一种用于电泳分离的交联结构复合凝胶及其制备方法

摘要

本发明提供了一种用于电泳分离的交联结构复合凝胶及其制备方法，其如式I所示：该制备方法包括如下步骤：将丙烯酰胺与第一交联剂加入水中，混匀后依次加入单体、第二交联剂、缓冲液、变性剂、引发剂和催化剂，形成混合水溶液，进行反应，得到所述具有交联结构的复合凝胶。前述的具有交联结构的复合凝胶在电泳分离分子量小于30kDa蛋白质中的用途。本发明具有如下的有益效果：复合凝胶的分辨率和力学性能均有明显提高；制备方法简单，原料选择范围大；可适用于分子量小于30kDa多肽的分离。

权利要求

1.一种用于电泳分离的交联结构复合凝胶，其特征在于，如式I所示：

其中，a、b、c、d、e、f、g、h所代表的数值相同或不同，均为大于零或等于零的整数，且a、b、c、d、e、f、g、h不同时为零；R代表H或甲基；M为金属离子。

2.如权利要求1所述的用于电泳分离的交联结构复合凝胶，其特征在于，所述M为+2价金属离子。

3.如权利要求2所述的用于电泳分离的交联结构复合凝胶，其特征在于，所述+2价金属离子为钙离子、镁离子或锌离子。

4.一种如权利要求1～3中任意一项所述的用于电泳分离的交联结构复合凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将丙烯酰胺与第一交联剂加入水中，混匀后依次加入单体、第二交联剂、缓冲液、变性剂、引发剂和催化剂，形成混合水溶液，进行反应，得到所述具有交联结构的复合凝胶；

所述单体为丙烯酸或甲基丙烯酸，所述第一交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，所述第二交联剂为金属可水溶性盐，所述变性剂为十二烷基硫酸钠，所述引发剂为过硫酸铵，所述催化剂为四甲基乙二胺，所述水为超纯水。

5.如权利要求4所述的用于电泳分离的交联结构复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述混合水溶液中，丙烯酰胺的质量分数为4～20％、第一交联剂的质量分数为0.1～1％、第二交联剂的质量分数为0.01～2％、单体的质量分数为0.05～3％、变性剂的质量分数为0.5～2％、引发剂的质量分数为0.5～3％、催化剂的体积分数为0.03～0.5％、缓冲液的体积分数为20～50％。

6.如权利要求4或5所述的用于电泳分离的交联结构复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述金属可水溶性盐为氯化钙、氯化镁或氯化锌。

7.如权利要求4所述的用于电泳分离的交联结构复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为2～5h。

8.如权利要求4所述的用于电泳分离的交联结构复合凝胶的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为1.5M的Tris-HCl溶液，pH＝8.8。

9.一种如权利要求1所述的用于电泳分离的交联结构复合凝胶在电泳分离分子量小于

30kDa多肽中的用途。

说明书

一种用于电泳分离的交联结构复合凝胶及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于电泳分离的交联结构复合凝胶及其制备方法，属于生物分离用介质材料的制备领域。

背景技术

[0002] 凝胶是一种通过单体和交联剂相互交联构成的具有三维网络结构的材料。高分子水凝胶材料由于其独特的网格结构，在生物分离、分析、临床诊断等领域有着广泛的应用前景。然而传统的聚丙烯酰胺凝胶的性能较为单一，在一定程度上限制了其发展。目前，在改善水凝胶性能多见于机械性能方面，而关于复合水凝胶在生物分离、分析、临床诊断等领域应用的报道非常少，更少见到采用复合凝胶用于凝胶电泳的报道。

[0003] 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，广泛应用于生物分离、分析、临床诊断等领域。在电泳过程中，蛋白质能够保持完整状态，并根据蛋白质的分子量大小逐渐呈梯度分开。为了增加凝胶对蛋白质的分离能力，通常采用增加丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的浓度的方法。但是单纯的增加浓度的方法往往会导致凝胶的力学性能变差，使得凝胶在电泳过程中容易破损甚至于不能完成整个电泳过程(一个完整的电泳过程包括凝胶的电泳、固定、染色和脱色，任何一步都会造成凝胶的破损，从而导致试验的失败。只有力学性能较好的凝胶才能在最大程度上避免这一点，即低浓度的凝胶。但是低浓度的凝胶的分辨率较差，不能满足试验的要求)。同时，即使增加丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的浓度，往往也只能分离分子量在30～250kDa的蛋白质。

