一种栅藻的保藏方法

摘要

本发明公开了一种栅藻的保藏方法。将经过驯化的耐受养猪污水厌氧出水的二形栅藻藻种涂布于培养容器中的琼脂平板保藏培养基上，生长直至长出二形栅藻藻落，然后用封口膜将培养容器密封，倒置低温避光保存。本发明的栅藻的保藏方法，具有操作简便、成本低、不易污染和保藏效果好的特点，与常规的微藻浓缩液保藏方法相比，采用本发明的保藏方法保藏二形栅藻藻种，对养猪污水厌氧出水具有更好的净化效果，可最大限度的保持藻种的生物活性。

权利要求

1.一种栅藻(Scenedesmus)的保藏方法，其特征在于，包括以下步骤：将经过驯化的耐受养猪污水厌氧出水的二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)藻种涂布于培养容器中的琼脂平板保藏培养基上，生长直至长出栅藻藻落，然后用封口膜将培养容器密封，倒置，低温避光保存；

所述的琼脂平板保藏培养基，每升含有MgSO4·7H2O 0.05～1.0g，KNO3 1.0～1.5g，KH2PO4 0.03～0.05g，NaCl 0.02～0.05g，酒石酸钾钠0.02～0.03g，养猪污水厌氧出水20～

50mL，微量元素溶液0.5～1.0ml，琼脂30～50g，羧苄青霉素25～50mg，余量为水；

所述的微量元素溶液，每升含有AlCl3·6H2O 1.5g，MnSO4·H2O 1.0g，FeSO4·7H2O 

0.01g，CuSO4·5H2O 0.9g，ZnCl2·H2O 1.2g，余量为水，pH6.0～7.5。

2.根据权利要求1所述的栅藻的保藏方法，其特征在于，所述的经过驯化的耐受养猪污水厌氧出水的二形栅藻藻种是能够耐受养猪污水厌氧出水占体积比80～100％的栅藻藻种。

3.根据权利要求1所述的栅藻的保藏方法，其特征在于，所述的低温是1～4℃。

说明书

一种栅藻的保藏方法

技术领域：

[0001] 本发明属于微藻保藏领域，具体涉及一种栅藻的保藏方法。背景技术：

[0002] 近年来，随着国家经济的发展和国民生活水平的提高，养猪业朝着规模化和集约化的方向发展。规模化养殖能够大大缩短生长周期，降低养殖成本，从而增加经济效益。但规模化猪场导致粪尿污水集中排放，污水量大，且携带粪便较多，污染物浓度高，处理难度大，衍生了一系列的环境污染问题。目前，养猪业污水处理模式可归纳为两种：一种是以资源利用为目标的还田模式，另一种是以达标排放为目标的人工强化处理模式。中国规模化猪场一般集中在城郊，没有足够土地消纳粪污，不便于采用还田模式，多为厌氧处理和其它方法组合进行人工强化处理。污水经厌氧处理，大部分有机质得到去除，但N、P和COD等指标仍很高。如果大量未经后续处理的高浓度厌氧出水直接排放，必然对环境造成巨大危害。实现养猪废水的无害化、资源化和减量化处理是保证养猪业可持续发展的基础。养猪污水厌氧出水含有大量微藻生长所需的氮、磷以及其他营养物质，因此若能将养猪污水处理与微藻的规模化培养结合起来，既可以使污水达到低成本排放，又可以节约微藻培养的成本，同时微藻生物质中还含有很多的高附加值产物。这一研究不仅能实现养猪业污水的规模化治理，还可以创造处理污水的额外经济效益和环境效益。利用微藻处理养猪污水具有良好的发展前景与优势。但是养猪污水厌氧出水中高浓度的氨氮和较低的透明度等因素不利于微藻的生长。通常需要离心、稀释后才能用于微藻的培养，这会消耗大量的水资源并使微藻培养成本增加。获得可以耐受高浓度养猪污水厌氧出水的微藻藻株是解决这一问题的方法之一。

