线扫描、样品扫描、多模式共聚焦显微镜

摘要

提供了一种共聚焦显微镜，其包括由光学系统在安装到载物台的样品的表面上聚焦成线的一个或多个激光器。显微镜还包括与聚焦线光学共轭的至少一个线性阵列检测器。载物台允许样品相对于显微镜的保持静止的所有其他部件移动。

权利要求

1.一种共聚焦显微镜，其包括：

光源；

载物台，其适于将样品固定到其上；

多个线性阵列检测器；以及

光学系统，其包括柱面透镜和物镜，其中：

所述柱面透镜定位成接收由所述光源发射的第一光，并且在所述样品固定到所述载物台时将所述第一光以线聚焦在所述样品的选定平面上；以及所述物镜定位成与所述第一光的至所述样品上的照明路径垂直以响应于所述第一光入射到所述样品上而接收来自所述样品的第二光，并且将所述第二光聚焦在所述多个线性阵列检测器中的至少一个上，所述第二光的检测路径与所述第一光的照明路径垂直；

其中所述载物台进一步适于将所述样品定位在所述物镜的焦平面附近，并且相对于所述第一光的聚焦线移动所述样品，其中，所述光学系统还包括：

第一分束器，其被定位成将从所述样品荧光发射的第二光反射到所述多个线性阵列检测器的第一线性阵列检测器上；以及第二分束器，其被定位成将从所述样品反射的第二光反射到所述多个线性阵列检测器的第二线性阵列检测器上，其中，从所述样品荧光发射的所述第二光与所述第一线性阵列检测器之间的路径不同于从所述样品反射的所述第二光与所述第二线性阵列检测器之间的路径。

2.根据权利要求1所述的共聚焦显微镜，其中所述光源包括单个激光源。

3.根据权利要求1所述的共聚焦显微镜，其还包括光学斩波器，并且其中所述光源包括至少两个激光器，每个激光器发射不同的激光束，其中所述光学斩波器允许每个不同的激光束以不同于其他激光束的时间传递到所述样品上。

4.根据权利要求3所述的共聚焦显微镜，其还包括计时系统，所述计时系统测量所述斩波器的位置，识别所述斩波器允许第一光照射所述样品的光源，并且测量所述光源对所述样品的照射的持续时间。

5.根据权利要求4所述的共聚焦显微镜，其中所述计时系统包括运动检测器、信号灯和位于所述斩波器两侧上的时钟检测器，其中所述时钟检测器响应于所述信号灯的检测而生成时钟信号，所述时钟信号对应于所识别的光源对所述样品的照射的所述持续时间。

6.根据权利要求4所述的共聚焦显微镜，其中所述计时系统包括运动检测器和与所述光源相对定位的时钟检测器，其中所述时钟检测器响应于所识别的光源的所述照明的检测而生成时钟信号，并且其中所述时钟信号对应于所识别的光源对所述样品的照射的所述持续时间。

7.根据权利要求1所述的共聚焦显微镜，其中所述载物台相对于聚焦在所述样品上的第一光的线而物理地平移所述样品，而不移动所述第一光。

8.根据权利要求1所述的共聚焦显微镜，其中从所述样品荧光发射的所述第二光具有不同于所述第一光的波长，并且其中从所述样品反射的所述第二光具有与所述第一光近似相同的波长。

9.一种对样品进行成像的方法，其包括：

提供共聚焦显微镜，其包括：

光源；

载物台，其适于将样品固定到其上；

多个线性阵列检测器；以及

光学系统，其包括柱面透镜和物镜，其中：

所述柱面透镜定位成接收由所述光源发射的第一光，并且在所述样品固定到所述载物台时将所述第一光以线聚焦在所述样品的选定平面上；以及所述物镜定位成与入射到所述样品的所述第一光垂直以响应于所述第一光入射到所述样品上而接收来自所述样品的第二光，并且将所述第二光聚焦在所述多个线性阵列检测器中的至少一个上，所述第二光的检测路径与所述第一光的照明路径垂直；

其中所述载物台进一步适于将所述样品定位在所述物镜的焦平面附近，并且相对于所述第一光的聚焦线移动所述样品；

将所述载物台定位在第一位置处，其中所述第一光以线聚焦在所述样品的第一选定平面上；

由所述多个线性阵列检测器中的至少一个根据聚焦在所述样品的所述第一选定平面上的所述第二光的时间测量强度；

将所述载物台定位在不同于所述第一位置的第二位置处，其中所述第一光以线聚焦在所述样品的第二选定平面上；以及由所述多个线性阵列检测器中的至少一个根据聚焦在所述样品的所述第二选定平面上的所述第二光的时间测量强度，其中，所述光学系统还包括：

