雨生红球藻破壁及虾青素提取方法

摘要

雨生红球藻破壁及虾青素提取方法，其包括如下步骤：S1:将雨生红球藻粉与浓硫酸‑醇体系混合均匀，在30～70℃条件下搅拌，破壁达到一预定时长，得到含破壁雨生红球藻的醇溶液；S2:向S1步骤得到的含破壁雨生红球藻的醇溶液加入萃取溶剂，在30～70℃条件搅拌提取，分层，浓缩上清液，得含虾青素的提取物。本方法破壁及提取温度均较低，反应条件温和，减少虾青素的损失，粗提物中虾青素含量可高达10％左右，故可降低后续纯化难度有利于虾青素的商品化。本发明的方法操作步骤相对现有方法更简化，试剂种类及用量更少，故可降低能耗及综合成本。

权利要求

1.雨生红球藻破壁及虾青素提取方法，包括如下步骤：

S1:将雨生红球藻粉与浓硫酸-醇体系混合均匀，在30～70℃条件下搅拌，破壁达到一预定时长，得到含破壁雨生红球藻的醇溶液；其中，所述的浓硫酸-醇体系中，浓硫酸的含量为1-10％体积分数；雨生红球藻粉与浓硫酸-醇体系的料液比为1:5～10(g/mL)；

S2:向S1步骤得到的含破壁雨生红球藻的醇溶液加入萃取溶剂，在30～70℃条件搅拌提取，分层，浓缩上清液，得含虾青素的提取物。

2.根据权利要求1的雨生红球藻破壁及虾青素提取方法，其特征在于，所述的浓硫酸-醇体系中的醇为小分子醇。

3.根据权利要求2的雨生红球藻破壁及虾青素提取方法，其特征在于，所述的小分子醇选择为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种。

4.根据权利要求1的雨生红球藻破壁及虾青素提取方法，其特征在于，所述的浓硫酸-醇体系中，浓硫酸的含量为3％～10％体积分数。

5.根据权利要求1的雨生红球藻破壁及虾青素提取方法，其特征在于，雨生红球藻粉与浓硫酸-醇体系的料液比为1:10(g/mL)。

6.根据权利要求1的雨生红球藻破壁及虾青素提取方法，其特征在于，S2中使用的萃取溶剂选择为正己烷、丁烷、植物油抽提溶剂中的一种或几种。

7.根据权利要求6的雨生红球藻破壁及虾青素提取方法，其特征在于，所述雨生红球藻粉与萃取溶剂的质量体积比为1:10～15(g/mL，w/v)，提取次数≥1。

8.根据权利要求1的雨生红球藻破壁及虾青素提取方法，S1中破壁时长为30min～

80min。

9.根据权利要求1或6的雨生红球藻破壁及虾青素提取方法，其特征在于，萃取提取时长为30min以上。

10.根据权利要求1的雨生红球藻破壁及虾青素提取方法，其特征在于，S1中的破壁温度为30℃～60℃。

说明书

雨生红球藻破壁及虾青素提取方法

技术领域

[0001] 本发明涉及藻类功能成分提取领域，具体涉及从雨生红球藻中提取虾青素的方法。

背景技术

[0002] 虾青素(3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β-胡萝卜素)是类胡萝卜素的含氧衍生物，属于酮式类胡萝卜素[1]，天然虾青素由藻类、植物、细菌和真菌等合成。虾青素有13个共轭双键组成的共轭分子，单双键交替增加了虾青素抗氧化能力，可中和自由基或清除活性氧，可以预防自由基导致的疾病，包括口腔溃疡、结肠癌、心血管疾病等，以及可以很好地预防白内障等眼部疾病，应用于食品、药品、化妆品等领域，此外，虾青素还可作为着色剂在水产养殖中应用[2]。

[0003] 虾青素主要由人工合成和天然提取而来。人工合成虾青素50％消旋、25％左旋、25％右旋，100％为游离态，其稳定性极差，导致抗氧化活性相对较低，而且在合成过程中不可避免引入杂质化合物，主要应用于水产养殖。人工合成，50000-80000ppm，仅有国际化学巨头Roche、BASF公司能合成，主要为3R，3'S顺式结构，是一种石化产品，仅用于动物染色，在美国已禁止使用在保健品市场。