[0003] 单细胞藻种的保藏一直是制约生产培养单位藻种正常供应和长期保存的重要因素。通常直接采用藻种浓缩液保藏方法，周期短、易污染、保藏条件难以控制，容易造成藻种保藏失败。采用固体培养基保藏，可以通过营养成分的缓释作用，在适宜的条件下延长保藏期。但需要解决二个关键问题，一是藻液的抑菌技术，二是选择合适的固体培养基营养成分，否则接种保藏难以取得良好的效果。国内固体培养基保藏藻种的实用技术详细报道不多，大部分仅作粗略介绍。发明内容：

[0004] 本发明的目的是提供一种操作简便、成本低、不易污染和保藏效果好，可最大限度的保持微藻藻种生物活性的保藏方法。

[0005] 本发明的栅藻的保藏方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0006] 将经过驯化的耐受养猪污水厌氧出水的二形栅藻藻种涂布于培养容器中的琼脂平板保藏培养基上，生长直至长出栅藻藻落，然后用封口膜将培养容器密封，倒置，低温避光保存；

[0007] 所述的琼脂平板保藏培养基，每升含有MgSO4·7H2O 0.05～1.0g，KNO3 1.0～1.5g，KH2PO4 0.03～0.05g，NaCl 0.02～0.05g，酒石酸钾钠0.02～0.03g，养猪污水厌氧出水20～50mL(事先经8层纱布过滤去除大颗粒物质)，微量元素溶液0.5～1.0ml，琼脂30～
50g，羧苄青霉素25～50mg，余量为水。其配制方法是：将MgSO4·7H2O 0.05～1.0g，KNO3 1.0～1.5g，KH2PO4 0.03～0.05g，NaCl 0.02～0.05g，酒石酸钾钠0.02～0.03g，养猪污水厌氧出水20～50mL，微量元素溶液0.5～1.0ml，琼脂15～20g，加入到水中，然后用水定容到1L，混合均匀后，121℃高压灭菌15分钟，冷却至45℃左右时加入羧苄青霉素25～50mg，混和均匀，倾入无菌平皿中。

[0008] 所述的微量元素溶液，每升含有AlCl3·6H2O 1.5g，MnSO4·H2O 1.0g，FeSO4·7H2O 0.01g，CuSO4·5H2O 0.9g，ZnCl2·H2O 1.2g，余量为水，pH 6.0～7.5。

[0009] 所述的经过驯化的耐受养猪污水厌氧出水的二形栅藻藻种是能够耐受养猪污水厌氧出水占体积比80～100％的栅藻藻种。其可以通过不断的提高栅藻藻种的培养基含有的养猪污水厌氧出水的比例对栅藻藻种进行驯化，由此得到耐受养猪污水厌氧出水的栅藻藻种。

[0010] 所述的低温是1～8℃，更优选为1～4℃。

[0011] 所述的养猪污水厌氧出水是将养猪污水经过厌氧处理后得到的厌氧出水，其属于本领域的公知常识。

[0012] 本发明的栅藻的保藏方法，具有操作简便、成本低、不易污染和保藏效果好的特点，与常规的微藻浓缩液保藏方法相比，可最大限度的保持藻种的生物活性。具体实施方式：

[0013] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0014] 实施例1：栅藻的耐污驯化

[0015] 从真空冷冻干燥管中挑取少量二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)藻种，加入到盛有200mL生长培养基的三角瓶中，光照度4000～5000lx，全光照，120rpm，25±1℃培养。可观察到培养液颜色逐渐变绿。3～6d后至对数生长期。取对数生长期的二形栅藻藻液10mL，4500r/min离心10min，弃上清液得到藻体，藻体接种到200mL驯化培养基1(体积比，10％厌氧出水(养猪污水经厌氧处理后的厌氧出水，其各项指标为：氨氮936.2mg/L，COD 
2934.7mg/L，总磷48.97mg/L)+90％H2O)中，光照度4000～5000lx，全光照，120rpm，25±1℃培养。可观察到培养液颜色逐渐变绿。3～6d后，吸取0.5mL培养液，加入质量分数为0.8％无菌生理盐水中，得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5和10-6梯度的稀释溶液，吸取不同浓度的稀释溶液各0.2mL涂布于琼脂平板生长培养基上，培养4～7d后，挑选单个菌落，接种到驯化培养基2(体积比，20％厌氧出水(养猪污水厌氧出水)+80％H2O)中驯化。按照此方法，逐步提高驯化培养基中厌氧出水(养猪污水厌氧出水)的比例，降低H2O的比例，并同步镜检观察藻体细胞的存在，直至栅藻可以耐受浓度体积比为90％厌氧出水，继续增加驯化培养基中厌氧出水的比例，直至栅藻能够耐受100％的厌氧出水，由此得到能够耐受80％～100％的厌氧出水的栅藻藻种，即为经过驯化的耐受高浓度厌氧出水的栅藻藻种。