第一分束器，其被定位成将从所述样品荧光发射的第二光反射到所述多个线性阵列检测器的第一线性阵列检测器上；以及第二分束器，其被定位成将从所述样品反射的第二光反射到所述多个线性阵列检测器的第二线性阵列检测器上，其中，从所述样品荧光发射的所述第二光与所述第一线性阵列检测器之间的路径不同于从所述样品反射的所述第二光与所述第二线性阵列检测器之间的路径。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一选定位置近似垂直于所述第一光的聚焦线的方向平移。

11.根据权利要求9所述的方法，其还包括从与所述共聚焦显微镜分离的数字图像捕获装置获取所述样品的光学图像，所述光学图像具有大于所述样品的视场。

12.根据权利要求11所述的方法，其还包括在与目标计算装置通信的显示装置上显示所述光学图像，所述目标计算装置适于从用户接收矢量目标输入，其中所述矢量目标对应于所述样品的关注区域。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述目标计算装置与所述载物台通信，并且其中所述载物台进一步适于：从所述目标计算装置接收所述矢量目标；并且

对所述样品进行定位，使得所述第一光以线聚焦在所述样品的所述关注区域内。

14.一种共聚焦显微镜，其包括：

光源；

载物台，其适于将样品固定到其上；

多个线性阵列检测器；以及

光学系统，其包括：

柱面透镜，其定位成接收由所述光源发射的第一光，并且在所述样品固定到所述载物台时将所述第一光以线聚焦在所述样品的选定平面上；

物镜，其定位成与入射到所述样品的所述第一光垂直以响应于所述第一光入射到所述样品上而接收来自所述样品的第二光，并且将所述第二光聚焦在所述多个线性阵列检测器中的至少一个上，所述第二光的检测路径与所述第一光的照明路径垂直；

第一分束器，其被定位成将从所述样品荧光发射的第二光反射到所述多个线性阵列检测器的第一线性阵列检测器上；以及第二分束器，其被定位成将从所述样品反射的第二光反射到所述多个线性阵列检测器的第二线性阵列检测器上,其中所述载物台进一步适于将所述样品定位在所述物镜的焦平面附近，并且相对于所述第一光的聚焦线移动所述样品，其中，从所述样品荧光发射的所述第二光与所述第一线性阵列检测器之间的路径不同于从所述样品反射的所述第二光与所述第二线性阵列检测器之间的路径。

说明书

线扫描、样品扫描、多模式共聚焦显微镜

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求于2014年8月13日提交的标题为“线扫描、样品扫描共聚焦显微镜(Line-Scanning，Sample-Scanning Confocal Microscope)”的美国临时申请号62/037030的优先权的权益。上述申请的全部教导通过引用的方式并入本文。

背景技术

[0003] 癌症是美国死亡的第二大原因，每年致死约五十万人。早期检测有助于去除原发性肿瘤，这对于通过去除原发性肿瘤来预防转移是至关重要的。早期生长期是转移性起始的随后阶段的非常优选的检测窗口。

[0004] 确定癌症是否存在于身体中的能力通常受到去除组织样品以及用显微镜检查组织中是否存在具有已知癌症性状的细胞的能力的限制。这个过程通常通过以下方式来完成：将组织切成薄切片，以便实现比细胞小一个数量级的分辨率，用标记细胞和其他组织成分的化学品染色切片并将薄切片放置在显微镜上以便进行观察和评估。

[0005] 共聚焦显微镜是对组织中的细胞进行成像的替代技术，其不需要物理切割组织，也称为物理切片。实际上，共聚焦显微镜实施光学切片，对组织的不同焦平面进行成像代替物理切片。共聚焦显微镜探测组织内的点并在二维中扫描所述点以形成图像。

[0006] 然而，用于通过共聚焦显微镜对组织进行成像的当前技术在某些方面是受限的。在一个示例中，共聚焦显微镜不能获得具有大视场(例如，大于约1cm)和高分辨率(例如，小于约5μm)的连续图像。在另一个示例中，共聚焦显微镜未能提供执行与组织病理学相当的病理分析所需的信息，所述组织病理学是卓越的标准。在另一个示例中，共聚焦显微镜是缓慢和麻烦的，以致阻止在外科手术或围手术期手术室中的应用。

[0007] 因此，存在对改进的共聚焦显微镜系统和相应技术的持续需要。

发明内容

[0008] 本公开的实施方式涉及改进的共聚焦显微镜系统和使用所述共聚焦显微镜系统的分析方法。在非限制性实施方式中，这样的系统可以用作手术床旁病理装置，用于提供生物组织(例如，人类生物组织)中癌症的存在或不存在的快速测定的分析方法。

[0009] 如下面详细讨论的，所公开的共聚焦显微镜的实施方式包括光源(例如，相干光源)、适于接收样品的可移动载物台、多个光检测器、以及适于将光从光源引导到样品并且将光从样品引导到多个线性阵列检测器的光学系统。