[0004] 天然虾青素100％左旋，稳定性好、抗氧化活性高、易吸收且安全性高，主要从雨生红球藻中提取，售价高达7150美元/公斤[3]。雨生红球藻中虾青素含量高，雨生红球藻细胞在缺氮、高光等胁迫环境下由营养细胞变为厚壁孢子，同时大量积累虾青素，含量最高可达细胞干重的5.0％左右。但是，雨生红球藻积累虾青素过程所形成的厚壁孢子拥有致密坚韧的细胞壁，厚度达几微米，其主要由碳水化合物、纤维素等构成[4]，如此特质的细胞壁在虾青素的提取过程中，会阻碍溶剂与虾青素的接触，严重降低了虾青素的提取效率。由于虾青素是一种天然抗氧化剂，故对高温不耐受，据文献记载，在超过80℃温度条件下，虾青素可能就会发生变性，不再具有抗氧化性。因而，能够探索出一种高温且温和的对雨生红球藻细胞进行破壁的方法，对虾青素的提取至关重要，对虾青素能够产业化应用具有关键意义。见图1，虾青素是以酯的形式存在于雨生红球藻细胞中，在提取过程中部分的酯基脱掉，得到游离的虾青素和单酯。

[0005] 目前，国内外关于虾青素提取的专利及相关文献研究中，主要采用机械研磨破壁辅助溶剂提取、酶法破壁辅助溶剂提取、超临界二氧化碳萃取法和酸水溶液破壁法等。例如，中国专利申请号CN201310116039.5公开了一种雨生红球藻中提取虾青素的方法。该发明的方法包括如下步骤：①干燥雨生红球藻与含酸(磷酸、乙酸、盐酸、硫酸中的一种)酸性水溶液混合，在60～80℃搅拌破壁20～50min，调pH至中性，过滤去掉滤液，得含水破壁雨生红球藻；②将含水破壁雨生红球藻与乙醇溶液混合，在10～30℃搅拌脱水30min，过滤去掉滤液，得破壁雨生红球藻；③破壁雨生红球藻用有机溶剂搅拌提取，过滤，滤液浓缩，回收溶剂，得虾青素提取物。该方法采用酸性水溶液对雨生红球藻进行破壁，通过对酸的选择，结合适宜的破壁温度及时间，使破壁方法步骤简单且破壁率高达95％以上。但该方法中细胞的破壁温度仍然较高，导致虾青素不稳定而有效成分损失；此外该方法中还有“以10％NaOH调pH至中性”及“加95％乙醇脱水”的处理步骤，提取过程所需试剂种类较多，耗用量大，且操作步骤繁琐，直接影响提取成本；而且该方法所得提取物中虾青素含量低，仅为6％左右，杂质相对增多，增加了后续纯化难度。

[0006] 综上所述，现有技术存在的主要问题包括选用温度高、溶剂用量大、提取物中虾青素的含量低、操作复杂、步骤繁琐、耗时、耗能、所需设备昂贵综合成本较高等。针对以上问题，本发明选用酸-醇体系低温下破壁雨声红球藻，以绿色安全、在食品工业中批准使用的烷烃作为提取溶剂，开发了一种条件温和、安全易操作的高效提取方式。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种条件温和的雨生红球藻破壁及虾青素提取方法，用以简化操作步骤、减少试剂消耗量及成本，减少虾青素的损失并提高虾青素的提取纯度。

[0008] 为实现上述目的，本发明的雨生红球藻破壁及虾青素提取方法，包括如下步骤：

[0009] S1:将雨生红球藻粉与浓硫酸-醇体系混合均匀，在30～70℃条件下搅拌破壁，得到含破壁雨生红球藻的醇溶液；

[0010] S2:向S1步骤得到的含破壁雨生红球藻的醇溶液加入萃取溶剂，在30～70℃条件搅拌提取，分层，浓缩上清液，得含虾青素的提取物。

[0011] 其中所述的浓硫酸-醇体系，就是指将浓硫酸与醇混合而得到的体系。本发明的一个具体实施例中，其中所述的浓硫酸-醇体系中醇为小分子醇。

[0012] 其中，所述的小分子醇选择为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种。

[0013] 本发明的一个具体实施例中，其中所述浓硫酸-醇体系中，浓硫酸的含量为1-10％体积分数，更优选为3％～10％体积分数；余量为醇。

[0014] 本发明的一个具体实施例中，其中雨生红球藻粉与浓硫酸-醇体系的料液比为1:5～10(g/mL)，即每g的雨生红球藻粉中加入5～10ml浓硫酸-醇体系，更优选的料液比为1:10(g/mL)。