[0016] 生长培养基：葡萄糖1.5g，酵母粉0.2g，蛋白胨1.0g，乙酸钠0.5g，氯化钠0.2g，磷酸二氢钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，硫酸铵1.0g，微量元素母液1mL，余量为水，定容至1000mL，NaOH或HCL调节pH至6.0～7.5。分装于500mL三角瓶中。121℃高压灭菌15min。微量元素母液：FeSO4·7H2O 0.01g，CuSO4·5H2O 0.9g，ZnCl2·H2O 1.2g，AlCl3·6H2O 1.5g，MnSO4·H2O 1.0g，水1L，混合均匀后得到微量元素母液。

[0017] 琼脂平板生长培养基：葡萄糖1.5g，酵母粉0.2g，蛋白胨1.0g，乙酸钠0.5g，氯化钠0.2g，磷酸二氢钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，硫酸铵1.0g，微量元素母液1mL，余量为水，琼脂
15～20g，定容至1000mL，NaOH或HCL调节pH至6.0～7.5。分装于500mL三角瓶中。121℃高压灭菌15min。微量元素母液：FeSO4·7H2O 0.01g，CuSO4·5H2O 0.9g，ZnCl2·H2O 1.2g，AlCl3·6H2O 1.5g，MnSO4·H2O 1.0g，水1L，混合均匀后得到微量元素母液。

[0018] 实施例2栅藻的保藏方法

[0019] 挑取少量实施例1的经过驯化的耐受高浓度厌氧出水(90％的厌氧出水)的二形栅藻藻种，加入到盛有200mL生长培养基(配方同实施例1)的三角瓶中，光照度4000～5000lx，全光照，120rpm，25±1℃培养。可观察到培养液颜色逐渐变绿。3～6d后至对数生长期。吸取0.2mL处于对数生长期的微藻培养液，滴于琼脂平板保藏培养基的中间位置上，以顺时针方向均匀涂布，25±1℃，光照度4000～5000lx，全光照培养，4～7d后，可观察到平板上长有栅藻藻落，待藻体生长至布满平板约2/3表面时，用封口膜将培养皿密封，倒置于4℃冰箱，避光保存。

[0020] 琼脂平板保藏培养基：MgSO4·7H2O 0.05g，KNO3 1.5g，KH2PO4 0.03g，NaCl 0.05g，酒石酸钾钠0.02g，养猪污水厌氧出水(事先经8层纱布过滤去除大颗粒物质)50mL，微量元素溶液1.0ml，琼脂50g加入到水中，并用水定容至1000mL，121℃灭菌15～20min后，待其冷却至45℃左右时加入羧苄青霉素50mg，倒入培养皿中，每个培养皿中倒入10-15mL，冷却凝固后即成固体平板。微量元素溶液：将AlCl3·6H2O 1.5g，MnSO4·H2O 1.0g，FeSO4·7H2O 0.01g，CuSO4·5H2O 0.9g，ZnCl2·H2O 1.2g溶于1000mL水中，pH 6.0。

[0021] 实施例3本发明中栅藻的保藏方法的效果研究

[0022] 分别取等量的采用浓缩液保藏方法保藏以及采用实施例2的保藏方法保藏1个月、2个月和3个月的二形栅藻藻种，按实施例1的方法培养至对数生长期作为试验藻种。分别取
300～400mL试验藻种液，4500r/min离心10min，弃上清液得到藻体，藻体接入2L处理液(按体积百分比配制40％的养猪污水厌氧出水+60％的H2O，处理液的初始COD为1173.88mg/L，氨氮为374.48mg/L，总磷为19.59mg/L)中，同时以不添加藻体为空白对照组，均设立三个平行实验组。光照度4000～5000lx，全光照，120rpm，25±1℃培养。4～6d后取经过栅藻处理的处理液，4500r/min离心10min，取上清液，测定其中的COD、TN和TP，计算COD、TN和TP的去除率。