[0010] 例如，由光源(例如，激光器)发射的相干光由光学系统接收并聚焦成线(例如，通过光学系统的柱面透镜)。入射光的所述聚焦线由光学系统引导到固定到载物台的目标样品的关注的焦平面上。通过响应于入射光的荧光，从样品的焦平面反射或从样品的焦平面发射的入射光的至少一部分被接收并且由光学系统(例如，物镜)聚焦到多个线性阵列检测器上，所述检测器根据时间测量检测光。光学系统可以进一步配置成使得入射到样品上的入射光的路径和从样品反射或荧光发射的检测光的路径遵循不同的路径。

[0011] 当载物台相对于照明线移动样品时，时变检测的光特性改变，从而导致线透射，并且因此探测不同的样品区段。可以移动载物台以便引导线穿过样品，从而允许对关注的整个焦平面进行光学测量。所述过程可以针对多个焦平面重复，以根据时间和位置而获取样品的光学测量值。光学、时间和位置数据的至少一部分可以进一步传送到与共聚焦显微镜通信的计算装置，所述共聚焦显微镜分析数据以生成样品的三维图像。

[0012] 所公开的共聚焦显微镜的实施方式和相应的分析技术代表了显着的进步。值得注意的是，直到最近，使用线性阵列检测器执行共聚焦显微术是不可行的，因为在样品包括荧光标记的核的情况，由线性阵列检测器记录信号所需的入射光强度将导致组织的热损伤或光漂白荧光分子。然而，近来，线性阵列检测器已经实现了足够的灵敏度，使得它们能够检测来自组织的微小体积的弱光信号。

[0013] 与使用二维(例如，平面)光栅扫描方法进行检测的点扫描共聚焦显微镜相比，使用共聚焦显微镜进行线扫描样品并使用线性阵列检测器进行检测提供了显著的优点。在一个方面，线扫描共聚焦显微镜的制造更简单和更便宜，因为它们不需要在两个独立方向上进行扫描以形成2维图像。典型的点扫描显微镜将使用可移动反射镜(例如，电流计反射镜)，使得偏转的激光束可以成角度进入具有可变角度的物镜，这进而改变焦平面中的横向位置。移动反射镜和对运动进行计时所需的光电子学是复杂的，并且包括反射镜的其自身必须是“激光质量”的部件是昂贵的。在另一方面，线扫描共聚焦显微镜能够比点扫描类型更快地形成图像，因为它们一次一行地向图像添加像素，而不是一次一个像素。典型的线性阵列检测器可以具有可以同时注册的数千个像素，而点检测器仅在任何给定时刻注册一个像素。

[0014] 在本公开的实施方式中，提供了一种共聚焦显微镜。显微镜包括：光源；载物台，其适于将样品固定到其上；多个线性阵列检测器；以及光学系统。光学系统包括：柱面透镜，其定位成接收由光源发射的第一光，并且在所述样品固定到载物台时将第一光以线聚焦在样品的选定平面上；以及物镜，其定位成响应于第一光入射到样品上而接收来自样品的第二光，并且将第二光聚焦在多个线性阵列检测器中的至少一个上；其中载物台进一步适于将样品定位在物镜的焦平面附近，并且相对于第一光的聚焦线移动样品。

[0015] 共聚焦显微镜的实施方式可以任何组合进一步包括以下各项中的一个或多个。

[0016] 在共聚焦显微镜的实施方式中，光源是单个激光源。

[0017] 在实施方式中，共聚焦显微镜还包括光学斩波器，并且光源包括至少两个激光器，每个激光器发射不同的激光束，其中光学斩波器允许每个不同的激光束以不同于其他激光束的时间传递到样品上。

[0018] 在实施方式中，共聚焦显微镜还包括计时系统，所述计时系统测量斩波器的位置，识别斩波器允许第一光照射样品的光源，并且测量光源对样品的照射的持续时间。

[0019] 在共聚焦显微镜的实施方式中，其中计时系统包括运动检测器、信号灯和位于斩波器两侧上的时钟检测器，其中时钟检测器响应于信号灯的检测而生成时钟信号，所述时钟信号对应于所识别的光源对样品的照射的持续时间。

[0020] 在共聚焦显微镜的实施方式中，计时系统包括运动检测器和与光源相对定位的时钟检测器，其中时钟检测器响应于所识别的光源的照明的检测而生成时钟信号，并且其中时钟信号对应于所识别的光源对样品的照射的持续时间。

[0021] 在共聚焦显微镜的实施方式中，载物台相对于聚焦在样品上的第一光的线而物理地平移样品，而不移动第一光。

[0022] 在共聚焦显微镜的实施方式中，光学系统还包括：第一分束器，其被定位成将从样品荧光发射的第二光反射到多个线性检测器阵列的第一线性检测器阵列上；以及第二分束器，其被定位成将从样品反射的第二光反射到多个线性检测器阵列的第二线性检测器阵列上。