[0015] 其中，S2所述的萃取溶剂较佳为食品工业中允许添加使用的食品加工助剂，绿色无毒。

[0016] 本发明的一个具体实施例中，其中S2所述的萃取溶剂选择为正己烷、丁烷、植物油抽提溶剂中的一种或几种。

[0017] 植物油抽提溶剂是一种混合型溶剂，其主要成分为液体烷烃类化合物，组分由原先的10多种减少到5、6种左右，主要为2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、正己烷、甲基环戊烷、环己烷等。

[0018] 本发明的一个具体实施例中，其中所述雨生红球藻粉与萃取溶剂的质量体积比为1:10～15(g/mL，w/v)，提取次数≥1。

[0019] 本发明的一个具体实施例中，S1中破壁时长为30min～80min。

[0020] 本发明的一个具体实施例中，其中萃取提取时间为30min以上。

[0021] 本发明的一个具体实施例中，S1中的破壁温度为30℃～60℃。

[0022] 有益效果

[0023] 本发明采用是浓硫酸-醇体系，其中浓硫酸的比例仅为1-10％，因此试剂用量少；且在30～70℃下破壁，在较低温度下即可达到相当的提取效率，故可减少虾青素的损失和变性，反应条件很温和。相当于现有技术而言，本发明的方法中仅包括一个破壁步骤和萃取步骤，不需要加入碱液中和与脱水步骤，因此本发明的操作步骤简单，能耗和综合成本低。
经实验验证，按照本发明的方法从雨生红球藻中提取虾青素，提取率达93％以上，而粗提物中虾青素的含量更可高可达10％左右，可大幅降低后续纯化工艺的难度，更有利于将虾青素商品化。

附图说明

[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0025] 图1为游离虾青素(A)，虾青素单酯(B)，虾青素双酯(C)分子结构，是虾青素存在的三种形式。

具体实施方式

[0026] 以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

[0027] 实验准备

[0028] 实验器材：台式高速离心机(Beckman)，高效液相色谱仪(Waters e2695，PDA 2998检测器，色谱柱Spherisorb C18：250mm×4.6mm,5μm)。

[0029] 实验试剂：雨生红球藻(云南云彩金可生物技术有限公司)、二氯甲烷(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、甲醇(分析纯)、乙醇(分析纯)、浓硫酸(98％分析纯)、正己烷(分析纯)。

[0030] 实验方法

[0031] 参照GB/T31520-2015方法[5]并进行适当优化，称量30mg雨生红球藻藻粉(云南云彩金可生物技术有限公司)，液氮研磨3～5次，二氯甲烷-甲醇(1:3，V/V)为提取溶剂，用3～5mL二氯甲烷-甲醇将破壁藻细胞转移至15mL离心管，冰浴避光提取1h，离心分离，重复提取
3次，直至藻渣为白色，合并上清，用氮气吹干后称重，溶解后通过高效液相色谱仪进行虾青素分析测定，得到本发明所有实施例使用的藻粉(购自云南云彩金可生物技术有限公司)中虾青素的含量为4.68％，且以下所有实施例和比较例中所用藻粉均为同一批次。

[0032] 以此测定结果为标准，计算每次实验的虾青素提取率和提取物中虾青素的含量值。高效液相色谱仪分析条件：乙酸乙酯、0.1mol/L pH 8.0T ris-HCl、乙腈、甲醇为流动相，梯度洗脱25min，柱温40℃，流速1.2mL/min，进样量10μL。

[0033] 所用计算式如下：

[0034] 粗提物中虾青素的含量(％)＝(虾青素质量/粗提物质量)*100％；

[0035]

[0036] 实施例1

[0037] 称取200mg藻粉，置于反应瓶中，按10:1(mL/g)液料比加入5％硫酸-甲醇体系(体积分数，v/v)，50℃搅拌破壁1h。经5％硫酸-甲醇体系破壁处理后，按10:1(mL/g)液料比加入萃取溶剂正己烷，30℃条件下搅拌萃提30min，离心分层取上清，上清液氮气吹干，浓缩得富含虾青素的提取物，采用高效液相色谱法测定虾青素的含量，提取物中虾青素含量为10.2％，计算虾青素的提取率为93.5％。由此可见，虾青素含量10.2％，其粗提物中虾青素的含量就已经超过10％，因此可大幅降低后续纯化难度，更有利于将虾青素商品化。而现有的雨生红球藻中虾青素的提取方法，提取物中虾青素含量仅能达到6％左右(参见对比例)。