[0023] 采用浓缩液保藏方法保藏1个月的二形栅藻藻种,对养猪污水厌氧出水中的COD、TN和TP的降解率分别为51％、67％和65％；保藏2个月的二形栅藻藻种,对养猪污水厌氧出水中的COD、TN和TP的降解率分别为45％、53％和50％；保藏3个月的二形栅藻藻种,对养猪污水厌氧出水中的COD、TN和TP的降解率分别为40％、45％和41％。利用本发明中栅藻的保藏方法保藏1个月的二形栅藻藻种(实施例2的保藏方法)，对养猪污水厌氧出水中的COD、TN和TP的降解率分别为66％、79％和75％；保藏2个月的二形栅藻藻种，对养猪污水厌氧出水中的COD、TN和TP的降解率分别为63％、77％和72％；保藏3个月的二形栅藻藻种，对养猪污水厌氧出水中的COD、TN和TP的降解率分别为60％、73％和69％.

[0024] 上述试验结果表明，相同实验条件下，采用本发明的保藏方法保藏二形栅藻藻种，比采用浓缩液保藏方法保藏二形栅藻藻种，对养猪污水厌氧出水具有更好的净化效果。采用本发明的保藏方法保藏1个月、2个月和3个月的二形栅藻藻种，其对养猪污水厌氧出水的净化效果变化不明显，表明采用本发明的保藏方法保藏二形栅藻藻种，可最大限度的保持藻种的生物活性。

[0025] 实施例4：

[0026] 本实施例与实施例2相同，只是是挑取的耐受高浓度厌氧出水(80％的厌氧出水)的栅藻藻种。而琼脂平板保藏培养基是将MgSO4·7H2O 1g，KNO3 1.0g，KH2PO4 0.05g，NaCl 0.02g，酒石酸钾钠0.03g，养猪污水厌氧出水(事先经8层纱布过滤去除大颗粒物质)20mL，微量元素溶液0.5ml，琼脂30g加入到水中，并用水定容至1000mL，121℃灭菌15～20min后，待其冷却至45℃左右时加入羧苄青霉素25mg，倒入培养皿中，每个培养皿中倒入10-15mL，冷却凝固后即成固体平板。微量元素溶液：将AlCl3·6H2O 1.5g，MnSO4·H2O 1.0g，FeSO4·
7H2O 0.01g，CuSO4·5H2O 0.9g，ZnCl2·H2O 1.2g溶于1000mL水中，pH 7.5。保藏是在置于1℃冰箱，避光保存。

[0027] 由此得到栅藻的保藏方法保藏的栅藻。

[0028] 将保藏的栅藻按照实施例3的方法进行养猪污水厌氧出水净化效果对比实验，结果发现，相同实验条件下，采用浓缩液保藏方法保藏1个月的二形栅藻藻种,对养猪污水厌氧出水中的COD、TN和TP的降解率分别为50％、67％和66％；保藏2个月的二形栅藻藻种,对养猪污水厌氧出水中的COD、TN和TP的降解率分别为43％、50％和51％；保藏3个月的二形栅藻藻种,对养猪污水厌氧出水中的COD、TN和TP的降解率分别为41％、48％和39％。利用本发明中栅藻的保藏方法保藏1个月的二形栅藻藻种(实施例4的保藏方法)，对养猪污水厌氧出水中的COD、TN和TP的降解率分别为67％、80％和78％；保藏2个月的二形栅藻藻种，对养猪污水厌氧出水中的COD、TN和TP的降解率分别为62％、75％和73％；保藏3个月的二形栅藻藻种，对养猪污水厌氧出水中的COD、TN和TP的降解率分别为65％、76％和71％.[0029] 采用本发明的保藏方法保藏二形栅藻藻种，比采用浓缩液保藏方法保藏二形栅藻藻种，对养猪污水厌氧出水具有更好的净化效果。采用本发明的保藏方法保藏二形栅藻藻种，可最大限度保持藻种的生物活性。