发明内容

[0004] 针对上述传统交联水凝胶分辨率还有待提高的问题，本发明提供了一种用于凝胶电泳的交联结构化合物及其制备方法和用途。

[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0006] 第一方面，本发明提供了一种用于电泳分离的交联结构复合凝胶，如式I所示：

[0007]

[0008] 其中，a、b、c、d、e、f、g、h所代表的数值相同或不同，均为大于零或等于零的整数，且a、b、c、d、e、f、g、h不同时为零；R代表H或甲基；M为金属离子。

[0009] 本发明在丙烯酰胺中加入的丙烯酸或甲基丙烯酸具有双键结构，能够和丙烯酰胺发生聚合反应，金属离子与丙烯酸或甲基丙烯酸上的羧基发生反应，同时丙烯酸或甲基丙烯酸上的羧基和丙烯酰胺的胺基发生反应，由于金属离子和丙烯酸或甲基丙烯酸均充当交联点，可以改善复合凝胶的分辨率和力学性能。在改善力学性能的同时，复合凝胶由于存在交联点，还能较好的提高对蛋白质的分离能力，尤其是分子量小于30kDa的蛋白质，特别是多肽的分离。

[0010] 作为优选方案，所述M为+2价金属离子。

[0011] 作为优选方案，所述+2价金属离子为钙离子、镁离子或锌离子。

[0012] 第二方面，本发明提供了一种如前述的用于电泳分离的交联结构复合凝胶的制备方法，其包括如下步骤：

[0013] 将丙烯酰胺与第一交联剂加入水中，混匀后依次加入单体、第二交联剂、缓冲液、变性剂、引发剂和催化剂，形成混合水溶液，进行反应，得到所述具有交联结构的复合凝胶。

[0014] 作为优选方案，所述混合水溶液中，丙烯酰胺的质量分数为4～20％、第一交联剂的质量分数为0.1～1％、第二交联剂的质量分数为0.01～2％、单体的质量分数为0.05～3％、变性剂的质量分数为0.5～2％、引发剂的质量分数为0.5～3％、催化剂的体积分数为
0.03～0.5％、缓冲液的体积分数为20～50％

[0015] 作为优选方案，所述单体为丙烯酸或甲基丙烯酸，所述第一交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，所述第二交联剂为金属可水溶性盐，所述变性剂为十二烷基硫酸钠，所述引发剂为过硫酸铵，所述催化剂为四甲基乙二胺，所述水为超纯水。

[0016] 作为优选方案，所述金属可水溶性盐为氯化钙、氯化镁或氯化锌。

[0017] 作为优选方案，所述反应的时间为2～5h。

[0018] 作为优选方案，所述缓冲液为1.5M的Tris-HCl溶液，pH＝8.8。

[0019] 第三方面，本发明还提供了一种如前述的用于电泳分离的交联结构复合凝胶在电泳分离法分离分子量小于30kDa蛋白质、尤其是多肽中的用途。

[0020] 传统丙烯酰胺凝胶制备中反应式如下反应式A：

[0021]

[0022] 本发明丙烯酰胺复合凝胶制备中反应式(以丙烯酸单体和氯化钙交联剂为例)如下反应式B：

[0023]

[0024] 其中，a、b、c、d、e、f、g、h所代表的数值相同或不同，均为大于零或等于零的值，且a、b、c、d、e、f、g、h不同时为零。

[0025] 通过比较可知本发明复合凝胶含有多种交联结构单元，而传统的聚丙烯酰胺凝胶只有一种交联结构单元。

[0026] 本发明丙烯酰胺中加入的丙烯酸或甲基丙烯酸具有双键结构，能够和丙烯酰胺发生聚合反应。钙离子与丙烯酸或甲基丙烯酸上的羧基发生反应，同时丙烯酸或甲基丙烯酸上的羧基和丙烯酰胺的胺基发生反应，由于+2价金属离子和丙烯酸或甲基丙烯酸均充当交联点，可以改善复合凝胶的分辨率和力学性能。