[0023] 在共聚焦显微镜的实施方式中，从样品荧光发射的第二光具有不同于第一光的波长，并且其中从样品反射的第二光具有与第一光近似相同的波长。

[0024] 在共聚焦显微镜的实施方式中，从样品荧光发射的第二光与第一线性检测器阵列之间的路径不同于从样品反射的所述第二光与第二线性检测器阵列之间的路径。

[0025] 在本公开的实施方式中，提供了一种对样品进行成像的方法。所述方法包括提供共聚焦显微镜，其包括：光源；载物台，其适于将样品固定到其上；多个线性阵列检测器；以及光学系统。光学系统包括：柱面透镜，其定位成接收由光源发射的第一光，并且在固定到载物台时将第一光以线聚焦在样品的选定平面上；以及物镜，其定位成响应于第一光入射到样品上而接收来自样品的第二光，并且将第二光聚焦在多个线性阵列检测器中的至少一个上；其中载物台进一步适于将样品定位在物镜的焦平面附近，并且相对于第一光的聚焦线移动样品。所述方法的实施方式还包括：将载物台定位在第一位置处，其中第一光以线聚焦在样品的第一选定平面上；由多个线性阵列检测器中的至少一个根据聚焦在样品的第一选定焦平面上的第二光的时间测量强度；将载物台定位在不同于第一位置的第二位置处，其中第一光以线聚焦在样品的第二选定平面上；以及由多个线性阵列检测器中的至少一个根据聚焦在样品的第二选定焦平面上的第二光的时间测量强度。

[0026] 所述方法的实施方式可以任何组合进一步包括以下各项中的一个或多个。

[0027] 在所述方法的实施方式中，第一选定位置近似垂直于第一光的聚焦线的方向平移。

[0028] 在实施方式中，所述方法还包括从与共聚焦显微镜分离的数字图像捕获装置获取样品的光学图像，所述光学图像具有大于述样品的视场。

[0029] 在实施方式中，所述方法还包括在与目标计算装置通信的显示装置上显示光学图像，目标计算装置适于从用户接收矢量目标输入，其中矢量目标对应于样品的关注区域。

[0030] 在所述方法的实施方式中，目标计算装置与载物台通信，并且其中载物台进一步适于：从目标计算装置接收矢量目标；并且对样品进行定位，使得第一光以线聚焦在样品的关注区域内。

附图说明

[0031] 图1a至图1c是本公开的共聚焦显微镜系统的实施方式的示意图；

[0032] 图2a至图2b是在所公开的共聚焦显微镜系统的某些实施方式中采用的照明和计时方案的示意图；

[0033] 图3是在本公开的共聚焦显微镜系统的实施方式中使用的照明和检测路径的示意图；

[0034] 图4a至图4b是在本公开的共聚焦显微镜系统的实施方式中使用的检测通道的示意图；

[0035] 图5是在本公开的共聚焦显微镜系统的实施方式中使用的光学配置的示意图；

[0036] 图6是在本公开的共聚焦显微镜系统的实施方式中使用的样本扫描方案的示意性框图；并且

[0037] 图7是示出并入本公开的共聚焦显微镜系统的实施方式的临床显微镜设计的示意性框图。

具体实施方式

[0038] 现在将参考附图讨论本公开的实施方式。图1a是本公开的共聚焦显微镜(101)的实施方式的示意图。显微镜(101)包括光源(103)、柱面透镜(105)、多个检测器(107)、物镜(109)、分束器(111)和载物台(113)。在图1a中，为了清楚描述起见，透镜系统被象征性地表示为单个透镜(105)和(109)。然而，随后的附图，从图4开始，透镜和光学配置被明确地表示。

[0039] 利用柱面透镜(105)将从光源(103)发出的光作为线聚焦到样品的平面上。这种光在这里可以称为“照明光”。然后，照明光从样品反射和/或荧光地向后放射。来自样品的所述光从入射光束的路径(通过分束器111)朝向检测器(107)分离，所述检测器可以包括一个或多个线性阵列检测器。检测到的光由共轭光学系统(109)进行调节，所述共轭光学系统将样品上的入射光的聚焦线映射到一个或多个共轭焦平面中的一个或多个线性阵列检测器(107)上(在多个检测器的情况下)。载物台(113)使样品(例如，组织样本)在空间中相对于光学系统(例如，105、109)平移，从而允许探测整个样本的部分。

