPS-R:GGTCCATGAACTCGGGGAAG，

[0091] 进行RT-PCR检测。结果如图7(扩增曲线)和图8(溶解曲线)，Ct值均值为30.31，与阳性对照有相同的溶解曲线，且CK-没有Ct值，说明通过RT-PCR从转基因甘蔗白糖中检测到了外源基因EPSPS。

[0092] 八、转基因甘蔗白糖外源基因Vip3Aa检测

[0093] 以所提取的转基因甘蔗白糖的DNA为检测模板(GM-白糖)，以转基因甘蔗叶片组织DNA为阳性对照(CK+)，以非转基因甘蔗白糖DNA为阴性对照(CK-)，加入外源基因Vip3Aa的引物：

[0094] Vip3Aa-F:GATCGGCTTCGAGATCAGCA；

[0095] Vip3Aa-R:ATCACCTCGCTCAAGCTGTC，

[0096] 进行RT-PCR检测。结果如图9(扩增曲线)和图10(溶解曲线)，Ct值均值为32.50，与阳性对照有相同的溶解曲线，且CK-没有Ct值，说明通过RT-PCR从转基因甘蔗白糖中检测到了外源基因Vip3Aa。

[0097] 实验结果证明：通过本发明的白糖DNA提取收集及纯化方法，能有效的从白糖中提取到可用于RT-PCR检测的DNA。并通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法结合本发明的外源基因的引物可以准确的检测到转基因甘蔗白糖所残留的外源基因，这为甘蔗白糖是否来源于转基因甘蔗的检测提供了一种有效灵敏的方法。

[0098] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。