[0027] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

[0028] 1、通过在丙烯酰胺中加入丙烯酸或甲基丙烯酸和氯化钙，可以改善复合凝胶的分辨率和力学性能；

[0029] 2、复合凝胶与传统的凝胶相比，力学性能提高5～10倍(通常在8倍左右)，分辨率提高10～20倍；

[0030] 3、本发明提供的凝胶电泳用复合凝胶的制备方法，该方法简单，原料选择范围大；

[0031] 4、可适用于分子量小于30kDa蛋白质的分离，尤其是多肽的分离。

附图说明

[0032] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

[0033] 图1为本发明复合凝胶与传统的聚丙烯酰胺凝胶的对比效果图；

[0034] 图2为本发明复合凝胶与传统的聚丙烯酰胺凝胶的对比效果图；

[0035] 图3为含有本发明交联结构的复合凝胶与传统凝胶红外谱图。

具体实施方式

[0036] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

[0037] 实施例1

[0038] 本实施例提供的一种用于电泳分离的交联结构复合凝胶的制备方法，具体如下：

[0039] 将0.81g丙烯酰胺与0.02g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺溶解于4.6ml超纯水中，充分搅拌后依次加入0.04g丙烯酸、0.002g氯化钙、2.5ml Tris-HCl(pH8.8)、0.1ml SDS(10％)、0.1mlAPS(10％)、0.006ml TEMED，搅拌均匀并定容至10ml后，灌入制胶架上的玻片模具中，液封，经2小时结束反应，即可获得用于电泳分离的交联结构复合凝胶。

[0040] 实施例2

[0041] 本实施例提供的一种用于电泳分离的交联结构复合凝胶的制备方法，具体如下：

[0042] 将0.8g丙烯酰胺与0.02g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺溶解于4.6ml超纯水中，充分搅拌后依次加入0.04g丙烯酸、0.004g氯化钙、2.5ml Tris-HCl(pH8.8)、0.1ml SDS(10％)、0.1mlAPS(10％)、0.006ml TEMED，搅拌均匀并定容至10ml后，灌入制胶架上的玻片模具中，液封，经3小时结束反应，即可获得用于电泳分离的交联结构复合凝胶。

[0043] 实施例3

[0044] 本实施例提供的一种用于电泳分离的交联结构复合凝胶的制备方法，具体如下：

[0045] 将0.81g丙烯酰胺与0.02g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺溶解于4.6ml超纯水中，充分搅拌后依次加入0.04g甲基丙烯酸、0.002g氯化钙、2.5ml Tris-HCl(pH8.8)、0.1ml SDS(10％)、0.1ml APS(10％)、0.006ml TEMED，搅拌均匀并定容至10ml后，灌入制胶架上的玻片模具中，液封，经4小时结束反应，即可获得用于电泳分离的交联结构复合凝胶。

[0046] 实施例4

[0047] 本实施例提供的一种用于电泳分离的交联结构复合凝胶的制备方法，具体如下：

[0048] 将0.81g丙烯酰胺与0.02g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺溶解于4.6ml超纯水中，充分搅拌后依次加入0.04g甲基丙烯酸、0.004g氯化钙、2.5ml Tris-HCl(pH8.8)、0.1ml SDS(10％)、0.1ml APS(10％)、0.006ml TEMED，搅拌均匀并定容至10ml后，灌入制胶架上的玻片模具中，液封，经5小时结束反应，即可获得用于电泳分离的交联结构复合凝胶。

[0049] 本发明的实施例在下述范围内均可实现技术效果：

[0050] 所述混合水溶液中，丙烯酰胺的质量分数为4～20％、第一交联剂的质量分数为0.1～1％、第二交联剂的质量分数为0.01～2％、单体的质量分数为0.05～3％、变性剂的质量分数为0.5～2％、引发剂的质量分数为0.5～3％、催化剂的体积分数为0.03～0.5％、缓冲液的体积分数为20～50％。

[0051] 实施例5

[0052] 本实施例提供的一种用于电泳分离的交联结构复合凝胶的制备方法，具体如下：

[0053] 将0.81g丙烯酰胺与0.02g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺溶解于4.6ml超纯水中，充分搅拌后依次加入0.04g甲基丙烯酸、0.004g氯化锌、2.5ml Tris-HCl(pH8.8)、0.1ml SDS(10％)、0.1ml APS(10％)、0.006ml TEMED，搅拌均匀并定容至10ml后，灌入制胶架上的玻片模具中，液封，经5小时结束反应，即可获得用于电泳分离的交联结构复合凝胶。