[0040] 在所公开的共聚焦显微镜(101)的某些实施方式中，入射激光线被聚焦到放置样品(例如，组织样本)的窗口的表面上或在其附近，并且使用了单独的光路用于将所述平面成像到包含线性阵列检测器的共轭焦平面。使用用于照明和检测的两个单独路径使得能够独立地调节两个光束(例如，通过将柱面透镜(105)放置在照明路径中以在样品焦平面中产生聚焦光线)。

[0041] 在显微镜(101)的其他实施方式中，通过移动载物台以使样品(例如，组织样本)在空间中相对于设备平移来执行组织样本(例如，癌组织)的扫描，所述设备用线照亮样品并且对检测器平面处的照明线进行成像。在一个特定实施方式中，不需要波束扫描(波束相对于显微镜的光学移动)。

[0042] 图1b呈现用于允许来自荧光核染色的成像对比度的荧光检测配置中的共聚焦显微镜(101)的实施方式的另一示意图。例如，物镜，LObj物镜(109)被扩展成两个透镜，以示出LObj是由复合透镜和检测器透镜组成的透镜系统，所述两个透镜一起工作以便在光撞击线性阵列检测器之前，调节来自样品的返回的荧光和/或反射光。

[0043] 图1b进一步示出分束器(111)透射照明激光并反射荧光发射光的配置。因此，入射光透射穿过分束器(111)，同时从样品发射的荧光从分束器反射到检测器(107)，线性荧光检测器阵列。

[0044] 图1c呈现实现多模式成像对比度的共聚焦显微镜(101)的实施方式的另一示意图，其中两种模式是反射和荧光。反射模式提供与样品的组织结构的对比度，并且荧光模式提供与样品的细胞核的对比度。在所述配置中，检测到的光被分离到由单独的检测器(分别为107a、107b)检测到的反射光路和荧光光路中。可以注意到，分束器(图1a至图1c中所示)可以用于反射照明光(图1a)或反射检测到的光(图1b、图1c)。

[0045] 显微镜(101)的实施方式表示共聚焦显微中的范例变化。在一个方面，常规的共聚焦显微获得具有点扫描共聚焦配置的方形视场。相比之下，所公开的共聚焦显微镜(101)的实施方式实施线扫描以克服高分辨率下视场的限制。这意味着所述线可以比断言(predicate)点扫描系统中的方形视场更长。

[0046] 在另一方面，常规的共聚焦显微镜采用扫描激光束，这通常通过使照明波束聚焦离开旋转镜来实现。相比之下，通过采用平移载物台而不是扫描激光束，不存在场曲(所述场曲在扫描离开旋转镜时出现)。在本公开中，样品可以无限地平移(取决于驱动载物台的电机的范围)，从而将垂直于线的方向上的视场扩展为大于断言点扫描系统的方形视场。因此，共聚焦显微镜的实施方式在载物台运动的方向上提供不受限制的视场。

[0047] 如上所讨论，消除在载物台扫描方向上的照明场曲的优点与单独的照明和检测路径的优点相结合，即，视场也不受聚焦光线的方向(近似垂直于载物台扫描的方向)上的场曲限制。这是因为柱面透镜在其轴线(聚焦光线的轴线)上没有曲率，因此可以在物理尺寸上延伸，以形成在空间中是笔直(即，基本上不弯曲)的长线。

[0048] 在聚焦光线的方向上不存在场曲以及在载物台平移的方向上不存在场曲在合理的限度内提供了大视场。例如，可以利用所公开的共聚焦显微镜的实施方式容易地实现多厘米的视场。相比之下，标准的高分辨率显微镜通常限于小于1mm的视场。这表示大于10倍的视场的改善，这在检查通常大于1mm的视场的切除组织样本时是非常有利的。

[0049] 光源(103)的实施方式可以是相干点源，诸如激光器。在某些实施方式中，激光源进行准直。在替代实施方式中，激光源不进行准直，而是在柱面透镜(105)的曲率方向上发散，并且在光被注入系统中以便行进通过物镜系统的合成部件，之后投射到样品上的情况下可以省略柱面透镜，并且因此在激光束不发散的方向上使用物镜的聚焦能力。在这种情况下激光器的重要参数是：发散度(以度计)将确定样品中的线的长度。约3度的典型发散因子对于标准物镜的视场是足够的，但是可以通过使用更大的激光发散度来扩展线。

[0050] 柱面透镜(105)的实施方式可以是数值孔径，其与照明光的波长结合产生足够小的聚焦线以解析生物组织的重要细胞和核细节，使得能够确定所述组织的病理状态。例如，聚焦线可以具有小于或等于约1μ的厚度。

[0051] 多个检测器(107)的实施方式可以包括在垂直于线性阵列的方向上的像素宽度，近似等于在投射到检测器焦平面中时的聚焦线的厚度。以这种方式，实现了线检测中的共聚焦门控。多个检测器还能够具有与载物台(113)的行进速率相称的线采集速率。多个检测器的灵敏度(例如，光电灵敏度、电子增益和信号调节中的至少一个)提供了强的信噪比。例如，多个检测器中的每一个的信噪比可以在约10至约100之间的范围内独立地选择。