[0038] 实施例2

[0039] 称取200mg藻粉，置于反应瓶中，按10:1(mL/g)液料比加入3％硫酸-甲醇体系(体积分数，v/v)，30℃搅拌破壁1h。经3％硫酸-甲醇体系破壁处理后，按10:1(mL/g)液料比加入萃取溶剂正己烷，70℃条件下搅拌萃提30min，离心分层取上清，上清液氮气吹干，浓缩得富含虾青素提取物，采用高效液相色谱法测定虾青素的含量，提取物中虾青素含量为10.3％，计算虾青素提取率为92.3％。本实施例与实施例1的结果基本一致。虾青素含量
10.3％，其粗提物中虾青素的含量就已经超过10％。因此，按照本发明的雨生红球藻破壁及提取虾青素的方法，其重复性较好。

[0040] 实施例3

[0041] 称取200mg藻粉，置于反应瓶中，按10:1(mL/g)液料比加入10％硫酸-甲醇体系(体积分数，v/v)，70℃搅拌破壁1h。经10％硫酸-甲醇破壁后，按10:1(mL/g)液料比加入一种植物油抽提溶剂作为萃取溶剂，50℃条件下搅拌萃提30min，离心分层取上清，上清液氮气吹干，浓缩得富含虾青素提取物，采用高效液相色谱法测定虾青素的含量，提取物中虾青素含量为9.6％，计算虾青素提取率为87.5％，粗提物中虾青素含量接近10％。

[0042] 实施例4

[0043] 称取200mg藻粉，置于反应瓶中，按10:1(mL/g)液料比加入5％硫酸-乙醇体系(体积分数，v/v)，60℃搅拌破壁1h。经5％硫酸-乙醇体系破壁处理后，按5:1(mL/g)液料比加入丁烷作为萃取溶剂，50℃条件下搅拌萃提30min，离心分层取上清，上清液氮气吹干，浓缩得富含虾青素提取物，采用高效液相色谱法测定虾青素的含量，提取物中虾青素含量为8.8％，计算虾青素提取率为80％。粗提物中虾青素含量8.8％,其仍然超过现有提取方法所得的提取物中虾青素6％的含量值(参见对比例)。与CN201310116039.5专利申请公开的方案相比，本发明无需碱液中和及95％乙醇脱水干燥的处理操作，能减少化学试剂需求种类和消耗量，简化操作步骤。

[0044] 对比例

[0045] 按照CN201310116039.5揭示的方法进行操作，将干燥的雨生红球藻加入10％的冰乙酸水溶液中，60℃搅拌30min，然后缓慢滴加10％NaOH水溶液并不断搅拌，控制温度低于50℃，调节pH值至中性，过滤，向滤饼中加入92％乙醇，40℃搅拌30min，过滤，弃滤液，得破壁后的雨生红球藻。然后用乙酸乙酯在40℃下，搅拌提取30min，过滤，收集滤液，60℃真空浓缩得虾青素提取物，其提取效率为90.9％，虾青素含量为6.2％。

[0046] 参考文献

[0047] [1]齐计英，姚依婧，岑琴.响应面法优化雨生红球藻虾青素的超声提取工艺[J].食品工业科技,2015,36(06):313-321.

[0048] [2]Amos Richmond and Qiang Hu.Handbook of Microalgal Culture:Applied Phycology and Biotechnology[M].USA,John Wiley&Sons,Ltd.2013:388-405.[0049] [3]Dong-Yeon Kim,Durairaj Vijayan,Ramasamy Praveenkumar,et al.Cell-wall disruption and lipid/astaxanthin extraction from microalgae:Chlorella and Haematococcus[J].Bioresource Technology,2016,199:300-310.

[0050] [4]Hagen C.,Siegmund S.,Braune W..Ultrastructural and chemical changes in the cell wall of Haematococcus pluvialis(Vovocales,Chlorophyta)during aplanospore formation[J].Eur.J.Phycol,2008,37:317-226.

[0051] [5]GB/T 31520-2015