[0054] 对比例1(传统的聚丙烯酰胺凝胶)

[0055] 将0.81g丙烯酰胺与0.02g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺溶解于4.6ml超纯水中，充分搅拌后依次加入2.5ml Tris-HCl(pH8.8)、0.1ml SDS(10％)、0.1mlAPS(10％)、0.006ml TEMED，搅拌均匀并定容至10ml后，灌入制胶架上的玻片模具中，液封，经3小时结束反应，即可获得凝胶电泳用传统的聚丙烯酰胺凝胶。

[0056] 图3为全部组分都加入，其中P(AM-co-AA)为复合凝胶，PAM为传统凝胶，P(AM-AA)为不加氯化钙的复合凝胶，不加氯化钙的目的是为了验证丙烯酸或甲基丙烯酸(因为丙烯酸和甲基丙烯酸为同一类物质，所以以丙烯酸为例进行测试)上的羧基不但和钙离子发生反应，同时丙烯酸或甲基丙烯酸上的羧基和丙烯酰胺的胺基发生反应。1288cm-1位置的峰的变化，结合图上标出的各峰的变化，可以证明该交联点已经形成。注：单个峰值不能说明物质的形成，只有当一个特定的峰值出现，加上整体的峰值的变化，才能证明物质的形成。

[0057] 性能测试

[0058] 本实验依照标准SDS-PAGE电泳的操作规程，对实施例1～4所得复合凝胶进行性能测试，检测结果如下表：

[0059] 表1实施例1～4所得复合凝胶的分离性能检测结果(标准样品)

[0060] 蛋白分子量(kDa) 实施例1 实施例2 实施例3 实施例426.6 √ √ √ √
17 √ √ √ √
14.2 √ √ √ √
6.5 √ √ √ √
3.5 √ √ √ √

[0061] 表2实施例1～4所得复合凝胶的分离性能检测结果(实际样本：唾液)

[0062]蛋白名称(分子量) 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
IGLL5(23.4kDa) √ √ √ √
ZG16B(22.8kDa) √ √ √ √
LCN1(19.4kDa) √ √ √ √
LC1L1(18kDa) √ √ √ √
PIP(16.8kDa) √ √ √ √
IGKC(11.8kDa) √ √ √ √
LAC2(11.5kDa) √ √ √ √

[0063] 为了直观的对比，本发明复合凝胶与传统的聚丙烯酰胺凝胶进行了对比，以下为效果图图1：图1A(对比例1)和图1B(实施例2)均为复合凝胶对标准样品的电泳图，为了证实复合凝胶的力学性能的改善对电泳有较大的帮助，与传统的改善分辨率不同，复合凝胶能够将分子量小于30kDa的蛋白分离开，而传统的方法只能是大概的一个范围的提高，如开始能够分离到100kDa的蛋白质，增加丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的浓度，即使可以分离到30kDa的蛋白质，但是在30kDa以下的蛋白会出现严重的弥散现象。如图1A中分子量小于30kDa的蛋白质是分离不出的，因为标准样品是5个蛋白，反映出来就是5条带。

[0064] 图2为本发明的复合凝胶与传统的聚丙烯酰胺凝胶的对比效果，其中，P(AM-co-AA)为C，PAM为A，P(AM-AA)为B。

[0065] 表3是对图1的一个量化数据

[0066]蛋白分子量 传统凝胶的灰度值 复合凝胶的灰度值 复合凝胶/传统凝胶
26.6kDa - 47.4 -
17kDa - 98.2 -
14.2kDa - 37.5 -
6.5kDa - 94.7 -
3.5kDa - 70.3 -

[0067] 图1A和图1C分别为传统的聚丙烯酰胺凝胶(对比例1)和复合凝胶(实施例2)对标准蛋白marker的电泳图；图1B和图1D分别为传统的聚丙烯酰胺凝胶(对比例1)和复合凝胶(实施例2)对实际样本：唾液的电泳图。

[0068] 图1D中峰a是分子量为26kDa的蛋白质，峰b是分子量为17kDa的蛋白质，峰c是分子量为14kDa的蛋白质(传统的聚丙烯酰胺凝胶没能分离出)。

[0069] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。