[0052] 物镜(109)的实施方式可以包括被设计成具有近似平坦的焦平面的球面透镜。在这种情况下，保持数值孔径高(从而保持良好的分辨率)需要实施大透镜。因此，在某些实施方式中，物镜可以具有在约0.5英寸至约1.5英寸之间的范围内选择的直径。物镜(109)的替代实施方式可以包括特殊的玻璃设计，其得到在照明线入射到共轭检测器焦平面上的样品焦平面的区域的近似平坦的共轭。

[0053] 分束器(111)的实施方式可以包括薄膜分束器的实现方式，所述薄膜分束器是极其薄的膜(例如，约3-5μm)。使用薄分束器的优点是使球面像差最小化。分束器(111)的实施方式还可以包括被偏振的板分束器(图3，元件11)，用于与四分之一波片(图3，元件8)结合从而最大程度地反射光。替代实施方式包括也称为二向色分束器的彩色分束器(10)，以分离具有荧光发射波长的光。

[0054] 载物台(113)的实施方式可以具有便于成像的一种或多种能力。在一个方面，载物台(113)具有足够小以解析核和细胞细节的最小步长(例如，小于或等于约0.1μm)。在另一方面，载物台(113)具有足够精细使得顺序获取的相邻扫描可以无缝地结合在一起(即，没有实质的配准误差)位置重复性。在另一方面，载物台(113)具有俯仰和倾斜调整，以将光学窗口的平面(附接到载物台(113)并且样本被保持在所述平面上)与物镜的焦平面对准到约1μm的期望值内，使得当在样品的大侧向区域上平移载物台时，光学窗口的位置变化不大于约5μm。

[0055] 现在将讨论图2a至图2b，其示出共聚焦显微镜(101)的实施方式，所述实施方式在发射不同波长的照明光的两个光源(103a、103b)之间交替光源。在某些实施方式中，共聚焦显微镜(101)还包括作用类似于风扇的回旋叶片的光学斩波器(125)。斩波器(125)的功能是交替哪个照明光被允许穿过斩波器并且作为线聚焦在样品上。

[0056] 在实施方式中，具有信号灯(虚线)和时钟检测器(实线)的运动检测器(127)定位于斩波器风扇的两侧上，并生成时钟信号，所述时钟信号用于通过单独的激光器103a、103b指示照明时段。在替代实施方式中，可以通过省略运动检测器中的光源，而代之以检测一个或两个激光束的一小部分来获得时钟信号。共聚焦显微镜的这种配置导致在源(即，在两个激光器之间)和因此波长交替的照明光的输出，以及用于对采集进行定时的时钟信号(131)。以这种方式，可以通过线性阵列检测器在单独的激光波长照明下获得单独的线测量值，并且样品保持载物台的移动可以被定时，使得在实现所有激光照明之后，样品移动到新的位置，并重复所述过程。在某些实施方式中，时钟信号(131)直接到达线性阵列检测器(18)(参见图4、图5)，而在其他实施方式中，时钟信号(131)到达计算机(28)(参见图7)，进而触发线性阵列检测器(18)以获取入射到其上的光的测量值。

[0057] 在某些实施方式中(参见例如图3)，共聚焦显微镜包括柱面透镜[7]，所述柱面透镜使来自光源(例如[1]、[2])的光通过四分之一波片[8]以线[9]聚焦到样品上。在返回路径上，其中光从样品发出回到光学系统，第一分束器[10]被定位成相对于激光照明以约90度反射荧光发射。类似地，偏振分束器[11]被定位成当线相对于激光照明以约90度照射组织时反射被散射的激光。两个反射分束器将从样品发出的光(荧光[12]和反射光[13])导向两个检测通道：荧光检测通道[14](例如，第一线性阵列检测器)和反射检测通道[15](例如，第二线性阵列检测器)。

[0058] 在其中将四分之一波片[8]放置在光路中是不利的某些实施方式中，省略了四分之一波片[8]并且用50/50分束器代替偏振分束器[11]。

[0059] 在某些实施方式中，共聚焦显微镜(例如参见图4)还包括用于光学检测的无限远校正物镜[16]。透镜[16]被定位以便聚焦到包含样品焦平面[9]中的照明线的平面，使得物镜[16]与分束器[10]之间的距离以及分束器[10]与线照明[9]之间的距离的和近似等于物镜[16]的焦距。应当注意，就间距而言，这些实施方式中的术语“物镜”是指物镜的薄透镜等同物的理论平面，其可以是多透镜复合光学器件。

[0060] 检测器透镜[17]放置在距物镜一定距离处，所述距离是物镜[16]的焦距和检测器透镜[17]的焦距的和。线性阵列检测器[18]放置在检测器透镜的焦平面中(即，与检测器透镜相距一定距离，所述距离约为检测器透镜的焦距)。由荧光检测通道[14]进行的荧光检测遵循由反射通道进行的光学检测方案[15]。

[0061] 在某些实施方式中，为方便起见，可以可选地在透镜[16、17]之间插入额外的望远镜[19]，以调整照明线[9]到线性阵列检测器[18]上的共轭的放大率，使得能够添加额外的光调节光学器件[22]，或简单地拉长光学系统。透镜[16、17]的放置使得(例如在这个示例中)透镜[21]与透镜[17]之间的距离是两个透镜[21、17]的焦距的和，透镜[20]与透镜[21]之间的距离是两个透镜[20、21]的焦距的和，透镜[20]与透镜[16]之间的距离是两个透镜[20、16]的焦距的和。可以类似的方式添加额外的望远镜[22]，以无限地修改共聚焦显微镜(101)。

[0062] 在某些实施方式中(参见例如图5)，调整物镜[16]的位置，使得激光通过柱面透镜[7]聚焦到物镜[16]的后焦平面上。

[0063] 在某些实施方式中，激光源不进行准直，而是在柱面透镜[7]的曲率方向上发散，并且可以完全省略柱面透镜[7]。

[0064] 在某些实施方式中，本文所公开的装置不包含移动光束。实际上，样品相对于光学系统俯仰、倾斜和平移。需要平移以形成图像，并且需要俯仰/倾斜以使样品的表面与物镜的焦平面平行。平移方案(参见例如图6)包括5维微定位单元[23]，所述5维微定位单元刚性地耦合到光学系统[24]并且控制样品的x、y和z位置以及样品相对于垂直于光学照明路径[26]和检测路径[27]的平面的俯仰和倾斜。

[0065] 在某些实施方式中，包含待成像样本的样品固定装置以可调整的方式[25]机械地耦合到微定位单元[23]。俯仰、倾斜和z微操纵可以用于定位样品，使其表面位于物镜[16]的焦平面中。y微操纵器使样品垂直于物镜[16]的焦平面中的照明线[9]移动，而线性阵列检测器[14]获取被组装以形成平面视场的一系列线。y微操纵器沿着照明线的方向移动样品，使得在获取视场之后，可以获取随后的一个或多个视场以覆盖样品表面的附加部分。z微操纵器可以用于获取平面堆叠以形成3D图像。

[0066] 在某些实施方式中，所获得的图像数据可以由一个或多个计算机处理器[28、36等]处理和/或显示，并且经处理的数据[34、37]、诊断或皮肤病的存在或不存在的指示符[38]可以输出到一个或多个显示模块并由其显示。在某些实施方式中，存在针对外科手术设置和远程医疗模式[36]优化的数字显示器[32]，使得可以由专家病理学家实时检查显微镜图像。共聚焦显微镜(参见例如图7)通常包括通过计算机处理器[28]与从计算机到显微镜[29]的通信连接的共聚焦显微镜，所述通信诸如用于驱动微定位平移载物台[23]的命令、用于获取线性阵列检测器(18)上的数据的触发器、用于打开/关闭激光器[1、2]和斩波器[3]以及从显微镜到计算机[30]的通信的信号，诸如来自斩波器[6]的时钟信号、来自线性阵列检测器[18]的图像数据。

[0067] 在某些实施方式中，常规的数字相机[31]对样本进行成像，并且实况视频[33]被发送到计算机处理器[28]，所述计算机处理器进而以数据流[34]将图像馈送到数字触摸屏显示器[32]上，使得操作者可以通过手动触摸或鼠标点击期望的共聚焦扫描的区域坐标来进行选择。所述用户选择的坐标信息被中继到计算机[35]以用于控制共聚焦图像采集。

[0068] 在某些实施方式中，在共聚焦图像扫描期间，一个或多个共聚焦图像被获取，通过潜在地合并来组装，并且作为信号[34]发送到临床显示监视器[32]以进行显示。

[0069] 在某些实施方式中，具有显示器的远程病理学计算机处理器[36]接收图像数据[37]，并且可以用于传送皮肤疾病存在或不存在的诊断或指示符或指示图像样本上的关注区域的修改图像。

[0070] 本文所使用的术语和表达被用作描述性而不是限制性术语，并且在使用这些术语和表达时不意图排除所示和所描述的特征或其部分的任何等同物，而是认识到在所要求保护的本发明的范围内的各种修改是可能的。因此，应当理解，虽然本发明已通过优选实施方式，示例性实施方式和任选特征具体公开，但是本文公开的概念的修改和变化可以由本领域技术人员采取，并且这样的修改和变化被认为在由所附权利要求限定的本发明的范围内。本文提供的具体实施方式是本发明的有用实施方式的示例，并且对于本领域技术人员显而易见的是，本发明可以使用本说明书中所阐述的装置、装置部件、方法步骤的大量变化来实施。如对本领域技术人员显而易见的，用于本方法的方法和装置可以包括大量任选的组合物和处理元件和步骤。

[0071] 当本文公开了一组取代基时，应理解所述基团的所有单个成员和所有亚类(包括基团成员的任何异构体)对映异构体和非对映异构体分别公开。当在本文中使用马库什组或其他分组时，所述组的所有个体成员以及所述组的所有可能的组合和子组合旨在单独地包括在本公开中。当本文描述化合物使得化合物的特定异构体、对映异构体或非对映异构体没有例如在式或化学名称中指定时，所述描述意在包括单独或以任何组合描述的化合物的各异构体和对映异构体。另外，除非另有说明，否则本文公开的化合物的所有同位素变体意欲包括在本公开内容中。例如，应当理解，所公开的分子中的任何一个或多个氢可以被氘或氚代替。分子的同位素变体通常用作分子测定中以及与分子或其用途相关的化学和生物研究中的标准。制备这种同位素变体的方法是本领域已知的。化合物的具体名称意在是示例性的，因为已知本领域普通技术人员可以不同地命名相同的化合物。

[0072] 除非另有说明，本文描述或举例的每种制剂或组分的组合可用于实践本发明。

[0073] 每当在说明书中给出范围时，例如，温度范围、时间范围或组成、组分或浓度范围、所有中间范围和子范围，以及包括在给定范围内的所有单独值意在包括在本公开中。应当理解，包括在本文的说明书中的范围或子范围中的任何子范围或单个值可以从本文的权利要求中排除。

[0074] 说明书中提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术人员的技术水平。本文引用的参考文献通过引用整体并入本文，以指示其出版或申请日期时的现有技术状态，并且如果需要，本文可以采用所述信息以排除现有技术中的具体实施方式。例如，当要求保护物质组成时，应当理解的是，在申请人的发明之前本领域已知和可获得的化合物，包括在本文引用的参考文献中提供了使能公开内容的化合物，不旨在包括在本文的物质组成。

[0075] 必须注意，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及其本领域技术人员已知的等同物等等。同样，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一种”可以在本文中互换使用。还要注意，术语“包括(comprising)”、“包括(including)”和“具有”可以互换使用。“任何权利要求XX-YY”(其中XX和YY是指权利要求号)的表达意在以替代形式提供多重从属权利要求，并且在一些实施方式中可与表达“如权利要求XX-YY中任一项”互换。

[0076] 除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域一般技术人员通常所理解含义相同的含义。尽管在实践或测试本发明时可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但现在描述了优选的方法和材料。本文中的任何内容不被解释为承认本发明没有资格由于在先发明而早于这样的公开。

[0077] 除非另有说明，本文描述或举例的每种制剂或组分的组合可用于实践本发明。

[0078] 每当在说明书中给出范围时，例如，温度范围、时间范围或组成或浓度范围、所有中间范围和子范围，以及包括在给定范围内的所有单独值意在包括在本公开中。如本文所使用的，范围具体包括作为范围的端点值提供的值。例如，1至100的范围具体包括1和100的端点值。应当理解，包括在本文的说明书中的范围或子范围中的任何子范围或单个值可以从本文的权利要求中排除。

[0079] 如本文所用，“包括(comprising)”与“包括(including)”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括性的或开放式的，并且不排除额外的未记载的元件或方法步骤。如本文所用，“由...组成”排除未在权利要求元素中指定的任何元素、步骤或成分。如本文所用，“基本上由...组成”不排除不实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。在本文的每种情况下，术语“包括”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任何一个可以用其他两个术语中的任一个替代。本文中示例性描述的本发明可以在不存在本文没有具体公开的任何一个或多个元件、一个或多个限制的情况下实施。

[0080] 本领域普通技术人员将理解，除了那些具体举例说明的起始材料、生物材料、试剂、合成方法、纯化方法、分析方法、测定方法和生物学方法可以用于本发明的实践中而不依赖于不适当的实验。任何这种材料和方法的所有本领域已知的功能等同物旨在包括在本发明中。所使用的术语和表达被用作描述性而不是限制性术语，并且在使用这些术语和表达时不意图排除所示和所描述的特征或其部分的任何等同物，而是认识到在所要求保护的本发明的范围内的各种修改是可能的。因此，应当理解，虽然本发明已通过优选实施方式和任选特征具体公开，但是本文公开的概念的修改和变化可以由本领域技术人员采取，并且这样的修改和变化被认为在由所附权利要求限定的本发明的范围内。